Identificación de alteraciones genéticas en oligodendrogliomas mediante amplificación dependiente de ligasa de múltiples sondas (MLPA) (multiple ligation-dependent probe amplification)

Identification of genetic alterations by multiple ligation-dependent probe amplification (MLPA) analysis in oligodendrogliomas

 

 

C. Franco-Hernández; V. Martínez-Glez; M. Torres-Martín; J.M. de Campos**; A. Isla*; J. Vaquero***; C. Casartelli**** y J.A. Rey

Unidad de Investigación y *Departamento de Neurocirugía. hospital Universitario La Paz, Madrid. **Departamento de Neurocirugía. Fundación Jiménez Díaz. Madrid. ***Departamento de Neurocirugía. Hospital Puerta de Hierro. Madrid. ****Laboratorio de Oncogenética. Departamento de Genetica. Facultade de Medicina de Ribeirao Preto. Universidade de Sao Paulo. Ribeirao Preto. Brasil.

Financiado con el proyecto FIS P105/0829

Dirección para correspondencia

 

 

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RESUMEN

La alteración genética más frecuente en oligodendro gliomas es la pérdida conjunta de lp/19q. Este evento ya acontece en etapas primarias del desarrollo de estos tumores. Es de gran valor clínico conocer si dichos tumores poseen esta deleción ya que se ha correlacionado con un mejor pronóstico de los pacientes. Además de esta alteración. también se ha observado la deleción de CDKN2A y PTEN y la amplificación de EGFR; estos cambios parecen asociarse a una mayor agresividad tumoral. Mediante la técnica de MLPA en una misma reacción podemos determinar si existe pérdida de lp/19q y deleciones/amplificaciones de los genes anteriormente mencionados en el ADN procedente de muestras tumorales. En este trabajo hemos analizado 40 oligodendrogliomas y el kit MLPA P088 para determinar el estado alélico de lp/19q, así como el kit MLPA P105 para observar la amplificación/ deleción de los genes CDKN2A, PTEN, ERBB2, TP53 y EGFR. Mostraron pérdida de 1p el 45% de los tumores (18/40) y el 65% (26/40) de los oligodendrogliomas presentaron deleción de las sondas que hibridan en las regiones de 19q. Para el kit MLPA P105, mostraron duplicación/deleción de EGFR en el 7,5% (3/41) y 35% (14/40) de las muestras, respectivamente. El 60% de los casos (24/40) mostraron deleción de CDKN2 y ninguna muestra presentó duplicación de las sondas para este gen. El gen ERBB2 se presentó duplicado en el 12,5% de los tumores (5/40) y un único tumor mostró pérdidas de dicho gen. El 30% (12/40) de las muestras presentó deleción para PTEN y el 12,5% (5/40) mostró duplicación de dicho gen y, por último, 12,5% de los casos (5/40) presentaron duplicaciones de TP53. Estos resultados indican que la técnica de MLPA es idónea para la identificación de las alteraciones moleculares características de oligodendrogliomas. Estas alteraciones estarían contribuyendo a la formación del tumor, siendo la anomalía más significativa en oligodendrogliomas la pérdida de 1p/19q.

Palabras clave: Oligodendrogliomas. Deleción lp/19q. MLPA. EGFR. CDKN2A. PTEN.

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SUMMARY

Concurrent deletion at 1p/19q is a common signature of oligodendrogliomas, and it may be identified in low-grade tumours (grade II) suggesting it represents an early event in the development of these brain neoplasms. Additional non-random changes primarily involve CDKN2A, PTEN and EGFR. Identification of all of these genetic changes has become an additional parameter in the evaluation of the clinical patients' prognosis, including good response to conventional che motherapy. Multiple ligation-dependent probe amplification (MLPA) analysis is a new methodology that allows an easy identification of the oligodendrogliomas' abnormalities in a single step. No need of the respective constitutional DNA from each patient is another advantage of this method. We used MLPA kits P088 and P105 to determine the molecular characteristics of a series of 40 oligodendrogliomas. Deletions at l p and 19q were identified in 45% and 65% of cases, respectively. Alterations of EGFR, CDKN2A, ERBB2, PTEN and TP53 were also identified in variable frequencies among 7% to 35% of tumours. These findings demonstrate that MLPA is a reliable technique to the detection of molecular genetic changes in oligodendrogliomas.

