ARTÍCULO CIENTÍFICO

 

Cultivo in vitro con colágeno y fibroblastos humanos de un equivalente de mucosa oral de espesor total*

In vitro culture with collagen and human fibroblasts of a full-thickness oral mucosa equivalent*

 

 

 

S. González Mendez¹, L.M. Junquera Gutiérrez², I. Peña González³, V. García Díaz⁴, L. Gallego López³, E. García Pérez⁴, A. Meana Infiesta⁵

1 Especialista en Cirugía Oral y Maxilofacial. Práctica Privada.
2 Profesor Titular Vinculado de Cirugía Oral y Maxilofacial. Universidad de Oviedo. Hospital Universitario Central de Asturias. España
3 Médico Residente. Servicio de Cirugía Oral y Maxilofacial. Hospital Universitario Central de Asturias. España
4 Bióloga. Banco de Tejidos.
5 Coordinador del Banco de Tejidos.
Centro Comunitario de Sangre y Tejidos del Principado de Asturias. Oviedo. España

* Premio "Beca de Investigación Básica, Dr. Gómez Iglesias"

Dirección para correspondencia

 

 

 

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RESUMEN

Objetivos. El presente trabajo tiene por objetivo obtener, mediante cultivo in vitro, láminas de tejido oral en las que se pueda identificar las estructuras de una mucosa oral completa. La aplicación clínica del presente estudio permitiría, en determinados casos, la sustitución del empleo de injertos libres de piel o autólogos de mucosa oral por esta técnica.
Material y Método. A partir de pequeñas biopsias de mucosa oral se hicieron cultivos primarios de queratinocitos. A partir de estos cultivos primarios se realizaron cultivos secundarios sobre una submucosa artificial constituida por colágeno y fibroblastos humanos. Se analizaron histológicamente sus características in vitro, y ulteriormente se procedió a la realización de injertos en ratones atímicos para conocer su comportamiento in vivo.
Resultados. Los cultivos primarios fueron confluentes en un plazo mínimo de 10 días y máximo de 12 días, periodo similar al observado para la confluencia de los cultivos secundarios. El tiempo transcurrido desde la toma de la muestra hasta la obtención de una mucosa artificial completa osciló entre los 20 y los 22 días, mostrando las características histológicas de una mucosa normal. Tras 17 días de injerto en ratones inmunoincompetentes, sin ningún tipo de contingencia clínica, la caracterización histológica e inmunohistoquímica (citoqueratinas 13 y 19, colágeno IV y laminina) confirmó la similitud de la mucosa in vitro con la mucosa oral sana.
Conclusión. Es posible mediante técnicas de cultivo in vitro la obtención de un equivalente de mucosa oral completa con colágeno y fibroblastos. Si bien esta mucosa muestra un importante grado de retracción, su manejo clínico es muy favorable.

Palabras clave: Cultivo in vitro; Colágeno; Fibroblastos; Mucosa Oral.

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ABSTRACT

Objectives. The objective of this study was to obtain, by in vitro culture, sheets of oral tissue in which complete oral mucosa structures can be identified. Clinical application of the findings of this study will allow the replacement of free skin grafts or autologous oral mucosa grafts by this technique in certain cases.
Material and Method. Primary keratinocyte cultures were prepared from small biopsy samples of oral mucosa. Secondary cultures were prepared from these primary cultures on an artificial submucosa constituted by collagen and human fibroblasts. The cell cultures were analyzed histologically in vitro and then used for graft implants in athymic mice to study their behavior in vivo.
Results. The primary cultures were confluent within a minimum period of 10 days and maximum of 12 days, which is similar to the period that the secondary cultures required to reach confluence. The time from sampling to achieving a complete artificial mucosa ranged from 20 to 22 days. The artificial mucosa showed histologic characteristics of a normal mucosa. After 17 days of graft implantation in immunoincompetent mice without any clinical contingency, histologic and immunohistochemical characterization (cytokeratins 19 and 13, collagen IV, and laminin) confirmed the similarity of the mucosa in vitro to healthy oral mucosa.
Conclusion. A complete oral mucosa equivalent can be prepared with collagen and fibroblasts using in vitro culture techniques. Although this mucosa shows considerable retraction, its clinical handling is very favorable.

Key words: In vitro cultive; Collagen; Fibroblasts; Oral mucose.

