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Oncología (Barcelona)
versión impresa ISSN 0378-4835
Oncología (Barc.) vol.27 no.5 may. 2004
ORIGINALES
Valor pronóstico de los marcadores tumorales de proliferación celular y angiogénesis en los oligodendrogliomas
The prognostic importance of cell proliferation and angiogenesis tumor markers in oligodendroglioma
A. López-MuñizI; J. C. GutiérrezII; C. García-FernándezII; A. HerreroIII
Universidad de Oviedo
IDepartamento de Morfología y Biología Celular. Facultad de Medicina
IIServicios de Neurología y Neurocirugía. Hospital Universitario Central de Asturias
IIIDepartamento de Cirugía (Anatomía Patológica). Facultad de Medicina. HUCA
Dirección para correspondencia
RESUMEN
PROPÓSITO: la evolución clínica de los oligodendrogliomas (ODG) es impredecible por los actuales criterios clínicos e histológicos. La presencia de marcadores tumorales del ciclo celular o de la angiogénesis podría predecir el curso clínico de los ODG. El propósito de este estudio ha sido la cuantificación de las expresiones ki67 y CD34 en ODG y su correlación con el grado histológico y la supervivencia.
MATERIAL Y MÉTODOS: hemos estudiado 25 ODG. Las inmunoexpresiones ki67 y CD34 fueron determinadas por técnicas inmunohistoquímicas. Posteriormente se realizó un análisis cuantitativo con un programa de análisis de imagen sistema Qwin. Finalmente, se realizaron las cuantificaciones del ki67 y del CD34, y el análisis estadístico de los resultados.
RESULTADOS: el número de núcleos Ki67 positivos se correlacionó con la malignidad de la lesión. El número de núcleos ki67 también se correlacionó con la supervivencia de los pacientes. Por el contrario, el número de microvasos (estructuras CD34 positivas) no se correlacionaba ni con el grado histológico ni con la supervivencia en los ODG.
CONCLUSIONES: estos resultados sugieren que el ki67, fundamentalmente el número de núcleos marcados, es un importante indicador diagnóstico y puede ser usado como un parámetro de mal pronóstico en los ODG. Por el contrario, la angiogénesis no es un parámetro pronóstico en los ODG.
Palabras clave: Oligodendroglioma. Angiogénesis. Proliferación celular. Antígeno Ki67. Antígeno CD34.
SUMMARY
PURPOSE: The clinical behavior of oligodendroglioma (ODG) is unpredictable using clinical and histological criteria. The present tumor markers related to cell cycle regulation and angiogenesis might improve the possibility of predicting the clinical course of ODG. The aim of this study is the quantification of ki67 and CD34 expression in oligodendrogliomas and its correlation with histological grade and survival.
MATERIAL AND METHODS: We studied 25 ODG. The ki67 and CD34 immunoexpression was determined by immunohistochemical techniques. Later, the quantitative study was carried out with a Qwin system image analysis program. Finally, ki67 and CD34 expression was quantified and a statistical analysis of the results was performed.
RESULTS: The number of ki67 positive nuclei correlated with the malignancy of the lesion, and with the overall survival. Contrarily, the number of CD34-positive microvessels of OGD showed no significant correlation with neither histological grade nor survival.
CONCLUSIONS: The obtained results suggest that ki67, as shown here by the number of immunomarked nuclei, is an important diagnostic indicator, and can be used as a poor prognostic parameter of OGD. On the contrary, angiogenesis, considered here by the CD-34-positive microvessels, is not a prognostic indicator of ODG.
Key words: Oligodendroglioma. Angiogenesis. Cell proliferation. Ki67 antigen. CD34 antigen.
Introducción
Los oligodendrogliomas constituyen entre el 2 y el 4% de los tumores cerebrales primarios1, 2 y del 4 al 18% de los gliomas intracraneales según las diferentes series3, 4, siendo más frecuentes en la edad adulta (entre 26 y 46 años) y en los varones2, 5.
Existen diversas clasificaciones histopatológicas de estos tumores, que los dividen en cuatro grados6, 7, tres grados8 o preferentemente basado en su pronóstico dos grados9, 10, lo que coincide con la OMS que los clasifica en bien diferenciados y anaplásicos11, 12.
El objetivo de este estudio es encontrar y valorar por métodos cuantitativos nuevos parámetros que nos permitan establecer el diagnóstico y el pronóstico de los oligodendrogliomas, lo que constituye uno de los retos oncológicos actuales13. Por este motivo, hemos estudiado un marcador del endotelio vascular para estudiar la angiogénesis (anticuerpo CD-34) y otro de la proliferación celular (anticuerpo anti-ki67), realizando la valoración de ambos por métodos cuantitativos.