Key words: Oligodendrogliomas. 1p/l9q deletion. MLPA. EGFR. CDKN2A. PTEN.

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Introducción

Los oligodendrogliomas representan aproximadamente el 4-7% de todos los gliomas intracraneales primarios y acontecen más frecuentemente en pacientes entre la 4 y 5 década de vida. Estos tumores pueden manifestarse con todo el componente tumoral oligodendroglial o bien de forma mixta, con componente astrocítico. Son conside rados oligodendrogliomas puros cuando el componente oligodendroglial es mayor del 90%¹². Según la OMS los oligodendrogliomas se clasifican en: oligodendrogliomas de grado II y oligodendroglioma anaplásico (grado III). este último es mucho más agresivo y se comporta como un glioma maligno. Cuando existe componente astrocítico el tumor se clasifica en oligoastrocitoma de grado II o en oligoastrocitoma anaplásico (grado III)¹².

La alteración molecular más frecuente observada en los oligodendrogliomas es la pérdida conjunta de lp/19q^8,25. Esta alteración se produce como consecuencia de una translocación no recíproca, que origina un cromosoma derivado con regiones lp/19q y otro cromosoma con las regiones lq/19p^19,21. Por mecanismos que todavía se desconocen, el cromosoma derivado con las regiones lp/19q se pierde en la siguiente división celular. La consecuencia de la translocación es una deleción lp y 19q; esta alteración se puede identificar con las correspondientes técnicas de biología molecular utilizadas en la actualidad.

Se postula que en estas regiones delecionadas existen genes supresores de tumores (GST) y/o genes de reparación de ADN, cuya inactivación sería crucial para la génesis de los tumores oligodendrogliales. En las formas de grado II de malignidad ya está presente esta deleción, indicando que se trata de cambios que acontecen en etapas tempranas en el desarrollo oligodendroglial.

Las pérdidas alélicas de lp se observan entre el 70-85% de los oligodendrogliomas y entre el 20 y 30% en los astrocitomas. Parece ser que existen 3 regiones críticas en lp: 1p32, 1p35.35 y lp36.22-p36-31^6,7,10. Uno de los alelos de los genes diana localizado en estas regiones estaría delecionado y el otro estaría sujeto a otras alteraciones moleculares como mutación y/o metilación que contribuirían a su completa inactivación.

La metilación del ADN es un proceso epigenético que participa en la regulación de la expresión génica a través de dos vías: directamente al impedir la unión de factores de transcripción, e indirectamente propiciando la estructura "cerrada" de la cromatina. Es un mecanismo que impide la transcripción del gen que se encuentre hipermetilado. Esto provoca que genes involucrados en el mantenimiento y división celular no se puedan transcribir contribuyendo así a la formación del proceso neoplásico. En oligodendrogliomas se ha descrito la metilación de ciertos genes como mecanismo de inactivación génica dando lugar a la génesis del desarrollo neoplásico.

