ARTÍCULO CIENTÍFICO

 

Calidad del plasma rico en plaquetas: estudio de la activación plaquetaria

Platelet-rich plasma quality: a study on platelet activation

 

 

C. Sáez-Torres Barroso¹, J. Calvo Benito¹, A. Gayà Puig²

1 Médico.
2 Médico. Director del Banco de Tejidos de las Islas Baleares.
Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears, España

Dirección para correspondencia

 

 

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RESUMEN

Objetivo. El plasma rico en plaquetas (PRP) es utilizado de forma cada vez más frecuente en técnicas quirúrgicas de regeneración tisular. No obstante, el procesamiento de la sangre hasta obtener PRP puede desencadenar la activación prematura de las plaquetas y la pérdida de los factores bioactivos. En este trabajo estudiamos la calidad de los concentrados de plaquetas obtenidos siguiendo la técnica de doble centrifugación en tubo.
Método. Se someten 50 ml de sangre a una primera centrifugación a 200g 10 minutos, se recoge el sobrenadante y se centrifuga a 700g 15 minutos. Posteriormente, tras eliminar las 2/3 partes del plasma, se resuspenden las plaquetas y se analiza el grado de enriquecimiento, el estado de activación y la reserva funcional de las plaquetas.
Resultados. El enriquecimiento en plaquetas del PRP fue de 364±177% (n=45) respecto de los niveles presentes en sangre total. Mediante el estudio de la expresión de CD62 por citometría de flujo se determinó el porcentaje de plaquetas activadas en las muestras de 8 donantes. Mientras que en la sangre no procesada se detectó un 2,7% de plaquetas activadas, tras la preparación del PRP éste era sólo de 3,6%, aumentando hasta el 16% en el concentrado almacenado toda la noche a 22º C. Tras la estimulación con trombina el porcentaje de plaquetas activadas fue de 96,2%.
Conclusión. Este protocolo de preparación de PRP no produce una activación significativa de las plaquetas. La respuesta a la estimulación con trombina de los concentrados indica un buen estado de reserva plaquetaria.

Palabras clave: Regeneración ósea; Plasma rico en plaquetas; Activación plaquetaria; CD62.

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ABSTRACT

Objective. Platelet Rich Plasma (PRP) is an autologous preparation currently used in oral and maxillofacial reconstructive surgery. Blood collection and preparation of platelet concentrates may lead to platelet activation and the premature loss of their granular load. In this study, we have analyzed the quality of the PRP obtained from a small volume of whole blood through a double centrifugation technique, so called "tube method".
Design. We obtained 50 ml of whole blood from 45 patients and centrifuged at 200 g for 10 minutes. The plasma and buffy-coat were collected and we then centrifuged at 700g for 15 minutes. The pellet was resuspended after discarding 2/3 of the plasma. The platelet concentration, platelet activation and the functional response to thrombin were analyzed in these samples.
Results. By using this method of PRP preparation, we obtained a 364 ± 177% increase in platelet concentration in comparison with whole blood levels. Platelet activation, measured by flow cytometry analysis of CD62 expression, was of 2.7% in unprocessed blood and 3.6% in fresh PRP. This figure increased to 16% in PRP samples after overnight storage at room temperature. A percentage of 96% of platelets showed activation in PRP samples after thrombin stimulation.
Conclusion. Our results show that platelets contained in PRP concentrates obtained by this method are not significantly activated. A good functional platelet reserve is preserved through the procedure, since platelets maintained a satisfactory response to thrombin after PRP preparation.

Key words: Bone regeneration; Platelet Rich Plasma; Platelet activation; CD62.