Material y métodos
Se estudiaron 25 pacientes con lesión tumoral oligodendroglial (14 varones y 11 mujeres). La edad media era de 37.67+15.22 años (rango entre 23-71 años) .
Se clasificaron según sus características histopatológicas en dos grupos:
A. tumores bien diferenciados (grado II): 13 pacientes.
B. tumores anaplásicos (grado III): 12 pacientes.
Técnicas Inmunohistológicas
El antígeno ki67 destaca entre los antígenos de proliferación celular, ya que se ha demostrado en poblaciones celulares neoplásicas, como un excelente indicador pronóstico, debido a la correlación existente entre el marcaje del antígeno ki67 de los nucléolos durante las fases G1, S, G2 y M (ausente en la fase G0 o estado de reposo), y el grado histopatológico de las lesiones malignas, incluidos los oligodendrogliomas14, 15. Nosotros hemos podido confirmar dicha correlación en lesiones de distinto grado de malignidad en diferentes lesiones tumorales16, 17.
El antígeno marcador endotelial CD-34 es una glicoproteína transmembrana de cadena única con un peso molecular de 110 Kd que se expresa en células madres hematopoyéticas y, fundamentalmente, en el endotelio vascular18-20.
Inmunomarcaje Ki67
Para la identificación de las células reactivas al suero anti-Ki6716, se empleó la técnica inmunohistoquímica de estreptavidina-biotina (Lab. Biogenex, USA), usando como anticuerpo primario el anticuerpo monoclonal PP-67 (anti-Ki67, Lab. Sigma, USA) a dilución 1:200. Las muestras se incubaron en cámara húmeda durante 24 horas a 4o centígrados. El revelado se realizó con una solucción tamponada conteniendo diaminobencidina (DAB, Lab. Sigma, USA). La reacción de oxidación de la peroxidasa fue interrumpida bajo control microscópico mediante el lavado de las preparaciones con agua corriente. El contraste se efectuó con hematoxilina. Para verificar la especificidad de la reacción, el suero anti-Ki 67 fue sustituido por PBS en lugar del anticuerpo primario con una muestra control16, 17.
Inmunomarcaje CD34
Para la identificación del endotelio reactivo al suero anti-CD34 también se empleó la técnica inmunohistoquímica de estreptavidina-biotina (Lab. Biogenex, USA), usando como anticuerpo primario el anticuerpo monoclonal anti-CD34 (clon QBEND/10, Lab. Novocastra , UK) a dilución 1:50. A continuación se procede con las muestras de modo idéntico al expuesto con el anticuerpo anterior. Para verificar la especificidad de la reacción, el suero anti-CD34 fue sustituido por PBS en lugar del anticuerpo primario con una muestra control16, 17.
Estudio cuantitativo
Todas las preparaciones fueron examinadas al microscopio óptico mediante su estudio cuantitativo. En dicha cuantificación se utilizó el programa de análisis de imagen QWin colour RGB, en un ordenador Philips con cámara de vídeo de color (Leica DC 100), utilizando siempre los mismos aumentos. Se midieron 10 campos diferentes: el área de mayor marcaje (área caliente) y otras nueve al azar y se seleccionan los perfiles de las células, los perfiles de células ki67 positivas y los perfiles de los vasos siguiendo la metodología estandarizada21, 22 y desarrollada en nuestro Departamento16, 17.
Parámetros morfométricos
Hemos seleccionado para su estudio estadístico los siguientes parámetros que serán las variables de estudio: número máximo de perfiles celulares (celmax); número medio de perfiles celulares (celmed); número máximo de perfiles celulares Ki67 positivos (celKi67max); número medio de perfiles celulares Ki67 positivos (celKi67med); número máximo de perfiles vasculares (vasmax); número medio de perfiles vasculares (vasmed); proporción entre el número máximo de células Ki67 positivas y el número máximo de células (celKi67max/ celmax); proporción entre el número medio de células Ki67 positivas y el número medio de células (celKi67med/celmed); proporción entre el número máximo de perfiles vasculares y el número máximo de células (vascmax/celmax); proporción entre el número medio de perfiles vasculares y el número medio de células (vascmed/celmed).
Análisis estadístico
Grado histológico: para valorar la influencia del grado histológico del tumor, los oligodendrogliomas se clasificaron como ya hemos expuesto, en dos grupos: A y B, según el grado de diferenciación. Una vez comprobado que las variantes eran normales, se realizó análisis de la varianza de las muestras como condicionante de validez de esta prueba paramétrica. Posteriormente, se realizó el estudio comparativo de las medias de las distintas variables cuantitativas continuas con la t de Student-Fisher.
Supervivencia: para analizar la influencia de los parámetros o variables en la supervivencia, se calcularon previamente los percentiles y cuartiles antes de aplicar el método de Kaplan-Meier para conocer los puntos de corte que puedan establecer las diferencias estadísticamente significativas del impacto clínico de esos parámetros.