En 1p36.3 cabe destacar TP73, un gen que presenta alta homología con TP53, y cuyo promotor se encuentra hipermetilado en el 24%-39% de los oligodendrogliomas^2,9 . Este hallazgo corrobora la ausencia de mutaciones inactivantes del gen en estos tumores³. Otro de los genes con carácter GST es hRAD54, localizado en 1p32. Este gen pertenece a una familia que codifican proteínas de unión al ADN, implicadas en el plegamiento correcto de dicha molécula; no se han encontrado mutaciones inactivantes de este gen⁶. CITED4 y CAMTA1 localizados en 1p34.2 y 1p36 respectivamente. se encuentran en las zonas de lp donde se produce la pérdida de material genético, por lo que estos genes podrían estar funcionando como GST donde su pérdida contribuiría al desarrollo tumoral. La implicación en el desarrollo de oligodendrogliomas de CITED4 podría ser también, al igual que TP73 por la hipermetilación de su promotor^2,8. Por contra, no hay ningún trabajo en la literatura que relacione una hipermetilación del promotor de CAMTA1 con el desarrollo tumoral, pero sí que existe una disminución de expresión de este gen en los tumores oligodendrogliales⁵.

La región crítica en el cromosoma 19 se restringe a 19q13.2-13.4, aquí se localizan varios genes entre los que cabe destacar: genes codificadores de enzimas de reparación de ADN, como son ERCC1, ERCC2 y XRCCl, si bien no existen suficientes evidencias de su implicación específica como genes supresores de tumores. EMP3 (proteína epitelial de membrana) está localizado en 19q13.3, que se sobre-expresa cuando queda retenido 19q13 y está implicado como GST en neuroblastomas y algunos tipos de glioma²³.

Otra de las alteraciones observadas en oligodendrogliomas es la amplificación de oncogenes. Este tipo de cambios se ha asociado a mayores grados de malignidad tumoral. Algunos de los oncogenes implicados en la formación de los oligodendrogliomas son: EGFR, CDK4 (ciclina dependiente de la quinasa 4), MDM2 (proteína de unión a p53), GAC1(cromosoma 1 amplificado en gliomas). Alonso y cols. observaron amplificación y copias extra de los genes CDK4, MDM2 y GACl en oligodendrogliomas de bajo grado, sugiriendo que algunos tumores de bajo grado podrían presentar un comportamiento más agresivo¹. La amplificación de EGFR está asociada con los glioblastomas primarios, pero también se ha sugerido la posible implicación de este gen en los tumores con componente oligodendroglial^13,24.

Cuando el oligodendroglioma posee una mayor agresividad se ha observado que existen deleciones parciales o totales de las zonas 9p y 10q, regiones donde se localizan CDKN2A (en 9p21) y PTEN en (10q23.3)^16,29. Estos genes actúan como GST y están implicados en el desarrollo neoplásico. Son escasas las mutaciones que se han observado en este tipo de genes, pero sí se ha descrito hipermetilación a nivel del promotor, preferentemente en astrocitomas³¹. Uno de los alelos de estos genes estaría inactivado mediante la pérdida de esta región y el otro estaría sometido a cambios epigenéticos; de esta forma se perdería su funcionalidad. Otro de los genes potencialmente implicado en la formación de oligodendrogliomas es MGMT. Este gen se localiza en 10q23, y su promotor se encuentra frecuentemente hipermetilado en tumores oligodendrogliales ² . Esta alteración está asociada a una mejor respuesta al tratamiento con agentes alquilantes preferentemente en glioblastomas, pero existen datos que indican una mejor respuesta al tratamiento también en oligodendrogliomas cuando existe hipermetilación del promotor de dicho gen^11,15. Recientemente, el estado de metilación del promotor de MGMT ha sido aceptado como factor imprescindible para determinar el pronóstico de pacientes con glioblastoma¹⁷. Una amplia revisión de los aspectos clínicos, quirúrgicos, histológicos, moleculares, etc., de oligodendrogliomas ha sido descrita recientemente²⁰.

Por tanto, existen diversas alteraciones genéticas y epigenéticas que podrían correlacionarse con agresividad/ respuesta a la terapia. La identificación precisa de dichas variables se ha convertido en un aspecto crucial en el manejo de los pacientes con oligodendrogliomas.