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Introducción

La investigación en el campo de la regeneración ósea se orienta hacia la formación de un hueso de mayor calidad, de forma más temprana y, en ocasiones, en mayor cantidad. Los conocimientos sobre la fisiología de la reparación del hueso son utilizados a la hora de definir aquellas técnicas y materiales que puedan aportar las condiciones óptimas para este proceso. En este contexto se incluye el uso de diversas armas terapéuticas entre las que se encuentran los diferentes tipos de injertos y los factores de crecimiento contenidos en estos injertos, en los concentrados de plaquetas de uso local o en los preparados comerciales a partir de las formas recombinantes de los mismos.^1-3

El plasma rico en plaquetas (PRP) consiste en un concentrado de plaquetas de origen autólogo que, en contacto con sustancias activadoras del proceso de coagulación, forma una red de fibrina de consistencia gelatinosa que contiene los diferentes elementos celulares (gel de plaquetas). El interés del empleo del gel de plaquetas es doble. Por un lado aporta una gran estabilidad en el relleno del defecto óseo, ya que se comporta como un excelente transportador de los injertos de hueso, en especial de aquellos injertos particulados y ofrece la posibilidad de generar una malla de fibrina que puede ser suturada y que colabora a mantener la estabilidad del injerto. Por otro lado, las células sanguíneas, en especial las plaquetas contenidas en el PRP, son una fuente de sustancias mediadoras capaces de acelerar o mejorar los procesos regenerativos.^4,5 Entre estas sustancias destacan diversos factores de crecimiento tales como TGF-b, PDGF, VEGF, EGF e IGF. Varios estudios demuestran la actividad de estas sustancias en la estimulación de la angiogénesis, en la inducción de la quimiotaxis, proliferación y diferenciación de células progenitoras y en la síntesis de colágeno.^6-8

Desde la descripción de las aplicaciones clínicas del PRP se han empleado varios protocolos de obtención del mismo en función de las necesidades de uso. En los trabajos iniciales de Marx, el PRP se obtenía mediante técnicas de aféresis.⁴ Esta forma de procesamiento, habitual para las plaquetas de uso transfusional, consigue concentrados de volumen importante pero está limitada por la necesidad de unas condiciones específicas por parte del centro extractor y del paciente. Al ampliarse las indicaciones de uso del PRP a técnicas de regeneración de defectos óseos de pequeño tamaño, habituales en el campo de la cirugía oral y maxilofacial, se simplificó la técnica de obtención, adaptándola a cantidades menores de sangre periférica extraída por venopunción en tubos de pequeño volumen.^1,5,9-11 Esta sangre se somete a centrifugaciones sucesivas que permiten concentrar las plaquetas en la cantidad deseada. De esta manera se logra mayor facilidad y rapidez en la preparación del concentrado así como un menor coste y unas mínimas molestias para el paciente. Ambos procedimientos contemplan una serie de variables que pueden influir en la calidad y actividad biológica del producto final y que no se encuentran bien definidas en la actualidad. Entre estas variables destacan los diferentes pasos de centrifugación, que influyen tanto en la concentración como en el grado de activación de las plaquetas. Está demostrado que una activación prematura de las plaquetas conlleva una pérdida de factores que se eliminan o se degradan antes de alcanzar el lugar donde deben actuar.^12,13 Por ello, para garantizar la obtención de unos resultados óptimos con el empleo del PRP, es necesario que los concentrados que se utilizan contengan un número adecuado de plaquetas y que estas plaquetas se hayan mantenido hasta su utilización en condiciones que garanticen la preservación de su capacidad funcional.

El objetivo de este estudio es determinar la calidad del plasma rico en plaquetas obtenido con el método de doble centrifugación en tubo. Con este fin analizamos el enriquecimiento celular en el producto final así como el estado de activación y la reserva funcional de las plaquetas contenidas en este PRP.

 

Material y método

Obtención de las muestras

Para la preparación de cada muestra de PRP del estudio se obtuvo sangre de una serie de donantes voluntarios sanos así como de pacientes a los que se iba a realizar un procedimiento quirúrgico de regeneración ósea. La cantidad de sangre total extraída de cada donante fue de 50 ml en tubos de 5 ml conteniendo citrato como anticoagulante (Venoject, TERUMO Europe, Leuven, Bélgica). Esta sangre fue procesada siguiendo el método de preparación de PRP en tubo. El procedimiento contempla una primera centrifugación lenta (200g X 10 min) tras la que se recoge el plasma sobrenadante junto con los primeros mm de la capa leucocitaria y de hematíes, seguido de una segunda centrifugación de mayor intensidad (700 g X 15 min) que permite separar una fracción de plasma pobre en plaquetas (PPP) correspondiente a la porción superior, en volumen variable según la concentración celular que se desee obtener en el producto final, y la fracción restante de plasma rico en plaquetas (PRP).

