ARTÍCULO ORIGINAL

---

EXPRESIÓN DE LOS GENES DE MUCINAS MUC13, MUC15,
MUC16 Y MUC17 EN EL EPITELIO CONJUNTIVAL NORMAL
HUMANO IN VIVO

NORMAL HUMAN CONJUNCTIVAL EPITHELIUM EXPRESSES
MUC13, MUC15, MUC16 AND MUC17 MUCIN GENES

CORRALES RM¹, GALARRETA DJ², HERRERAS JM³, CALONGE M³, CHAVES FJ⁴

RESUMEN Objetivo: La superficie ocular expresa al menos cinco de los 17 genes de mucinas descritos hasta ahora. El presente estudio fue diseñado para determinar el perfil de expresión de los genes de mucinas en muestras obtenidas mediante citología por impresión conjuntival (CIC) de sujetos sanos. Métodos: Se aplicaron dos filtros de polietersulfona en la conjuntiva superior de ambos ojos de 8 voluntarios sanos. Posteriormente, se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el ARN total extraído y retrotranscrito de las muestras de CIC, para posteriormente estudiar la expresión de todos los genes humanos de mucinas conocidos. Después de la amplificación, los productos de la PCR fueron sometidos a electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% y teñidos con bromuro de etidio para confirmar la obtención de una única banda cuando los ADNc son amplificados con los adecuados oligonucleótidos. Resultados: Se detectaron los transcritos de los genes de mucinas conjuntivales publicados anteriormente MUC1, MUC2, MUC4, MUC5AC y MUC7 en todas las muestras. Además, también se detectaron los transcritos de los genes de mucinas MUC13, MUC15, MUC16 y MUC17. Los productos amplificados mediante PCR convencional mostraron el tamaño de amplificación esperado. No se detectaron transcritos de los genes de mucinas MUC3A, MUC3B, MUC5B, MUC6, MUC8, MUC11 y MUC12. Conclusión: Por primera vez, se ha demostrado la expresión de cuatro ARNm de mucinas (MUC13, MUC15, MUC16 y MUC17) en el epitelio conjuntival humano de voluntarios sanos, hecho aún inédito. La función de estos genes habrá de ser estudiada posteriormente. Palabras claves: Mucinas, conjuntiva humana, superficie ocular, película lagrimal, PCR.

SUMMARY Purpose: The ocular surface epithelia express at least five mucin genes of the total of 17 human mucin genes that have been identified so far. This study was designed to determine the expression profile of mucin genes in conjunctival impression cytology (CIC) samples from healthy subjects. Methods: Two polyethersulfone filters were applied to the superior conjunctiva of both eyes from eight healthy donors. Polymerase chain reaction (PCR) was performed using isolated and retrotranscripted total RNA obtained from the CIC samples to study the expression of all known human mucin genes. Following amplification, PCR products were electrophoresed on 1.5% agarose gel and stained with ethidium bromide to confirm that only a single band was obtained when amplifying all cDNAs with the convenient primers. Results: Transcripts of the previously reported conjunctival mucin genes MUC1, MUC2, MUC4, MUC5AC, and MUC7 were detected in all samples. In addition, transcripts of MUC13, MUC15, MUC16 and MUC17 mucin genes also were detected. Amplified products by conventional PCR showed the expected amplicon size. Transcripts of MUC3A, MUC3B, MUC5B, MUC6, MUC8, MUC11, and MUC12 mucin genes were not detected. Conclusion: The expression of four additional mucin mRNA (MUC13, MUC15, MUC16, and MUC17) has been proved in human conjunctival epithelium from healthy donors for the first time. The function of these genes remains to be further elucidated (Arch Soc Esp Oftalmol 2003; 78: 375-382). Key words: Mucin expression, human conjunctiva, ocular surface, tear film, PCR.

---

Recibido:14/3/03. Aceptado: 19/6/03.
Instituto Universitario de Oftalmobiología Aplicada (IOBA). Universidad de Valladolid. Valladolid. España. 
¹ Doctor en Bioquímica y Biología Molecular. 
² Licenciado en Medicina. 
³ Doctor en Medicina. 
⁴ Doctor en Biología. 
Proyecto subvencionado por el Fondo de Investigación Sanitaria. 

