ARTÍCULO ORIGINAL

 

Importancia de los estudios de biología molecular en el asesoramiento genético de familias argentinas con retinoblastoma

The relevance of molecular biology studies in the genetic counselling of argentine retinoblastoma families

 

 

Parma D.L.¹, Dalamon V.K.¹, Fernández C.², Szijan I.¹, Damel A.³

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Cátedra de Genética y Biología Molecular. Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Buenos Aires. Argentina.
¹ Doctora de la Universidad de Buenos Aires.
² Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires.
³ Médica Oftalmóloga de la Universidad de Buenos Aires. Jefe de la Unidad de Oftalmología Pediátrica del Hospital de Niños de Buenos Aires.

Estudio financiado por Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (PICT) y Secretaría de Ciencia y Técnica de la Universidad de Buenos Aires (UBACYT).

Dirección para correspondencia

 

 

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RESUMEN

Objetivo: Evaluar la importancia de la detección de mutaciones del gen RB1 en el asesoramiento genético de las familias argentinas con retinoblastoma.
Métodos: Se incluyeron en este estudio 34 familias argentinas con Retinoblastoma (Rb) bilateral y unilateral. Se analizaron 130 muestras de ADN de leucocitos, tumores y vellosidades coriónicas, por ensayos de Biología Molecular indirectos y directos, como Southern blot, segregación de los polimorfismos BamHI, Rbi4, XbaI y Rb 1.20 (PCR-RFLP, PCR-STR), PCR-heteroduplex y secuenciación del gen RB1.
Resultados: El análisis molecular fue informativo en 18 familias de las 34 incluidas en el estudio (53%), el 56% con Rb bilateral y el 44% con Rb unilateral. Se contó con muestras de ADN tumoral de 11 pacientes que se estudiaron para detectar pérdida de heterocigosidad (LOH), que posibilitó identificar el alelo RB1 mutado en 9 pacientes (82%). Cuando no se analizaron las muestras tumorales, los estudios fueron informativos solo en 9 de los 23 pacientes (39%); se utilizó la detección directa en 17 pacientes (41% informativo) e indirecta en 20 (60% informativo).
Conclusiones: Los resultados demuestran la necesidad de contar con ADN del tumor, cuando el paciente fue enucleado, y acentúan la importancia de la detección directa de la mutación en familias con Rb esporádico temprano sin muestra tumoral.
Los estudios de biología molecular contribuyeron con el adecuado asesoramiento genético de pacientes argentinos y sus familiares y el diseño apropiado de su tratamiento temprano.

Palabras claves: Retinoblastoma, gen RB1, mutación, análisis de ADN, asesoramiento genético.

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ABSTRACT

Objective: Evaluate the relevance of RB1 mutations detection in the genetic counselling of Argentine retinoblastoma families.
Methods: We included in this study 34 Argentine families with bilateral and unilateral Retinoblastoma (Rb). 130 DNA samples from leukocytes, tumors and chorionic villus were analyzed by indirect and direct molecular biology assays like Southern blot, segregation of polymorphisms BamHI, Rbi4, XbaI y Rb 1.20 (PCR-RFLP, PCR-STR), PCR-heteroduplex and sequencing of RB1 gene.
Results: Molecular biology analysis was informative in 18 out of 34 families studied (53%), 56% with bilateral and 44% with unilateral Rb. DNA tumor samples of 11 patients were available and could be studied by loss of heterozygosity (LOH) detection, that allowed us to identify the mutated RB1 allele in 9 (82%) patients. When tumor samples were not analized, the studies were informative only in 9 out of 23 patients (39%); we used direct mutation detection in 17 (41% informative) and indirect assays in 20 (60% informative) patients.
Conclusions: The results prove the necessity to have DNA tumor, when the patient has been enucleated, and emphasize the importance of direct mutation detection in families with early sporadic Rb without tumor sample.
The RB1 molecular biology contributed to the adequate genetic counselling of Argentine patients and relatives and their appropriate early treatment planning. (Arch Soc Esp Oftalmol 2009; 84: 557-562).