La preparación de las muestras se realizó en campana de flujo laminar para evitar la contaminación de las mismas. El recuento celular de las muestras de sangre total y de PRP se llevó a cabo de forma automática (Ac-T5 diff AL,Beckman Coulter, CA).

Técnica de citometría de flujo para el análisis de la activación plaquetaria

En las diferentes muestras del estudio se realizó un marcaje con anticuerpos específicos unidos a fluorocromos frente a las moléculas CD61 y CD62. El CD61 es una molécula que se expresa de forma normal en la superficie de las plaquetas y que permite definir la población plaquetaria. El análisis de CD62 (P selectina) constituye un marcador de activación de estos elementos celulares debido a que esta molécula, presente en los gránulos de las plaquetas, se expresa en la superficie de las mismas al ser activadas.

El doble marcaje se llevó a cabo añadiendo a las muestras concentraciones saturantes de anti-CD61 conjugado con fluoresceína (Caltag, Burlingame, CA) y anti-CD62 conjugado con ficoeritrina (Caltag, Burlingame, CA) e incubando durante 20 minutos a 22ºC en la oscuridad. Tras la incubación se añadió 1 ml de solución de paraformaldehído al 1% a cada tubo.

El control de activación se llevó a cabo estimulando una alícuota de PRP previamente diluida 1:10 en PBS, con trombina a una concentración de 1 U/ml final (Sigma Chemicals, St.Louis, MO), en presencia de 2 mM Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP, Sigma Chemicals, St.Louis, MO). Este péptido es un inhibidor de la polimerización de fibrina y de la agregación plaquetaria que impide que se forme el coágulo al activarse las plaquetas. Tras la adición del activador las muestras se incubaron a 37ºC durante 15 minutos y se continuó con el protocolo de tinción descrito.

Las muestras fueron finalmente analizadas en un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA) utilizando el programa Cell Quest (Becton Dickinson, San José, CA).

El grado de activación de las plaquetas se analizó a diferentes tiempos: sangre total antes de ser procesada, PRP recién preparado, PRP almacenado 24 horas a 22ºC y PRP estimulado con trombina.

 

Resultados

Preparación del PRP y recuento de plaquetas

El PRP preparado en el laboratorio es dispensado al clínico de forma ambulatoria en viales estériles conteniendo las diferentes fracciones obtenidas a partir de la sangre del paciente. En un vial se dispensa el plasma rico en plaquetas, en otro la fracción correspondiente al plasma pobre en plaquetas y en un tercero la solución activadora que consiste en suero del propio paciente enriquecido con cloruro cálcico a una concentración final del 2,3% (Fig. 1). Para obtener el gel de plaquetas tan sólo es necesario recuperar el PRP y la solución activadora mediante jeringas graduadas y mezclarlos en una proporción de 10:1 (0,1 ml de solución activadora por cada ml de PRP).

A lo largo del período de este estudio se recogieron muestras procedentes de 45 pacientes y se realizó un recuento celular en la sangre total y en una alícuota de PRP. El análisis de estas muestras reveló un enriquecimiento en plaquetas de 364 ± 177% en el PRP respecto a los valores en sangre total.

Análisis del grado de activación de las plaquetas

Tal como se ha comentado anteriormente, la activación de las plaquetas durante el proceso de obtención del PRP, conlleva una liberación de los factores de crecimiento hacia el sobrenadante y su consiguiente pérdida de forma precoz. Por ello consideramos importante estudiar este factor como parámetro de influencia en la calidad del PRP.

El grado de activación de las plaquetas fue analizado en las muestras de PRP de 8 donantes a diferentes tiempos: sangre total, PRP recién obtenido y PRP tras 24 horas de almacenamiento a 22ºC. Para el estudio del estado de reserva funcional de las plaquetas se indujo la activación con trombina de los concentrados.

