REVISIONES

 

Inmunoterapia genética con células dendríticas para el tratamiento del cáncer

Dendritic cells in cancer immunotherapy

 

 

M. Gato, T. Liechtenstein, I. Blanco-Luquín, M.I. Zudaire, G. Kochan y D. Escors

Navarrabiomed-Fundación Miguel Servet

Agradecer a los organismos y asociaciones que financian nuestro trabajo, incluyendo al Instituto de Salud Carlos III, a BD Bioscience y la Fundación Sandra Ibarra por su apoyo, al Gobierno de Navarra y al Gobierno Vasco por la financiación proporcionada.

Dirección para correspondencia

 

 

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RESUMEN

Desde comienzos del siglo XX, los científicos han intentado aprovechar las actividades naturales del sistema inmunológico para curar el cáncer. Sin embargo, las inmunoterapias no han dado el resultado clínico que podría haberse esperado. De hecho, lo tratamientos anti-neoplásicos clásicos como la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia siguen consistiendo en la primera línea de tratamiento. Aun así, existe un gran número de evidencias experimentales sobre la inmunogenicidad de las células cancerosas. Sin embargo, la activación efectiva de las respuestas T anti-cancerosas depende estrechamente de la presentación eficiente de antígenos tumorales por parte de células presentadoras de antígeno profesionales, como las células dendríticas (dendritic cells, DC). Aunque se han desarrollado un gran número de estrategias para reforzar las funciones de presentación de antígeno de las DC, la inmunoterapia como tratamiento anti-neoplásico todavía no es tan efectiva como esperaríamos de acuerdo con los resultados obtenidos en modelos preclínicos durante las últimas décadas. En este trabajo no pretendemos revisar exhaustivamente la inmunoterapia con DC, un campo ampliamente extenso y tratado en otras revisiones especializadas. Aquí se exponen la experiencias que nuestro grupo ha llevado a cabo durante la última década modificando genéticamente a las DC para mejorar su eficacia anti-tumoral.

Palabras clave: Terapia génica. Lentivectores. Inmunología. Células dendríticas.

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ABSTRACT

Since the beginning of the 20th century, biomedical scientists have tried to take advantage of the natural anti-cancer activities of the immune system. However, all the scientific and medical efforts dedicated to this have not resulted in the expected success. In fact, classical antineoplastic treatments such as surgery, radio and chemotherapy are still first line treatments. Even so, there is a quantity of experimental evidence demonstrating that cancer cells are immunogenic. However, the effective activation of anti-cancer T cell responses closely depends on an efficient antigen presentation carried out by professional antigen presenting cells such as DC. Although there are a number of strategies to strengthen antigen presentation by DC, anti-cancer immunotherapy is not as effective as we would expect according to preclinical data accumulated in recent decades. We do not aim to make an exhaustive review of DC immunotherapy here, which is an extensive research subject already dealt with in many specialised reviews. Instead, we present the experimental approaches undertaken by our group over the last decade, by modifying DC to improve their anti-tumour capacities.

Keywords: Genetic therapy. Lentiral vectors. Inmunology. Dendritics cells.

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Introducción

La idea de que el sistema inmunitario tiene capacidades anti-cancerosas no es nueva. Paul Ehrlich al comienzo del siglo XX propuso su teoría de vigilancia inmunológica también para el cáncer. Según Ehrlich, las células tumorales aparecían espontáneamente en el organismo y el sistema inmunitario las eliminaba. De hecho, parece ser que la eficacia de los tratamientos clásicos también recae en gran medida en la activación de respuestas inmunológicas tras la liberación de moléculas inmunoestimuladoras procedentes de células necróticas^1-5.