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Introducción

En 1975 Rheinwald y Green, describieron un método para cultivar láminas de tejido epitelial in vitro utilizando como células cebadoras una capa de fibroblastos de ratón (células 3T3) letalmente irradiados, en un medio que contenía suero fetal-bovino y factores de crecimiento celular. Consiguieron la primera línea de queratinocitos a partir de un teratoma de ratón.¹ Dos años más tarde publicaron la técnica para la obtención de queratinocitos humanos cultivados in vitro.² El epitelio humano autólogo obtenido mediante cultivo ha sido usado con éxito desde 1980 como cobertura permanente de grandes defectos cutáneos.^3-6 Es interesante remarcar que el epitelio trasplantado conserva las características del sitio donante. Actualmente esta técnica constituye una reconocida forma de tratamiento en grandes quemados.⁵

En 1990 De Luca y cols.⁴ utilizaron clínicamente mucosa oral obtenida mediante cultivo de queratinocitos procedentes del paladar, para el tratamiento de defectos gingivales de origen periodontal, demostrando la posibilidad de obtener grandes cantidades de epitelio cultivado capaces de mantener las propiedades de la zona donante, a partir de una biopsia de 1-3 mm². Ragoebar y cols.,⁷ utilizaron la técnica de cultivo in vitro de mucosa oral para cubrir defectos causados durante la realización de vestibuloplastias. En su trabajo, una mitad del área denudada fue cubierta con mucosa obtenida de manera convencional del paladar como injerto libre, y la otra mitad con mucosa palatina obtenida por cultivo. A los tres meses de la cirugía, la mucosa que recubría ambas mitades era similar a la mucosa palatina, sin objetivarse reacción contra el injerto obtenido mediante cultivo in vitro. Mediante microscopía de luz y electrónica, se demostró que ambos injertos formaban una mucosa totalmente diferenciada, comparable ultraestructuralmente con la del paladar.

Sin embargo, las dificultades para el transporte del cultivo, su fijación al lecho receptor, y su permanencia en el mismo ante los traumatismos del medio oral, limitan la aplicación clínica de esta técnica, por el exclusivo hecho de la fragilidad inherente a un tejido exclusivamente epitelial. Diversos autores han desarrollado modelos cutáneos en cultivo de espesor total, utilizando varios tipos de soporte dérmico,^8-12 demostrando un mejor comportamiento clínico de los mismos, con respecto al observado en los cultivos epiteliales aislados. En relación con la mucosa oral, las investigaciones en este sentido, son mas escasas.^13,14 El presente trabajo tiene los siguientes objetivos: 1. Elaborar una mucosa oral completa utilizando como soporte epitelial un gel de colágeno I y fibroblastos humanos. 2. Evaluar su comportamiento clínico mediante injerto en ratones inmunoincompetentes. 3. Caracterizar inmunohistoquímicamente su comportamiento tras 17 días de injerto.

 

Material y método

Cultivo primario de queratinocitos humanos

Se obtuvieron tres muestras de la mucosa oral en pacientes intervenidos en el Quirófano Ambulatorio del Servicio de Cirugía Oral y Maxilofacial de nuestro Centro, haciendo coincidir la toma de la muestra con el tratamiento quirúrgico bajo anestesia local, de una patología oral no maligna. La superficie de las muestras fue en todos los casos inferior a 0,25 cm². Todos los pacientes dieron su conformidad por escrito para la toma de la muestra, previa información documentada sobre la naturaleza del estudio. El procesamiento de las muestras, se realizó en las 4 horas siguientes a su recogida. Se dividieron mecánicamente hasta obtener fragmentos del menor tamaño posible. El material resultante se sometió a un proceso de digestión enzimática en 4 ml de Tripsina/EDTA (T/E) durante 30 minutos a 37º C y bajo agitación suave. Se recogió el sobrenadante, que fue centrifugado durante 10 minutos a 1400 rpm, de manera que las células suspendidas en el líquido se depositaran en el fondo del tubo de ensayo. El pellet resultante se diluyó en 0,5 ml de medio de cultivo para contar las células obtenidas. Las células obtenidas se cultivaron, a una densidad de entre 5.000 y 12.000 cel/cm² en placas de cultivo celular en presencia de fibroblastos de ratón (3T3; European Collection of Animal Cell culture 85022108) letalmente irradiados. Este medio se cambió cada 3 días. A partir del primer cambio se le añadieron al medio EGF (Factor de Crecimiento Epidérmico, Austral Biologicals). Los cultivos se mantuvieron en estufa con una atmósfera húmeda con un 5% de CO₂ a 37ºC.