La lectura de las muestras en el citómetro de flujo se llevó a cabo con una señal de amplificación logarítmica en los cuatro parámetros (tamaño, rugosidad, FL1, FL2) que controlan la adquisición. Para el análisis posterior se delimitó la región correspondiente a la población de plaquetas en función de sus características de tamaño y rugosidad (Fig. 2A). La expresión del marcador CD61 en más del 95% de las células seleccionadas confirma que la población incluida está compuesta esencialmente por plaquetas (Fig. 2B).

Una vez identificada la población de plaquetas se analizó en ella la expresión de CD62. El patrón de fluorescencia observado nos permite identificar el porcentaje de plaquetas que muestran una intensidad de expresión del marcador Fl2 por encima del nivel del control de la técnica y que traduce el estado de activación. La figura 3 muestra los diferentes patrones de fluorescencia que se observan según las plaquetas estén en reposo o activadas. En el PRP recién preparado (Fig. 3A) y a las 24 horas (Fig. 3B) el número de plaquetas activadas es escaso. Esta situación contrasta con el aumento significativo en la intensidad de la señal FL2 en las muestras estimuladas con trombina (Fig. 3C).

El análisis conjunto de todas las muestras generadas a partir de un mismo donante se representa en la figura 4. En el histograma se aprecia como las curvas correspondientes a la activación de las plaquetas en sangre periférica, PRP fresco y PRP de 24 horas son prácticamente superponibles. Asimismo, el gráfico refleja el aumento significativo de la expresión del marcador de activación de las plaquetas en respuesta a la estimulación con trombina.

La media de los porcentajes de plaquetas activadas presentes en cada muestra, calculadas a partir del análisis de 8 donantes se representa en la figura 5. El porcentaje de plaquetas con expresión de CD62 en sangre periférica antes de ser procesada fue de 2,7 ± 3,0%. Después de los procesos de centrifugación, en el PRP fresco, esta media fue de 3,6 ± 2,7%. En este punto, la activación del concentrado tras la adición de trombina muestra un incremento de la expresión del CD 62 que alcanza el 96,2 ± 1,8% de las plaquetas. El análisis del PRP a las 24 horas de incubación a temperatura ambiente indica la presencia de un porcentaje de plaquetas activadas de 16,1 ± 9,8%. Al igual que en el PRP recién preparado, la adición de trombina conlleva un incremento del total de plaquetas activadas con cifras de 96,2 ± 0,7%.

 

Discusión

Todo proceso de manipulación de la sangre conlleva un cierto cambio en la ultraestructura de las células sanguíneas que puede traducirse en lesiones que afecten a su funcionalidad. Aunque estas lesiones son en gran parte reversibles, los cambios que tienen lugar en las plaquetas durante su procesamiento y almacenamiento actúan como parámetros útiles de predicción de la efectividad clínica de los concentrados.¹⁴

El análisis del PRP preparado según el protocolo de centrifugaciones sucesivas en tubo da como resultado un enriquecimiento de los concentrados entre 3 y 4 veces el recuento de plaquetas presente en la sangre periférica. Esta cantidad de plaquetas es suficiente para conseguir los objetivos que persigue la aplicación local de este preparado, diferentes de los del uso transfusional de las plaquetas. El PRP así obtenido permite la formación de un coágulo cuya consistencia es excelente para transportar diferentes tipos de injertos óseos y biomateriales. Asimismo, supone un aporte suplementario en el foco de lesión de una serie de factores de crecimiento que actúan como mediadores en los procesos de regeneración.