En la actualidad existen técnicas de biología molecular que en menos de 24 horas permiten identificar si existe o no deleción de lp/19q; además estas técnicas también permiten visualizar la existencia de amplificación de oncogenes en este tipo de tumores¹⁴. Las técnicas utilizadas hasta ahora eran LOH, FISH, para determinar el estado alélico de las regiones de lp/19q, pero en la actualidad una nueva técnica denominada MLPA del inglés (multiple ligase probe amplification), permite que en una misma reacción se puedan identificar la pérdida o la ganancia de las zonas de interés. La técnica de MLPA se basa en una primera reacción de unión-ligación de las sondas con la zona homóloga; sólo las sondas que hayan hibridado podrán ser ligadas, y una posterior amplificación si dichas sondas han hibridado, permitiéndonos detectar grandes amplificaciones y deleciones. Con el MLPA kit P088 fueron analizados 40 oligodendrogliomas para comprobar la deleción de lp/19q. Para la identificación de deleciones y/o duplicaciones de EGFR, CDKN2A, TP53, PTEN y ERBB2 se utilizó el MLPA kit P105. La combinación de ambos (MLPA kit p088 y MLPA kit p105) aumenta más la identificación precisa de las alteraciones moleculares con repercusión en el comportamiento clínico del oligodendroglioma.

 

Material y métodos

Se utilizaron 40 muestras de oligodendrogliomas congeladas en nitrógeno líquido y 5 controles procedentes de ADN de sangre periférica de individuos sanos. El diagnóstico de los tumores se realizó histológicamente de acuerdo con la clasificación de la O.M.S.: 6 oligoastrocitomas (grado II-III), 13 oligodendrogliomas anaplásicos (grado III) y 21 oligodendrogliomas (grado II). Se purificó el ADN de las muestras tumorales utilizando el kit de Wizard Genomic DNA purification kit (Promega). Para el análisis por MLPA se utilizaron 100 ng de ADN de la muestra tumoral y de la muestra control. La desnaturalización del ADN y la hibridación posterior de las sondas es seguida por una reacción de ligación y una posterior amplificación por PCR.

Para el análisis de las regiones lp y 19q se utilizó el kit P088 MRC-Holland (Ámsterdam N.L.). Este kit MLPA P088 contiene 15 sondas que hibridan en regiones de 1p, ocho sondas que hibridan en regiones de 19q y 20 sondas como controles internos específicas de otras regiones cromosómicas. También se utilizó el kit MLPA P105 MRC-Holland (Ámsterdam N.L.) que contiene dos sondas que hibridan en el gen ERBB2, nueve sondas que se unen en la región que codifica a PTEN, cinco sondas flanquean CDKN2A, ocho a TP53, tres a EGFR y 15 sondas que son controles internos que hibridan en otras regiones del genoma.

Tras una primera desnaturalización de la muestra durante 5 min. a 95ºC se añaden las sondas y se dejan durante 16 horas a 60ºC. Posteriormente se añade una ligasa termoestable con sus respectivos tampones durante 15 a 54ºC y un calentamiento posterior a 98ºC durante 5 min. Aquellas sondas que hayan hibridado, la ligasa las unirá. Por el contrario, si existe deleción, las sondas no hibridarán, no produciéndose la posterior ligación. Tras la ligación se añade una polimerasa para amplificar el producto y así poder detectarlo. Las condiciones de amplificación son: 35 ciclos durante 30 sec. a 95ºC, 30 sec. a 60ºC y 60 sec. a 72ºC. Para finalizar se efectúa una incubación durante 20 min. a 72ºC y un enfriamiento a 4ºC.

Posteriormente a la amplificación 1 µl del producto es analizado utilizando el secuenciador ABI 3.100 Avant (Applied Biosystem). El análisis de los datos se realizó con el programa MRC Coffalyser versión 2.0. Se realizó una intranormalización con las sondas control para cada muestra; posteriormente cada muestra tumoral se normaliza con las 5 muestras control. La disminución progresiva de señal de las sondas control de cada muestra en el secuenciador automático se corrigió por regresión simple. Los límites relativos normales se establecieron entre 0.75 y 1.30. Las sondas que mostraban un valor por debajo de 0,75 se consideraron que existía una deleción y las sondas por encima de 1.30 una duplicación. Para el análisis estadístico de los MLPA se utilizó el programa Coffalyser versión 2.0.