Preparación de una submucosa artificial compuesta por colágeno y fibroblastos humanos

Se utilizó como fuente de colágeno, el obtenido a partir de tendones disecados de cola de rata Wistar. Éstas se mantuvieron en alcohol de 70º durante 2 horas y posteriormente se procedió a realizar la disección mediante técnica estéril. Una vez retirada la piel, los haces tendinosos de la cola se fueron separando cuidadosamente eliminando los vasos sanguíneos para asegurar la obtención de colágeno puro. Una vez individualizados, los tendones se dividieron en pequeñas piezas y se lavaron 2 veces en agua destilada. Posteriormente se secaron entre gasas estériles. El material así obtenido fue pesado y se disolvió en una proporción de 0,01% de ácido acético estéril (100 ml de solución por gramo de tejido). La solución conteniendo los haces tendinosos previamente preparados se incubó a 4º C bajo agitación suave un mínimo de 48 horas. Una vez completado el proceso de digestión la solución se centrifugó durante 30 minutos a 30.000 G y el pellet resultante fue liofilizado y almacenado en tubos estériles. La pureza del colágeno obtenido se estudió mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.

Los fibroblastos utilizados, se obtuvieron a partir de prepucios humanos de pacientes pediátricos intervenidos de fimosis en nuestro Centro, previo permiso de sus representantes legales. Estas muestras se fragmentaron mecánicamente y posteriormente fueron sometidas a un proceso de digestión enzimática con T/E bajo agitación mecánica. Cada 30 minutos se sustituyó la T/E utilizada por otra fresca y se centrifugaron durante 10 minutos a 1.400 rpm con el fin de recuperar las células obtenidas de la muestra. Se procedió a la siembra celular a una densidad de 100.000 cel/cm² en un medio de cultivo para fibroblastos. Cuando las células de este cultivo fueron confluentes se lavó el frasco de cultivo 2 veces con T/E, tras lo cual fue incubado a 37º C con T/E hasta que las células se despegaron del mismo. Se recuperaron las células y se sembraron en otros frascos de cultivo a una densidad de entre 5.000 y 10.000 cél/cm² (cultivo secundario). Los fibroblastos se mantuvieron mediante cultivos sucesivos o bien se congelaron en medio de congelación de fibroblastos para posteriores usos. Para la preparación del gel de colágeno y fibroblastos se utilizaron 0,8 ml de solución de colágeno con 0,1 ml de NaOH y 0,1 ml de Ham-F12 10X. A esta solución se añadieron los fibroblastos a una concentración aproximada de entre 30.000 a 50.000 cel/ml. Para una placa de 25 cm² se utilizaron 5 ml de gel. El material obtenido por cultivo según la técnica previamente descrita, se estudió histológicamente mediante fijación en formol al 10% y tinción con hematoxilina- eosina.

Experimentación animal

Se procedió al injerto de los cultivos obtenidos en tres ratones atímicos (BALD/ c nu/un ) según la técnica descrita por Barrandon y cols.¹⁵ (Fig. 1). A los 17 días del injerto, se procedió al sacrificio del animal y biopsia del tejido injertado para su análisis histológico. El análisis inmunohistoquímico se realizó con kits para citoqueratinas 13 y 19, colágeno IV y laminina. En la figura 2 se recoge de manera esquemática, las principales etapas del trabajo.

Resultados

Cultivos primarios

A los tres o cuatro días del cultivo fue posible comprobar el inicio de la formación de colonias de queratinocitos, rodeadas por fibroblastos 3T3. A partir de la primera semana de cultivo se objetivó el rechazo de estos últimos hacia la periferia de las colonias, disminuyendo de forma considerable su número. En el momento de la confluencia de las colonias epiteliales no fue posible observar la presencia de fibroblastos 3T3 (Fig. 3). Los cultivos primarios fueron confluentes en un plazo mínimo de 10 días y máximo de 12 días, y en este momento se procedió a la realización del cultivo secundario sobre el gel de colágeno y fibroblastos elaborado. Se obtuvieron aproximadamente 1000 células por cada célula cultivada en este plazo.