Correspondencia: 
RM Corrales Herrán
Instituto Universitario de Oftalmobiología Aplicada (IOBA)
Facultad de Medicina, 3.ª planta
C/. Ramón y Cajal, 7
47005 Valladolid
España
E-mail: corrales@ioba.med.uva.es  

---

INTRODUCCIÓN

La superficie ocular está cubierta por un fluido de estructura compleja denominado película lagrimal que forma una interfase entre el aire y los tejidos oculares (1). En la actualidad, hay evidencias de que estos componentes se distribuyen en dos capas, siendo la superior la capa lipídica y la inferior un gel hidro-mucínico, en el que existe un gradiente de concentración de mucinas desde el epitelio a la superficie (2). Las mucinas epiteliales son un grupo heterogéneo de proteínas de elevado peso molecular (>200 kD), componentes de todas las secreciones mucosas presentes en los epitelios. Están altamente glucosiladas, y así un elevado porcentaje de su peso molecular (más del 50%) lo constituyen azúcares, hecho que dificulta su estudio bioquímico (3). El mayor avance en el conocimiento de la estructura, función y carácter heterogéneo de las mucinas humanas surge a partir de la reciente secuenciación completa o parcial de los genes que las producen. Hasta ahora se conocen 17 genes de mucinas humanas, que se han enumerado como MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC9, MUC11, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16 y MUC17 (4-22). Funcionalmente, las mucinas se dividen en transmembrana (MUC1, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16 y MUC17) y de secreción, y estas últimas se clasifican a su vez en formadoras de gel (MUC2, MUC5AC, MUC5B y MUC6) y solubles (MUC7 y MUC9). La MUC8 y la MUC11 todavía no están lo suficientemente caracterizadas como para poder ser encuadradas dentro de uno de los grupos citados. No hay acuerdo en el número de genes de mucinas expresados en la conjuntiva humana, ya que unos autores han demostrado la expresión de 3 (MUC1, MUC4 y MUC5AC) (15-19), otros de 4 (MUC1, MUC2, MUC4 y MUC5AC) (20) (Corrales et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001; 42: S484. Abstract 2613) y otros llegan a 5 (21) (MUC1, MUC2, MUC4, MUC5AC y MUC7) (Corrales et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2002. Abstract 2464). La expresión de MUC2 se mantiene en controversia, porque si bien se ha detectado dicho gen mediante RT-PCR (Corrales et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001;42:S484. Abstract 2613. Corrales et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2002. Abstract 2464), no se ha podido ratificar mediante hibridación in situ ni por Northern blot (16). Por tanto, este estudio fue diseñado para averiguar cuáles eran los genes que se expresan en la conjuntiva humana de voluntarios sanos. Las muestras se obtuvieron mediante una citología por impresión conjuntival (CIC), técnica no invasiva y apropiada para el estudio de la expresión de los genes conjuntivales, como ya se ha demostrado anteriormente (Corrales et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001; 42: S484. Abstract 2613), y analizándolas por PCR.

MATERIAL Y MÉTODOS

Obtención de las muestras mediante citología por impresión conjuntival (CIC)

Todas las muestras humanas usadas en este estudio se tomaron después de obtener el consentimiento informado de los sujetos y siguiendo los Principios de la Declaración de Helsinki. Previa anestesia tópica de la conjuntiva con una mezcla de tetracaína 0,5% y nafazolina 0,05% (Colircusí Anestésico‚ 0,50%, Alcón Cusí, Barcelona, España), se aplicaron las dos mitades de un filtro de polietersulfona (tamaño de poro: 0,2 mm; diámetro: 13 mm) (Gelman Laboratory, Supor® 200, Ann Arbor, MI, EEUU) en la conjuntiva bulbar superior de 8 individuos sanos (6 mujeres y 2 hombres, cuyo rango de edad era 18-29) y se introdujeron en tampón de lisis RLT (Rneasy Mini Kit, Qiagen, Hilden, Alemania).

Aislamiento del ARN total

Se utilizó el método de extracción comercial Rneasy Mini Kit (Qiagen) siguiendo las indicaciones del fabricante (21). El ARN extraído se trató con 0,5 ml de ADNasa (10 U/µl) (Invitrogen Life Technologies) a 37ºC durante 45 minutos y a 85ºC durante 15 minutos.