 

Resultados

Los resultados obtenidos con el kit MLPA P088, específico para las regiones 1p/l 9q fueron los siguientes: mostraron pérdida de lp el 45 % de los tumores (18/40) y en el 65% (26/40) de las muestras se observaron pérdidas de sondas que hibridaban con la región 19q. Todos los casos que presentaron pérdida de 1p mostraron conjuntamente pérdida de 19q. La figura 1 representa un electroferograma que muestra las sondas que hibridan con las regiones lp y 19q. La interpretación de la figura es la siguiente: cuando la altura de la sonda de la muestra tumoral es la mitad que la de la muestra control se ha producido una pérdida de la región donde hibrida la sonda. Si no existe pico de la altura, la deleción abarca a ambos alelos (deleción en homozigosis) por el contrario si el tamaño del área de la sonda de la muestra tumoral es el mismo que la muestra normal, no existe pérdida de la región.

Figura 1. Electroferograma indicando el estado alélico de las regiones de lp y 19q de una muestra normal
y un oligodendroglioma de grado II. Las flechas nos indican pérdida de material genético en esa region.

 

Para el kit MLPA P105, que contiene sondas que hibridan en EGFR, CDKN2A, ERBB2, TP53 y PTEN, los resultados obtenidos fueron los siguientes: mostraron duplicación de EGFR el 7,5% (3/41) de las muestras y el 35% (14/40) presentaron deleción de dicho gen. El 60% de los casos (24/40) mostraron deleción de CDKN2A y ninguna muestra presentó duplicación de las sondas para este gen. El 12,5% de los tumores (5/40) mostraron duplicación de ERBB2 y el 2,5% (1/40) presentó deleción. Para el gen TP53 el 12.5% (5/40) presentaron duplicación y ninguna muestra presentó deleción para este gen. Por último los resultados obtenidos con las sondas que hibridan en PTEN fueron: 30% (12/40) de las muestras presentó deleción y el 12,5% (5/40) mostró duplicación de dicho gen.

La figura 2 muestra las deleciones y duplicaciones de los genes analizados con el kit MLPA P105.

Figura 2. Deleciones (A) y duplicaciones (B) detectadas con la técnica MLPA
utilizando las SALSAS P088 y P105 en una serie de 40 oligodendrogliomas

 

Discusión

La alteración molecular más frecuente que se observa en los oligodendrogliomas es la pérdida de 1p/19q, que ya se muestra en tipos tumorales de grado II. por lo que sería una alteración temprana en la génesis del tumor. Nuestros datos vienen a confirmar ambos hechos, ya que hemos identificado la pérdida de estas regiones mostrando un 45% (1p) y un 65% (19q) en la serie de tumores analizada. Todas las muestras que tenían pérdida de lp también contenían deleción de 19q, lo que viene a corroborar que normalmente estas dos alteraciones se presentan en forma conjunta.

Se observó que 3 de las 40 muestras presentaban amplificación de EGFR. Este oncogen se localiza en 7p12 y su amplificación se ha descrito en varios tipos de cáncer asociándose a una mayor agresividad tumoral¹⁸ . Nuestros resultados mostraron que la amplificación estaba presente en un oligodendroglioma de grado II, un oligodendroglioma de grado III, y un oligoastrocitoma. Probablemente este tipo de tumores menos agresivos que presentan amplificación de EGFR puedan evolucionar hacia un mayor grado de malignidad. o demostrar una mayor agresividad biológica.