Cultivos secundarios

Los cultivos secundarios también fueron confluentes a los 10 días, momento en el que fueron fijados para su estudio histológico. Durante este tiempo, y desde los primeros momentos del cultivo, se pudo observar la existencia de un rápido proceso de retracción de los queratinocitos sobre el gel de colágeno. En todo caso, el tiempo transcurrido desde la toma de la muestra hasta la obtención de una mucosa artificial completa con colágeno y fibroblastos humanos osciló entre los 20 y los 22 días.

Al analizar histológicamente el material obtenido pudimos apreciar la existencia de un epitelio continuo de células cuboideas similares a las que podemos encontrar en la capa basal del epitelio oral normal. En algunas zonas, el epitelio presentaba dos o tres filas de células, pero ningún signo de queratinización (Fig. 4). Subepitelialmente, se podía reconocer la existencia de fibroblastos en forma estrellada y con uniones entre ellos. También resultaba evidenciable la presencia de haces que se tiñen de forma semejante a los del colágeno distribuidos de forma anárquica y de un pobre entramado vascular.

Experimentación animal

Los animales se mantuvieron vivos durante 17 días. Durante este tiempo ningún ratón presentó complicaciones directamente relacionadas con el acto quirúrgico ni ajenas a éste. El análisis microscópico a pequeño aumento de la unión entre el tejido injertado y los tejidos de ratón, reveló la continuidad de la misma. En la porción epitelial se advierten múltiples capas de células. A mayor aumento, fue posible apreciar que las capas celulares están organizadas de forma similar a una mucosa oral no queratinizada normal. En algunas áreas, se objetivó una cierta desorganización del epitelio (Fig. 5). En ninguno de los injertos se observó queratinización, poniéndose de manifiesto la presencia de núcleos incluso en las capas más distales de queratinocitos. En el tejido subepitelial era apreciable la abundante presencia de fibroblastos proliferantes en el seno de los geles. No fue posible reconocer la presencia de papilas, aunque si se aprecian en algunas zonas ligeras invaginaciones de tejido epitelial en la submucosa.

La tinción frente a citoqueratina 13 fue positiva en todas las capas del epitelio, mientras que para la citoqueratina 19 observamos la existencia de áreas limitadas de inmunomarcaje. Mientras que frente al colágeno IV se observó una marcada tinción en la submucosa y en las capas más basales de la porción epitelial, el inmunomarcaje para la laminina se localizó en la porción basal del epitelio (Fig. 6).

 

Discusión

Los primeros intentos de cultivo in vitro de queratinocitos presentaban como grandes inconvenientes: 1. La importante retracción que se observaba al despegar el tejido cultivado del frasco de cultivo. 2. La extrema delgadez del injerto, fruto de su exclusiva constitución epitelial. 3. La fragilidad del tejido una vez injertado que podría conllevar su precoz pérdida. Todos ellos están relacionados directamente con la ausencia de un soporte adecuado para la constitución de una membrana basal normal y la completa y adecuada diferenciación del tejido epitelial.¹⁶