Síntesis del ADN complementario y reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Se añadieron 2 ml de «random hexamer» (50 ng/µl) (Invitrogen Life Technologies) a 33 µl (2-5 µg) de ARN total, y se calentó durante 10 minutos a 75ºC. Después se mantuvo, durante 1 minuto en hielo, y se añadieron 33 µl al tubo del kit de síntesis de ADNc (Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads, Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg, Alemania), que contenía el enzima de retrotranscripción M-MuLV, calentándolo a 25ºC durante 10 minutos y a 37ºC durante 60 minutos. A continuación, se llevó a cabo la PCR con oligonucleótidos específicos para cada gen de mucina y para el de la gliceroaldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) humana (gen usado como control de la amplificación), cuyas secuencias fueron obtenidas con un software para el diseño de primers o cebadores disponible en http://www.genome.wi. mit.edu/cgi-bin/primer/primer3www.cgi/ a partir del número de acceso del Genbank de las secuencias de cada ADN de cadena simple; esta base de datos es de dominio público y está disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ (tabla I). Para un volumen de reacción de 25 µl de reacción se hizo la siguiente mezcla de componentes: 12,5 µl de tampón conteniendo cada dNTP a 0,4 mM y MgSO₄ a 50 mM, 1 µl de cada oligonucleótido a 10 mM, 1 µl del enzima Taq polimerasa (Invitrogen Life Technologies), 1 µl de ADNc y el resto de agua. La amplificación se llevó a cabo de acuerdo a las siguientes etapas: 94ºC durante 3 minutos, seguido de 40 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 62ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos; por último se calentó a 72ºC durante 5 minutos. Como control positivo se usó una mezcla de ADN de cadena simple de riñón, tráquea, pulmón, cerebro, colon, ovarios, próstata e intestino y como control negativo se usó agua. Para ver los resultados, se llevó a cabo la electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% con bromuro de etidio, se observó el gel en un transiluminador de rayos UVA (Spectroline, TDI) y se fotografió con una cámara Polaroid. Se confirmó la secuencia de los productos de la amplificación mediante secuenciación de los mismos y posterior comparación con las secuencias del Genbank mediante el programa de dominio público BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool), BLAST, disponible en http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST

 

RESULTADOS

Se confirmó la expresión de los genes de mucinas MUC1, MUC2, MUC4, MUC5AC, MUC7 (fig. 1).

Fig. 1. Identificación de los fragmentos amplificados mediante PCR en dos muestras representativas de citología
por impresión conjuntival de un individuo sano. Después de la amplificación, se llevó a cabo la electroforesis en
geles de agarosa, y los resultados fueron fotografiados con una cámara Polaroid. El tamaño de los transcritos fue
el mismo que el de los usados como controles. A) GAPDH, 250 pb; B) MUC1, 656 pb; C) MUC2, 457 pb; D) MUC4,
200 pb;  E) MUC5AC, 350 pb;  F) MUC7, 199 pb;  G) MUC13, 214 pb;  H) MUC15, 181 pb;  I) MUC16, 229 pb;
J) MUC17, 217 pb. Línea M, marcador de ADN; kínea 1, producto de la PCR de la muestra del ojo derecho de un
individuo; línea 2, producto de la PCR de la muestra del ojo izquierdo del mismo individuo línea 3, producto de
la PCR del ARN usado como control positivo; línea 4, producto de la PCR del agua (control negativo). La flecha
indica 500 pb.

 

Además, por primera vez, se detectó la expresión de los más recientes genes MUC13, MUC15, MUC16 y MUC17 en las 16 muestras de CIC de los 8 voluntarios sanos (fig. 1).