Key words: Retinoblastoma, RB1 gene, mutation, DNA analysis, genetic counselling.

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Introducción

El retinoblastoma (Rb) es un tumor maligno de la niñez, que se inicia cuando ocurren dos eventos mutacionales en el locus 13q14, que inactivan ambos alelos del gen del retinoblastoma (RB1) (1). RB1 forma parte de la familia de genes supresores de tumor, los cuales inhíben normalmente el crecimiento celular y regulan negativamente la proliferación (2). Este gen posee 200 kb y 27 exones y codifica para una proteína reguladora del ciclo celular llamada pRb o p110^RB (100KDa) (3).

Alfred Knudson propuso que la inactivación de RB1 ocurre a través del mecanismo del «doble golpe». La primera mutación puede aparecer en la línea germinal (Rb hereditario, 40%) o en las células somáticas (Rb no hereditario, 60%) (4). La segunda mutación es somática en todos los casos (ocurre sólo en retinoblastos) y se presenta con alta frecuencia. En la forma hereditaria, que se presenta como un Rb unilateral multifocal o bilateral, una de las mutaciones está presente en todas las células del individuo, incluidas las células somáticas (retinales) y germinales. En la forma no hereditaria de la enfermedad, que se presenta como un Rb unilateral unifocal, ambas mutaciones deben ocurrir en un solo retinoblasto (5).

En el 70% de los tumores, la segunda mutación involucra la pérdida somática del alelo normal. Estos mecanismos de pérdida alélica pueden ponerse de manifiesto mediante herramientas de biología molecular, como la pérdida de heterocigocidad (LOH) de loci polimórficos en RB1, comparando el genotipo constitucional del paciente y el genotipo tumoral (6,7).

Entonces, debido a la alta frecuencia con la que ocurre la segunda mutación en RB1, el Rb se transmite como una enfermedad autosómica dominante con una penetrancia del 90% (8), es decir que sólo un 10% de los que presenten una mutación en dicho gen permanecerían como portadores sanos. En la forma hereditaria, sólo el 25% de los casos presenta historia familiar (Rb hereditario transmitido), el 75% restante se debe a mutaciones nuevas en la línea germinal o durante la gestación, que serán transmitidas hereditariamente por el afectado (hereditario de novo). En los casos no hereditarios, ambas mutaciones se encuentran presentes sólo en el tejido tumoral, por lo que la mutación no será transmisible.

Los tipos de mutaciones descriptas en RB1 son: deleciones microscópicas (5%), deleciones submicroscópicas (15%) y mutaciones pequeñas (80%) (9). Las estrategias de biología molecular para su estudio pueden ser directas o indirectas, en función de si se detecta o no la mutación implicada.

El estudio de las mutaciones es fundamental para el diagnóstico temprano, la detección de la predisposición al Rb y otros cánceres y el asesoramiento genético a las familias afectadas. El momento del diagnóstico es importante para el pronóstico de la visión y la sobrevida.

 

Sujetos, material y métodos

Se incluyeron en este estudio 34 familias con retinoblastoma (Rb) bilateral y unilateral, de distintos orígenes étnicos y todas las regiones geográficas de la Argentina (tabla I). Los pacientes fueron derivados del Servicio de Oftalmología del Hospital de Niños de la Ciudad de Buenos Aires y el diagnóstico fue establecido utilizando criterios oftalmológicos e histopatológicos. Todos los casos fueron esporádicos, excepto la familia 1, que presentó padre (1) e hija (1´) con Rb. En total, se analizaron 130 muestras de ADN de leucocitos de sangre periférica, tumores y vellosidades coriónicas, por ensayos de Biología Molecular indirectos y directos como Southern blot (10), segregación de polimorfismos (11-13), PCR-heteroduplex y secuenciación (10,14) del gen RB1. Los polimorfismos estudiados fueron: BamHI: sitio de restricción en el intrón 1 (g.2300 A>G) (15); Rbi4: repetición de la secuencia TG en el intrón 4 (g.43218) (16); XbaI: sitio de restricción en el intrón 17 (g.99426 T>C) (17); RB1.20: repetición de la secuencia CTTT en el intrón 20 (g.156895) (18), que se analizaron por PCR-RFLP y PCR-STR. De esta forma, se conformaron los haplotipos y se identificó el haplotipo de riesgo. Para el análisis de secuenciación presentado en este trabajo, se amplificó por PCR el exón 20 del gen RB1 y sus secuencias intrónicas flanqueantes y se realizó la técnica de Sanger (14).