Con el fin de solventar estos problemas, las investigaciones se dirigieron a dotar a los cultivos de células epiteliales de un soporte conjuntivo.^17,18 Los distintos autores propusieron diferentes sistemas que podemos agrupar en: 1. Uso de dermis criopreservada de cadáver, transplantándola previamente al lecho receptor del injerto.¹⁹ 2. Empleo de estructuras sintéticas tridimensionales de materiales reabsorbibles como soporte de fibroblastos autólogos, o como dermis acelular.²⁰ 3. Síntesis in vitro de un soporte que posibilitara el crecimiento y desarrollo de fibroblastos humanos, realizado con las proteínas que constituyen la dermis. ²¹ En el momento actual, es este último sistema el que concita los mayores esfuerzos investigadores por parte de la comunidad científica. Así, se han utilizado diferentes geles sintetizados a partir de proteínas humanas como colágeno tipo I, glicosaminoglicanos y fibrina.²² Otra línea de trabajo va encaminada a obtener una base proteica conteniendo fibroblastos vivos. Es conocido el hecho de que en el desarrollo normal de los tejidos epiteliales la síntesis de las proteínas de la membrana basal (laminina y colágeno IV) corresponde a los queratinocitos, pero el otro componente de la membrana basal, las fibrillas de anclaje, no se sintetizan en ausencia de los fibroblastos de la dermis. Se ha podido demostrar que los fibroblastos humanos mantenidos en un gel de fibrina son capaces de sintetizar las mismas sustancias que in vivo, y por tanto servir como soporte al crecimiento de los queratinocitos.²³ En nuestro estudio, la elaboración de la submucosa de colágeno, fue técnicamente sencilla y rápida pero generaba una importante retracción de los cultivos, que se inicia en las primeras 48 del cultivo secundario y representa al final una importante reducción en el tamaño del injerto a utilizar. Similar observación ya fue enfatizada por otros autores que han producido mucosa oral completa utilizando el colágeno como proteína de soporte.²² Sin embargo, el despegamiento de los cultivos realizados sobre gel de colágeno y fibroblastos humanos, resulta extraordinariamente fácil, incluso en algunos casos este despegamiento se produce de forma espontánea. La gran resistencia del soporte submucoso nos permitió, en todo momento, una manipulación perfecta, sin precisar de ningún cuidado especial.

En el estudio microscópico de la mucosa oral tras su injerto pudimos identificar la existencia de pequeñas áreas desestructuradas, con degeneración hidrópica. Aunque algunos autores,²⁴ defienden una desfavorable evolución del injerto en estas zonas, la caracterización inmunohistoquímica de las mismas en nuestro trabajo no mostró diferencias con respecto a la mucosa cultivada sin alteraciones estructurales. El aspecto microscópico de la submucosa permitió observar la existencia de una pobre vascularización subepitelial constituida por vasos de pequeño calibre, que, sin embargo, no condicionó ni limitó el desarrollo de la capa epitelial. Es posible que el colágeno, a diferencia de la fibrina, no promueva la incorporación de nuevos vasos hacia el área lesionada.

La citoqueratina 13 (K13), se expresan típicamente en las células suprabasales del epitelio oral, tanto queratinizado como no queratinizado, manifestando también en las células de la mucosa oral fetal una fuerte positividad. En nuestras muestras también mostró una fuerte positividad, tal vez justificable por el proceso de diferenciación en el que se encontraban, tras 17 días de injerto. La citoqueratina 19 (K19), es un marcador típico de la mucosa no queratinizada, que también se expresó en nuestras preparaciones, incluyendo a los queratinocitos situados en las capas suprabasales en las áreas de epitelio más desorganizado.

Según diversos autores,^22,25 a las tres semanas del cultivo, se produce una normalización completa de la estructura de la membrana basal. Esto supone un depósito regular de colágeno IV y laminina, y contactos estables epitelio-tejido conjuntivo, establecidos por la intermediación de la integrina alfa-6- beta-4. Esta regularización es fundamental para obtener un fenotipo normal en la mucosa artificial. En nuestro trabajo, tras 17 días de injerto, la tinción inmunohistoquímica fue positiva frente al colágeno IV y laminina.

En definitiva, el presente estudio pone en evidencia que el gel de colágeno supone un buen soporte para el crecimiento de los fibroblastos y de los queratinocitos orales. La síntesis del gel es muy sencilla y predecible. Su manejo es extraordinariamente fácil y no precisa demasiadas precauciones. No obstante, la retracción que se produce es muy importante, lo que dificulta la obtención de una cantidad grande de tejido, que es uno de los objetivos de la técnica. A pesar de esto, también hemos observado que, este proceso de retracción se detiene en el momento del injerto, conservando el tejido injertado su diámetro en el momento del sacrificio de los animales.

 

Agradecimientos

A la Sociedad Española de Cirugía Oral y Maxilofacial e industrias Tarma S.A., por el apoyo prestado para la realización de este trabajo (Beca de Investigación Básica Dr. Gómez Iglesias).

A la Ficyt (Eva García Pérez) y MBA (Verónica García Díaz) por su apoyo técnico.

 

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Dirección para correspondencia:
L.M. Junquera
Universidad de Oviedo. Escuela de Estomatología
Catedrático José Serrano s/n
33009 Oviedo. España
E-mail: Junquera@uniovi.es

Recibido: 15.11.07
Aceptado: 28.01.09