Los productos de amplificación obtenidos de las muestras en estudio mostraban una única banda y tenían el mismo tamaño en pares de bases (pb) que la mezcla de DNA usada como control positivo. Los del gen de la GAPDH tenían 250 pb, los de MUC1 656 pb, los de MUC2 457 pb, los de MUC4 200 pb, los de MUC5AC 350 pb, los de MUC7 199 pb, los de MUC13 214 pb, los de MUC15 181, pb, los de MUC16 229 pb y los de MUC17 217 pb (tabla I). La secuenciación del producto de amplificación y posterior comparación con el GenBank dio como único resultado el gen de interés. Por otro lado, no se obtuvo amplificación en las muestras de los siguientes genes, aunque sí se obtuvo amplificación en el control positivo: MUC3A, MUC3B, MUC5B, MUC6, MUC8, MUC11 y MUC12 (datos no mostrados).

DISCUSIÓN

En este trabajo se ha estudiado la expresión en epitelio conjuntival humano de los 17 genes de mucinas humanas conocidos hasta ahora, que se enumeran como MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC9, MUC11, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16 y MUC17 (4-14).

Como se ha mencionado previamente, no hay acuerdo en el número de genes de mucinas expresados en la conjuntiva humana, ya que unos autores han demostrado la expresión de 3 (15-19), otros de 4 (20) (Corrales et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001; 42: S484. Abstract 2613) y otros de 5 (21) (Corrales et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2002. Abstract 2464). Sin embargo, los resultados obtenidos en este estudio, usando muestras recogidas mediante CIC y utilizando la técnica de la PCR permite demostrar que el epitelio conjuntival humano de individuos sanos expresa los genes de mucinas MUC1, MUC2, MUC4, MUC5AC, MUC7, MUC13, MUC15, MUC16 y MUC17, confirmando de esta manera la expresión de los 5 primeros en debate y, sobre todo, identificando 4 genes nuevos no descritos hasta ahora en la conjuntiva humana.

Todas las muestras obtenidas por CIC expresaban estos 9 genes de mucinas. Los productos de amplificación obtenidos tenían el mismo tamaño en pares de bases que la mezcla de ADN de cadena simple usada como control positivo. La identidad de los transcritos se confirmó mediante secuenciación y posterior comparación con el programa de dominio público BLAST®.

Estos 4 nuevos genes (MUC13, MUC15, MUC16 y MUC17) son mucinas transmembrana recientemente caracterizadas y todavía no se conoce muy bien su papel fisiológico (11-14). La expresión de MUC13 y MUC15 se ha demostrado en un amplio rango de tejidos, como por ejemplo, colon, ovario, intestino delgado, etc. tanto en células epiteliales como en células hematopoyéticas y del sistema inmune (11,12). MUC16 se ha caracterizado en células tumorales y en pulmón normal, y MUC17, además de expresarse en células tumorales, también lo hace en intestino, estómago y riñón fetal normal, ambas podrían estar implicadas en la señalización intracelular (13,14).

En resumen, a la lista de tejidos que expresan estos cuatro genes de mucinas, habría que añadir la conjuntiva humana normal, lo que abre una nueva vía para el estudio de la función de dichos genes tanto en condiciones normales como en la patología de la superficie ocular. Y, aunque ya se descrito alteraciones en la expresión de varios genes de mucinas en el síndrome de ojo seco (22) (Calonge et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2003. Abstract 2508), aún es demasiado pronto para especular sobre el papel de estos nuevos genes en el desarrollo de una patología.

 

BIBLIOGRAFÍA

1. Rohen JW, Lütjen-Drecoll E. Functional Morphology of the Conjunctiva. In: Lemp MA, Marquart R, Eds. The Dry Eye. A Comprehensive Guide. Berlin Heidelberg: Springer-Verla; 1992; 35-63.        [ Links ]

2. Prydal JI, Campbell FW. Study of precorneal tear film thickness and structure by interferometry and confocal microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci 1992; 33: 1996-2005.         [ Links ]

3. Gipson IK, Inatomi T. Mucin genes expressed by the ocular surface epithelium. Prog Retin Eye Res 1997; 16: 81-98.         [ Links ]

4. Gum JR Jr, Hicks JW, Toribara NW, Siddiki B, Kim YS. Molecular cloning of human intestinal mucin (MUC2) cDNA. Identification of the amino terminus and overall sequence similarity to prepro-von Willebrand factor. J Biol Chem 1994; 269: 2440-2446.         [ Links ]