Análisis multivariante: finalmente, para evaluar el valor pronóstico o predictivo de cada variable con independencia de las restantes, se empleó como prueba el modelo de la regresión múltiple de Cox.
En todas las pruebas estadísticas se emplearon los programas informáticos Microsoft Office Excel 2000 Professional y SPSS 11.023.
Resultados
Grado histológico
- La valoración de los diferentes parámetros morfométricos según el grado histológico del tumor mostraron diferencias significativas para: celKi67máx (p = 0.001); celKi67med (p = 0.001); celki67máx/celmáx (p = 0.001); celKi67med/celmed (p = 0.001).
El resto de los parámetros no presentaron diferencias estadísticamente significativas (Fig. 1).
Supervivencia
- La influencia de las variables sobre la supervivencia demostró diferencias estadísticamente significativas para: celki67máx (p= 0.001); celKi67med (p = 0.001); celKi67máx/celmáx (p=0.015); celKi67med/ celmed (p = 0.009).
El resto de los parámetros no presentaron diferencias estadísticamente significativas (Fig. 2).
Analisis multivariante
El estudio del valor pronóstico de cada una de las variables, con independencia de las restantes mediante la regresión de Cox, solamente mostró valor significativo para el parámetro celKi67máx/celmáx (sig.= 0.004).
Sin embargo, ninguna variable mostró diferencias significativas dentro de los oligodendrogliomas del grupo A (grado II), ni tampoco dentro de los oligodendrogliomas del grupo B (grado III).
Discusión
Hemos estudiado un marcador de la angiogénesis, debido a la importancia que el crecimiento neovascular tiene en la evolución clínica de los tumores sólidos, y un factor de proliferación celular, el ki67, por ser considerado el de mayor valor pronóstico; pero es sin duda el empleo de una técnica de valoración cuantitativa, ajena a la influencia del observador, mediante un análisis morfométrico y estereológico según la metodología desarrollada en nuestra Departamento, la principal aportación, ya que nos permite una mayor fiabilidad de los resultados.
Nuestros resultados muestran que en los pacientes con oligodendrogliomas el estudio morfométrico del material anatomopatológico de las lesiones es de enorme interés para establecer la evolución clínica del paciente, pudiendo realizarse de forma rápida y sencilla. Estos resultados demuestran que los parámetros relacionados con la angiogénesis, las mediciones vasculares, no están correlacionadas con la evolución clínica del cuadro (supervivencia) ni con el grado de malignidad. Por el contrario, la actividad proliferativa celular expresada por el factor ki67, resultó un excelente marcador diagnóstico (según el grado del tumor) y pronóstico (según la supervivencia del paciente).
La microangiogénesis es considerada un requisito fundamental para el crecimiento de los tumores sólidos24-26, estableciéndose una correlación entre algunos parámetros de la angiogénesis y la supervivencia en diversos tumores27-29 entre los que se encuentran los gliomas30-33. Sin embargo, los oligodendrogliomas parecen ser una excepción, comprobándose que pueden crecer lentamente durante años en forma de células neoplásicas que infiltran el parénquima cerebral30 y en un posterior periodo tener lugar la microangénesis en áreas del parénquima de alta densidad tumoral1, 30. Por este motivo algunos estudios, coincidiendo con nuestras observaciones, discrepan sobre la valoración del contaje de los vasos y la supervivencia de los pacientes34-36, aunque otros sí han relacionado el número de vasos por unidad, con la supervivencia37-38.
Por el contrario, en la actualidad los autores coinciden en destacar la importancia del factor ki67 en el pronóstico de los oligodendrogliomas, por tratarse del más sensible de los indicadores de la proliferación celular39-45. Nuestro trabajo ratifica estos hallazgos tras un exhaustivo análisis morfométrico y estereológico.
En consecuencia, nuestro trabajo confirma que el factor de proliferación celular Ki67 debería realizarse en los oligodendrogliomas por su importancia en la valoración de la supervivencia de los pacientes, sugerencia compartida en recientes trabajos46-48. Por el contrario, en este tipo de tumores el estudio de la angiogénesis y de los marcadores endoteliales tendría escaso interés para establecer un pronóstico, pudiendo ser descartados. Consecuentemente, sugerimos que un riguroso análisis morfométrico debe ser añadido a la rutina clínica en la valoración de los oligodendrogliomas.
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Dirección para correspondencia
Dr. A. López Muñiz
Director del Dpto. Morfología y Biología Celular
Facultad de Medicina
Universidad de Oviedo
E-33071 Oviedo
E-mail: almu@correo.uniovi.es
Recibido: 17.12.03
Aceptado: 20.01.04