La eficacia de la inmunoterapia contra el cáncer depende de la inmunogenicidad de las células tumorales para inducir respuestas T citotóxicas. Por lo tanto, las células cancerosas deberían expresar antígenos inmunogénicos susceptibles de convertirse en dianas terapéuticas. Las primeras inmunoterapias ya en los años 60 se dirigieron contra antígenos virales expresados por virus oncogénicos. Sin embargo, solo un número bajo de cánceres humanos son provocados por infecciones virales. De hecho, la teoría de la etiología viral de los cánceres no podía explicar las respuestas inmunológicas generadas contra tumores inducidos químicamente, o las regresiones espontáneas de cánceres en personas vacunadas contra patógenos comunes o por administración de adyuvantes. Estos resultados demostraban la existencia de antígenos tumorales de origen no viral⁶.

Con el paso del tiempo se descubrió que las células cancerosas acumulaban mutaciones transformantes que resultaban en inestabilidad genética, incremento de supervivencia celular y proliferación incontrolada^7-13. Muchas de las proteínas afectadas en estas mutaciones son factores de transcripción (c-myc), moléculas de señalización intracelular (ras), reguladores de división celular (Rb) y anti-oncogenes (p53). La proliferación incontrolada y los defectos en la reparación del ADN celular provocan aún más mutaciones, que dan lugar a la expresión aberrante de proteínas celulares (mutadas o no), confiriendo inmunogenicidad a las células cancerosas.

 

Identificación de antígenos tumorales humanos

Desde los años 50, se han identificado un gran número de antígenos tumorales capaces de activar respuestas T citotóxicas⁶, por ejemplo, la sobreexpresión de tirosinasa en melanomas^14-20. En los años 90 se clonaron las proteínas relacionadas con la tirosinasa 1 y 2 (TRP-1, TRP-2), ambas sobreexpresadas en melanoma^21-25, y con alto interés terapéutico^26,27. Los antígenos carcinoembrionarios (CEA) se identificaron indirectamente en los años 60^28,29, identificándose en los 90 varios péptidos antigénicos CD8 y CD4^30,31 utilizados en inmunoterapia humana³². Otros antígenos de alto interés son los asociados a melanoma (MAGE), expresados en una gran variedad de cánceres³³. Estos antígenos contienen múltiples epítopos inmunogénicos utilizados con éxito³⁴. El antígeno gp100 se identificó en 1988³⁵, conteniendo varios epítopos T^19,36. NY-ESO-1 se aisló a partir de un carcinoma escamoso de esófago³⁷. Dada su frecuente expresión en varios tumores, es uno de los antígenos más relevantes para inmunoterapia humana^38,39. MART-1 se clonó en 1994 a partir una línea de melanoma humano⁴⁰, y se utiliza frecuentemente en vacunas contra melanoma^19,20,41,42.

En conclusión, los cánceres son ciertamente inmunogénicos, y expresan antígenos tumorales reconocidos por linfocitos T CD4 y CD8 autólogos. Sin embargo, el éxito clínico de la inmunoterapia es sorprendentemente bajo. Los tumores suelen reaparecer tras su escape del sistema inmunitario. Algunos de estos mecanismos incluyen la selección de variantes celulares que han perdido la expresión de los antígenos inmunogénicos, o que han disminuido la expresión de moléculas de presentación de antígenos MHC (major histocompatibility complex molecules, MHC). Adicionalmente, los tumores expanden células inmunosupresoras que favorecen la metástasis y la progresión tumoral. Todos estos mecanismos suponen las barreras más importantes a superar en inmunoterapia.

 

Activación de los linfocitos T citotóxicos durante la presentación de antígeno

La activación de linfocitos específicos frente a antígenos tumorales es francamente un reto. Estos antígenos se expresan en bajos niveles, lo que causa una presentación subóptima a los linfocitos T. En esta situación, los linfocitos que reconocen estos antígenos se diferencian hacia linfocitos T reguladores (Tregs)^43,44. Generalmente, para su activación, los linfocitos reconocen a través de su TCR (receptor del linfocito T) péptidos antigénicos asociados a las moléculas MHC y expuestos en la superficie de las DC. Este reconocimiento no es suficiente para activarlos, y requieren otro tipo de interacciones entre un número de receptores y ligandos en la sinapsis inmunológica. La integración de estas interacciones se denomina co-estimulación (o señal 2). El tipo de citoquinas presentes durante la presentación de antígenos proporciona una tercera señal necesaria para la diferenciación de los linfocitos T en distintos tipos (Fig.1).