En un estudio previo, mediante la técnica de PCR a tiempo real pusimos de manifiesto amplificaciones y ganancias de dosis génica de EGFR en oligodendrogliomas¹³ , en cambio el MLPA, sólo fue capaz de detectar la amplificación de EGFR en aquellas muestras que presentaban un elevado número de dosis génica equivalente a más de 100 copias del gen mediante PCR a tiempo real. coincidiendo con las 3 muestras donde encontramos amplificación mediante MLPA¹³. Podemos concluir que la PCR a tiempo real es una técnica mucho más sensible que los MLPA para detectar ganancia de dosis, aunque mucho más ardua. Por lo tanto la técnica de MLPA quedaría restringida a la identificación de grandes deleciones y duplicaciones/ amplificaciones. Dado que la inestabilidad cromosómica es una característica propia de los tumores, se suele producir en muchos de ellos pérdidas o ganancias de los diferentes cromosomas y una de las formas de rápida detección de estas alteraciones sería la metodología de MLPA.

En otros tipos de tumores gliales (astrocitomas), se ha observado pérdida de alelos del cromosoma 7, lugar donde se localiza EGFR³. En nuestra serie se ha observado que el 35% de los oligodendrogliomas también presentaban pérdidas de EGFR; ello pone de manifiesto que podría existir, en base a los resultados obtenidos, pérdida alélicas del cromosoma 7 en estos tumores. Con frecuencia estas pérdidas alélicas no se corresponden necesariamente con la amplificación truncada de EGFR, de acuerdo a lo descrito en gliomas astrocíticos⁴.

En oligodendrogliomas de alto grado se ha descrito que puede existir pérdida de 9p21, región donde se localiza CDKN2A¹⁶. Este gen codifica a dos proteínas supresoras tumorales como son p16^ink4a y p14^ARF. Dado el papel clave que desempeña CDKN2A en el control del ciclo celular, la pérdida de función de dicho gen podría desempeñar un factor clave en el desarrollo de oligodendrogliomas. Aunque no se han descrito mutaciones de CDKN2A, en estos tumores parece ser que la deleción junto a la metilación aberrante de su promotor son los mecanismos que conllevan a la inactivación total de este gen supresor de tumores³⁰. En nuestra serie tumoral se observa que el 60% de muestras presentaban pérdida del gen. La deleción de este gen con carácter oncosupresor podría estar contribuyendo al desarrollo del oligodendroglioma así como a un aumento de la malignidad o agresividad tumoral¹⁶.

La amplificación del oncogen ERBB2 esta asociada con el desarrollo de muchos tipos de neoplasias, como puede ser mama, hígado... etc¹⁸ . Este gen codifica una proteínkinasa implicada en la división celular. Cuando el gen se encuentra amplificado existen niveles anormales de proteína y la célula comienza a dividirse descontroladamente. Nuestra serie mostró que el 12.5% de los tumores presentaron duplicación de este gen, y sólo un oligoastrocitoma mostró pérdida. Es posible que la amplificación de este oncogen también pueda influir en el desarrollo de los oligodendrogliomas adquiriendo el tumor un mayor grado de malignidad como se ha descrito en otros tipos de tumores, aunque la sobredosis de ERBB2 en gliomas suele ser escasa¹⁸.

Mutaciones en TP53 están asociadas con muchos tipos tumorales, incluyendo astrocitomas²⁴. La función de este gen es llevar a la célula a apoptosis cuando posee daños en el material genético. Si el gen no es funcionante la célula comienza a acumular mutaciones y a descontrolarse pudiendo originar un tumor. Cuando se analizó este gen mediante MLPA, el 12,5% de los tumores presentaban copias extra de TP53. Las poliploidias son frecuentes en estos tipos tumorales y es posible que la técnica esté detectando una poliploidía de la región 17q13.1, donde se localiza este gen²⁶.