5. Gum JR Jr, Ho JJ, Pratt WS, Hicks JW, Hill AS, Vinall LE et al. MUC3 human intestinal mucin. Analysis of gene structure, the carboxyl terminus and a novel upstream repetitive region. J Biol Chem 1997; 272: 26678-26686.         [ Links ]

6. Moniaux N, Nollet S, Porchet N, Degand P, Laine A, Aubert JP. Complete sequence of the human mucin MUC4: a putative cell membrane-associated mucin. Biochem J 1999; 338: 325–333.         [ Links ]

7. Mehrotra R, Thornton DJ, Sheehan JK. Isolation and physical characterization of the MUC7 (MG2) mucin from saliva: evidence for self-association. Biochem J 1998; 334: 415-422.         [ Links ]

8. Meezaman D, Charles P, Daskal E, Polymeropoulos MH, Martin BM, Rose MC. Cloning and analysis of cDNA encoding a major airway glycoprotein, human tracheobronchial mucin (MUC5). J Biol Chem 1994; 269: 12932-12939.         [ Links ]

9. Lapensee L, Paquette Y, Bleau G. Allelic polymorphism and chromosomal localization of the human oviductin gene (MUC9). Fertil Steril 1997; 68: 702-708.         [ Links ]

10. Williams SJ, McGuckin MA, Gotley DC, Eyre HJ, Sutherland GR, Antalis TM. Two novel mucin genes down-regulated in colorectal cancer identified by differential display. Cancer Res 1999; 59: 4083-4089.         [ Links ]

11. Williams SJ, Wreschner DH, Tran M, Eyre HJ, Sutherland GR, McGuckin MA. MUC13, a novel human cell surface mucin expressed by epithelial and hemopoietic cells. J Biol Chem 2001; 276: 18327-18336.         [ Links ]

12. Pallesen LT, Berglund L, Rasmussen LK, Petersen TE, Rasmussen JT. Isolation and characterization of MUC15, a novel cell membrane-associated mucin. Eur J Biochem 2002; 269: 2755-2763.         [ Links ]

13. Yin BW, Lloyd KO. Molecular cloning of the CA125 ovarian cancer antigen: identification as a new mucin, MUC16. J Biol Chem 2001; 276: 27371-27375.         [ Links ]

14. Gum JR Jr, Crawley SC, Hicks JW, Szymkowski DE, Kimp YS. MUC17, a novel membrane-tethered mucin. Biochem Biophys Res Commun 2002; 291: 466-475.         [ Links ]

15. Inatomi T, Spurr-Michaud S, Tisdale AS, Gipson IK. Human corneal and conjunctival epithelia express MUC1 mucin. Invest Ophthalmol Vis Sci 1995; 36: 1818-1827.         [ Links ]

16. Inatomi T, Spurr-Michaud S, Tisdale AS, Zhan Q, Feldman ST, Gipson IK. Expression of secretory mucin genes by human conjunctival epithelia. Invest Ophthalmol Vis Sci 1996; 37: 1684-1692.         [ Links ]

17. Berry M, Ellingham RB, Corfield AP. Polydispersity of normal human conjunctival mucins. Invest Ophthalmol Vis Sci 1996; 37: 2559-2571.         [ Links ]

18. Jumblatt MM, McKenzie RW, Jumblatt JE. MUC5AC mucin is a component of the human precorneal tear film. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999; 40: 43-49.         [ Links ]

19. Pflugfelder SC, Liu Z, Monroy D, Li DQ, Carvajal ME, Price-Schiavi SA et al. Detection of sialomucin complex (MUC4) in human ocular surface epithelium and tear fluid. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000; 41: 1316-1326.         [ Links ]

20. McKenzie RW, Jumblatt JE, Jumblatt MM. Quantification of MUC2 and MUC5AC transcripts in human conjunctiva. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000; 41: 703-708.         [ Links ]

21. Jumblatt MM, McKenzie RW, Steele PS, Emberts CG, Jumblatt JE. MUC7 expression in the human lacrimal gland and conjunctiva. Cornea 2003; 22: 41-45.         [ Links ]

22. Argueso P, Balaram M, Spurr-Michaud S et al. Decreased levels of the goblet cell mucin MUC5AC in tears of patients with Sjogren syndrome. Invest Ophthalmol Vis Sci 2002; 43: 1004-1011.         [ Links ]