 

 

En general, las DC inmaduras son poco inmunogénicas dada la baja expresión de moléculas co-estimuladoras en su superficie. Sin embargo, la expresión de estas moléculas aumenta fuertemente tras el reconocimiento de moléculas derivadas de patógenos. En este proceso de "maduración" de las DC⁴⁵ se transforman en fuertemente inmunogénicas. En el caso de los antígenos tumorales, los péptidos tumorales suelen derivarse de proteínas endógenas expresadas aberrantemente, o con mutaciones. Por lo tanto, en condiciones fisiológicas no existen moléculas derivadas de patógenos que activen a las DC. Además, la frecuencia de los linfocitos T específicos de antígenos endógenos es baja, ya que se eliminan en el timo durante su diferenciación. Las células T autoreactivas circulantes que han escapado de la delección clonal en el timo poseen TCRs de baja afinidad, o se han diferenciado a Tregs para preservar la tolerancia inmunológica⁴⁶.

 

Inmunoterapia contra el cáncer con células dendríticas

Las DC son las células presentadoras de antígeno más eficaces e ideales para la inmunoterapia. Las DC se diferencian con facilidad a partir de médula ósea de ratón utilizando GM-CSF recombinante, y también de monocitos humanos^47,48. Estos métodos de producción ex vivo aceleraron el progreso de la inmunoterapia basada en DC, ya que su número dejó de ser un factor limitante. Las DC diferenciadas son fenotípica y funcionalmente inmaduras, lo que facilita su manipulación. Como uno de los grandes problemas de la inmunoterapia contra el cáncer es la activación ineficiente de células T efectoras, la vacunación con DC parece de las mejores opciones. La potenciación de sus capacidades endógenas de presentación de antígenos podría romper la tolerancia natural contra antígenos tumorales endógenos.

La producción a gran escala de DC permitió su aplicación directa en vacunación, tras la incubación con antígenos tumorales, ya sea en forma de péptidos o a partir de lisados tumorales⁴⁹. Otra ventaja de la producción ex vivo de DC es la facilidad con las que se pueden modificar genéticamente con vectores virales y no virales^45,49-51. Además, como su estado de maduración se puede controlar con relativa facilidad^1,41,51-53, las DC son ideales para inmunoterapias. Las DC generadas ex vivo se han utilizado para generar respuestas T contra agentes infecciosos^52,54-57 y cáncer^{41,49,52,58-60}. Los resultados preclínicos en inmunoterapia con DC generadas ex vivo han proporcionado datos muy relevantes⁴⁹. Sin embargo, en algunos casos estos resultados no se han trasladado con el éxito esperado a pacientes humanos^61-63. Para poder responder a esta aparente contradicción, nuestro grupo de investigación ha estudiado las rutas de señalización intracelular en DC durante los últimos 6 años, para controlar las funciones inmunogénicas de las DC utilizando herramientas de terapia génica.

 

Activación constitutiva de rutas de señalización intracelular en células dendríticas

Durante una infección, las moléculas derivadas de los patógenos se unen a receptores en las DC que reconocen patrones moleculares de patógenos, causando su maduración. Ese es el papel que juegan los adjuvantes en la formulación de las vacunas clásicas. En nuestro grupo, postulamos que podría ser posible modificar las actividades de las DC mediante la activación de rutas de señalización intracelular controladas por este tipo de receptores de patrones moleculares de patógenos, mediante modificación genética.