El 30 % de las muestras analizadas presentaron deleción en PTEN, localizado en 10q 23. La pérdida del cromosoma 10 en gliomas está relacionada con un mayor aumento de malignidad²⁷, y parece estar asociada a la progresión desde astrocitoma anaplásico hasta glioblastoma secundario. Nuestros resultados muestran deleciones de PTEN en todos los grados tumorales que hemos analizado, por lo que es posible que aquellos tumores de grado II que presenten deleciones en PTEN vayan a recidivar o a aumentar su grado de malignidad. La pérdida de funcionalidad de PTEN en gliomas no esta asociada a mutaciones, sino a la metilación aberrante del promotor y/o deleciones de esa región o de todo el cromosoma²⁴.

Teniendo en cuenta que la pérdida de 1p/19q en oligodendrogliomas está asociada con una mejor respuesta a la quimioterapia y un mayor índice de supervivencia, sería de gran ayuda que en el momento de la obtención del tumor se procediera a determinar si dicho tumor presenta pérdidas de estas regiones para observar la evolución del paciente. La técnica de MLPA, es una metodología muy sencilla y en escasas horas se puede obtener la información a nivel molecular de las alteraciones con capacidad predictiva del comportamiento del oligodendroglioma.

Las técnicas actuales de biología molecular cada vez son más sensibles y precisas, esto supone que en un futuro los laboratorios las apliquen de continuo para determinar la evolución y el comportamiento genético del tumor, como complemento de las técnicas que actualmente se utilizan.

La finalidad de este trabajo ha sido, por tanto, la introducción de una nueva técnica, MLPA, para determinar un perfil genético del tumor. La ventaja de esta técnica con respecto a las que actualmente se utilizan (LOH, FISH) para detectar este tipo de alteraciones son: rapidez, la prescindibilidad de ADN constitucional y la capacidad de detección de alteraciones moleculares cuando solo existe el 50% de las células que poseen aberraciones genéticas²².

En un futuro se espera que se establezca un perfil tumoral genético personalizado para cada paciente. De esa forma se puede emplear el fármaco más adecuado dependiendo de las alteraciones moleculares que aparecen en ese tumor, realizando un tratamiento quimioterápico mucho más dirigido y especializado en función de las aberraciones genéticas que posea dicho tumor.

 

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Dirección para correspondencia:
Juan A. Rey.
Unidad de Investigación.
Hospital Universitario La Paz.
Paseo Castellana 261.28046 Madrid.
Electrónica: jarey.hulp@salud.madrid.org

Recibido: 12-09-08.
Aceptado: 12-10-08

Abreviaturas. ADN: ácido desoxirribonucleico. GAC1: repeticiones ricas en leucina del componente neuronal 2. CAMTA1: activador de la trascripción de la calmodulina. CDK4: quinasa 4 dependiente de ciclina. CDKN2A: Inhibidor de la kinasa 2A dependiente de ciclina. CITED4: proteína de unión e interacción a CREB/p300. EGFR: receptor del factor del crecimiento epidérmico. EMP3: proteína epitelial de membrana 3. ERBB2: oncogen 2 homólogo del virus de la leucemia eritroblástica. ERCC1: la proteína de reparación por escisión del grupo de complementación cruzada 1. ERCC2: la proteína de reparación por escisión del grupo de complementación cruzada 2. FISH: hibridación con fluorescencia in situ. GST: gen supresor de tumores. hRAD54: homólogo al gen reparador de ADN de S cereivisiaeRAD54. LOH: pérdida de heterozigosidad. MDM2: proteína de unión a p53. MGMT: 0-6 metilguanina ADN metiltrasferasa. MLPA: amplificación múltiple de sondas dependiente de ligasa. OMS: Organización Mundial de la Salud. PTEN: homólogo de la fosfatasa y tensina. p14^arf: inhibidor de la kinasa 2B dependiente de ciclina. p16^ink4a: inhibidor de la kinasa 2A dependiente de ciclina. TP53: proteína tumoral p53. TP73: proteína tumoral p73. XRCC1 : enzima de reparación XRCC1.