 

 

Resultados

El análisis molecular fue informativo en 18 familias de las 34 incluidas en el estudio (53%) (tabla I), el 56% con Rb bilateral y el 44% con Rb unilateral (10-14). En 15 de ellas fue posible identificar si el alelo mutado era el paterno (en 6) o el materno (en 9).

Se contó con muestras de ADN tumoral de once pacientes que se estudiaron para detectar pérdida de heterocigosidad (LOH), que posibilitó identificar el alelo RB1 mutado en 9 pacientes (82%). Cuando no se tuvo acceso a las muestras tumorales, los estudios fueron informativos solo en 9 de los 23 pacientes (39%); se utilizó la detección directa en 17 pacientes (el 41% fue informativo) e indirecta en 20 (el 60% fue informativo).

Se muestra el análisis realizado a cuatro familias de este grupo:

El individuo 60 (sin antecedentes, tumor bilateral) portaba la mutación g.156820delA, en el exón 20 del gen RB1, evidenciada por heteroduplex y posterior secuenciación (14). Se analizó el ADN de sangre periférica de dos hermanos en edad de riesgo para establecer la probabilidad de desarrollo de Rb. En ambos casos, la secuencia fue comparable a la secuencia obtenida para un control normal, por lo que pudo excluirse a ambos hermanos del riesgo de desarrollar o transmitir Rb a su descendencia (fig. 1).

 

Fig. 1: Secuencias normales (izq. y centro) obtenidas para ambos hermanos
del afectado de Rb. La deleción puntual en el exón 20, g.156820delA, identificación
en el afectado (flecha roja), genera corrimiento del marco de lectura (der.).

 

Los individuos 148 y 291 (sin antecedentes, tumor unilateral, de aparición temprana, sugiriendo carácter hereditario de novo) presentaron pérdida de heterocigosidad (LOH) en el tumor, lo que permitió determinar cuál era la herencia parental del alelo afectado en la familia (figs. 2 y 3). Para el polimorfismo RB1.20, el paciente 148 conserva el alelo 4 en el tumor y el paciente 291 el alelo 2. Como se pierde el alelo normal, se deduce que el alelo que permanece en el tumor (materno) es el ligado a la mutación. La identificación del cromosoma mutado en el afectado, suponiendo que el Rb era hereditario, permitiría predecir la susceptibilidad al Rb, únicamente por exclusión, en hermanos o descendientes del mismo, formando parte del asesoramiento genético. La hermana del paciente 291 heredó los alelos paterno (NC/158/NC/4) y materno (C/162/C/3) diferentes a los del paciente. De esta forma, se la pudo excluir del riesgo, ya que no heredó el alelo materno ligado a la mutación.

 

Fig. 2: Segregación de polimorfismos para el paciente 148 y su familia.
A. Gel de poliacrilamida para RBI.20. Se observa en la muestra tumoral
del paciente (TU) la falta de alelo 3 paterno. B. Genealogía con los
haplotipos conformados.

 

Fig. 3: Segregación de polimorfismos para el paciente 291 y su familia.
A. Gel de poliacrilamida para RBI.20. En el tumor (Tu), falta el alelo 1 paterno.
B. Genealogía con los haplotipos conformados. La hermana hereda alelos
diferentes a los del paciente.