Si bien algunos autores defienden la idea de que la actividad biológica del PRP derivada del aporte de factores de crecimiento precisa de una cantidad entre 0,9-1x10⁶ plaquetas/µl en el volumen habitual de concentrado (6-10 ml),¹ no parece existir ningún estudio concluyente que lo demuestre. No está definido el número de plaquetas necesario para obtener una cantidad adecuada de cada uno de los factores producidos por las mismas, del mismo modo que no está comprobado que el número de células contenidas en el concentrado sea el único determinante de la cantidad de factores liberados. Weibrich y Kleis han comparado en sus trabajos dos sistemas de preparación de PRP, a través de un análisis del rendimiento de plaquetas obtenido con cada sistema y la cuantificación de los principales factores de crecimiento contenidos en el producto final.¹⁵ Estos autores concluyen que, si bien existe una asociación significativa entre el número de plaquetas y la concentración de TGF-b, esta asociación no es significativa para los otros factores analizados (PDGF, IGF), por lo que el número de plaquetas por si sólo no puede utilizarse para predecir la cantidad de factores de crecimiento que serán producidos. El trabajo de Zimmerman y cols.¹³ también presenta resultados similares en el análisis de los factores presentes en concentrados de plaquetas obtenidos por diferentes técnicas. Los autores señalan las diferencias en el estado de activación de las plaquetas como uno de los factores que contribuyen a esta variabilidad. Por otro lado, Dugrillon y cols.¹² estudiaron el recuento de plaquetas y el contenido en TGF-b1 del PRP sometido en su procesamiento a diferentes fuerzas de centrifugación. Este trabajo muestra claramente que intensidades superiores a 800 g producen mayores rendimientos de plaquetas pero disminuyen la cantidad de TGF-b contenida en el producto final. Este descenso en la cantidad de factores es consecuencia de la activación de las plaquetas al ser sometidas a importantes fuerzas mecánicas, con consiguiente liberación al medio del contenido de los gránulos, que se pierde prematuramente al retirar la fracción sobrante de plasma. Por consiguiente, la efectividad del PRP no sólo tiene relación con el hecho de contener una determinada concentración de plaquetas, sino que es de gran importancia garantizar que éstas permanezcan intactas hasta su utilización.

En nuestro estudio, el grado de integridad las plaquetas en el PRP es analizado a través del estudio del estado de activación y de la reserva funcional de las mismas. La medida de expresión de CD62 y la respuesta a la estimulación con trombina son parámetros utilizados frecuentemente para el análisis de concentrados de plaquetas no sólo de aplicación local sino también para los de uso transfusional. ^14,16-18 La cifra de 2,7% de activación plaquetaria en sangre extraída por venopunción coincide con la publicada previamente.¹⁹

En nuestro caso, el porcentaje de plaquetas activadas en el PRP fresco muestra cifras de entre 3-5% y del 16% a las 24 horas de almacenamiento. Estos datos se encuentran dentro del rango descrito en otras publicaciones que analizan concentrados de plaquetas de uso hematológico, en las que a las 24 horas el porcentaje de plaquetas activadas se encuentra entre el 7%,¹⁹ y el 25%.¹⁴ Desde el punto de vista funcional, se han observado buenos resultados con la utilización de concentrados en los que se describe la presencia de hasta un 20-30% de plaquetas activadas.²⁰

Otro indicador de la viabilidad de las plaquetas en el PRP es la buena respuesta que se ha observado tras la estimulación con trombina, que se traduce en una correcta liberación del contenido de los depósitos intracelulares. La expresión de membrana de P selectina se acompaña en condiciones fisiológicas de la liberación y expresión de las otras moléculas contenidas en los reservorios, entre las que se encuentran los diferentes factores de crecimiento.²¹

Por último, en referencia al período de almacenamiento de los concentrados de plaquetas, es importante señalar que los hemoderivados procesados en circuito abierto no deben ser utilizados en un período posterior a 6 horas desde su preparación. El PRP obtenido por doble centrifugación en tubo debe cumplir esta recomendación. De este modo, el hecho de que las plaquetas se encuentren en buen estado en el PRP analizado a las 24 horas parece dar un margen de garantía suficiente a la hora de afirmar el buen estado de las plaquetas y de su reserva funcional en el plazo de tiempo que contempla las condiciones habituales de aplicación.

 

Conclusiones

En el presente trabajo se demuestra que el protocolo de preparación del PRP descrito garantiza que los elementos celulares se mantienen de forma óptima hasta el momento de su utilización. El hecho de que las plaquetas sean activadas durante el acto quirúrgico y no antes, evita que los factores de crecimiento se pierdan en los procesos de preparación del concentrado o que se degraden de forma prematura.

 

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Dirección para correspondencia:
Concepción Sáez-Torres Barroso.
Banc de Teixits.
Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears.
C/ Rosselló i Caçador 20.
07004 Palma de Mallorca. Baleares, España
Email: bteixits@bstib.com

Recibido: 11.03.05
Aceptado: 28.05.07