 

El individuo 194 (sin antecedentes, tumor bilateral) evidenció una deleción en la región 3' del gen RB1 en el ADN constitucional, al realizar la segregación de alelos para los 4 polimorfismos intragénicos. La segregación de alelos, para los polimorfismos ubicados en la región 5' y central del gen, resultó en la presencia de ambos alelos, paterno y materno. Por el contrario, el análisis del polimorfismo RB1.20 permitió evidenciar la deleción constitucional mediante la falta de la variante alélica materna para dicho locus (fig. 4). El extremo 5' de la deleción debería encontrarse en el intrón 17, corriente abajo del sitio polimórfico para la enzima de restricción Xbal. En este caso, el estudio de polimorfismos intragénicos se vuelve un estudio directo, es decir que puso en evidencia la mutación inactivante del gen RB1. Mediante este mismo estudio, fue posible excluir a la hermana del paciente 194 como portadora de la mutación predisponente para la patología, ya que heredó el otro alelo materno y no se detectó ausencia del alelo RB1.20.

 

Fig. 4: Segregación de polimorfismos para el paciente 194 y su familia.
A. Gel de poliacrilamida para RBI.20. En el paciente falta del alelo 2 materno.
La hermana hereda el alelo 3 paterno y 2 materno. B. Genealogía con
los haplotipos conformados.

 

Discusión

Los resultados demuestran la necesidad de contar con ADN del tumor, cuando el paciente fue enucleado, y acentúan la importancia de la detección directa de la mutación en familias con Rb esporádico temprano sin muestra tumoral. Sin embargo, como consecuencia de una mejoría sustancial en los métodos de detección y tratamiento, el número de enucleaciones está disminuyendo progresivamente, haciendo cada vez más difícil la obtención de tejido tumoral para este tipo de estudios.

La ausencia de una anomalía, detectable en el ADN de un tejido constitucional (como los leucocitos de sangre periférica) sugiere que se trata de una forma no hereditaria de la enfermedad. De cualquier forma, podrían existir alteraciones estructurales pequeñas no detectables con los métodos utilizados. Por lo tanto, no existe un 100% de probabilidad de que sea un caso esporádico, sin riesgo para la futura progenie del paciente. No obstante, la mayoría de los Rb unilaterales (60-75%) no son hereditarios y el 25-40% sí los son.

Una vez que se ha identificado el alelo RB1 mutado, es posible determinar el riesgo para los familiares del paciente. Así, los resultados obtenidos permiten establecer varios aspectos del asesoramiento genético para cada familia (19-21). Si se trata de una mutación de origen germinal, es un caso hereditario; la futura progenie tiene un 50% de probabilidad de heredar una copia del gen RB1 mutado y, con estos estudios, se puede establecer el test presintomático para esta futura progenie. A aquellos niños en los que no se ha detectado un alelo mutado, no es necesario practicar los frecuentes e incómodos exámenes oftalmológicos, ya que tienen un muy bajo riesgo de desarrollar Rb, mientras que puede incrementarse la vigilancia en aquellos que son portadores, aumentando las probabilidades de detección precoz y en consecuencia de conservar la visión. Es importante conocer el estado de portador o no de los padres ya que, de esta forma, se puede evaluar el riesgo de transmitir la predisposición al tumor a otros hijos. Si los padres no son portadores del alelo mutado, sus futuros hijos no tendrán riesgo de desarrollar Rb u otros tumores relacionados; en cambio, si alguno de los padres es portador, sus futuros hijos tendrán un 50% de probabilidad de heredar la misma mutación, con el riesgo de desarrollar la enfermedad. Por otro lado, si no se detecta la mutación en el ADN constitucional del paciente con Rb unilateral, se trata probablemente de un caso esporádico no hereditario y el riesgo es bajo para la futura descendencia (22).

En este grupo de familias, los estudios de biología molecular contribuyeron con el adecuado asesoramiento genético y el diseño apropiado de su tratamiento temprano.

 

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Dirección para correspondencia:
Diana L. Parma
Cátedra de Genética y Biología Molecular
Facultad de Farmacia y Bioquímica
Universidad de Buenos Aires
Junín 956, (1113) Ciudad Autónoma de Buenos Aires (Argentina)
E-mail: dlparma@yahoo.com

Recibido: 5/3/09.
Aceptado: 1/12/09.