Cuando estos receptores se unen a sus ligandos, activan una red de cascadas de señalización intracelular que convergen en la activación de un número relativamente pequeño de rutas. De éstas, las cuatro principales son la ruta NF-κB, las proteína kinasas activadas por mitógenos (MAPK) y los factores reguladores de interferón (IRF) (Fig. 2A). Estas rutas regulan la expresión de MHC y moléculas coestimuladoras, así como la producción de citoquinas. Aun así, estas rutas también activan mecanismos reguladores terminadores de estas señales (negative feedback)^64,65. En situaciones fisiológicas, estos mecanismos inhibitorios aseguran un control de la inflamación que protege al organismo. Sin embargo, en el contexto de la inmunoterapia contra el cáncer, estos mecanismos son contraproducentes.

 

 

Modulación de rutas intracelulares de señalización para controlar las funciones de las células dendríticas

Nuestro grupo de investigación decidió expresar mutantes constitutivamente activos de estas rutas de señalización, eligiendo moléculas resistentes a la actividad de proteínas inhibitorias como las fosfatasas de MAPK.

Una de las primeras rutas que se modularon genéticamente en DC fue la ruta de NF-κB, una familia de factores de transcripción que transactivan un gran número de genes inflamatorios. La expresión de la proteína de herpesvirus vFLIP (un activador constitutivo de NF-κB) con lentivectores resultó en maduración de las DC⁶⁶, y se demostró un incremento en supervivencia en un modelo de ratón de linfoma utilizando estas DC como vacunas celulares⁶⁶.

La ruta de las MAPK se divide en tres clases/ p38, c-jun N-terminal kinases (JNK) y kinasas reguladas por señales extracelulares (ERK). Decidimos comprobar los efectos de la activación constitutiva de MAPK p38. Para ello expresamos en DC con lentivectores un mutante de la MAPK MKK6 que fosforilaba constitutivamente a p38, resistente a las fosfatasas⁴¹. La vacunación con lentivectores expresando este mutante estimuló significativamente las repuestas T contra un antígeno modelo no tumoral, y contra NY-ESO-1 en un modelo humanizado de ratón ⁴¹. La activación genética de p38 en DC humanas también estimuló la proliferación de linfocitos CD8 específicos para MART-1. Estas vacunas lentivirales mostraron eficacia como terapia contra linfoma en un modelo de ratón⁴¹. De una manera similar se activó la ruta JNK1, mejorando de nuevo las respuestas T, aunque no llegamos a probarla como terapia en modelos preclínicos de cáncer⁴¹.

También expresamos con lentivectores un mutante de MEK1 que interfería con la activación por fosforilación de ERK en DC. Pensamos que al ser la ruta ERK inmunosupresora, su interferencia podría estimular las funciones de las DC. Y así fue. La inhibición de ERK en DC incrementó sustancialmente las respuestas T en modelos de ratón, y en combinación con un RNA silenciador de la molécula PD-L1 resultó muy eficaz como terapia anti-linfoma en un modelo de ratón^52,58,67.

 

Modulación de la coestimulación para mejorar las respuestas inmunitarias contra el cáncer

Recientemente se han desarrollado terapias con anticuerpos bloqueantes de la interacción entre PD-L1 (expresado con cierta frecuencia en tumores) con PD-1 expresado en la superficie de los linfocitos T. Esta interacción es fuertemente inhibitoria, y se ha demostrado que la inmunoterapia puede llegar a ser muy efectiva contrarrestándola con anticuerpos. Este es un tema muy extenso y prometedor desde un punto de vista terapéutico, ampliamente revisado⁶⁸. Nuestro equipo desarrolló, un sistema de lentivectores para expresar una colección de citoquinas junto con un RNA silenciador de PD-L1, y el antígeno tumoral TRP1 (Fig. 2B). Solo la expresión de IL12 en combinación con el silenciamiento de PD-L1 resultó eficaz para el tratamiento de melanoma en ratón⁶⁷. Esto era en parte debido a las propiedades anti-immunosupresoras de IL12 en las células mieloides supresoras (myeloid-derived suppressor cells, o MDSC)⁶⁷.

 

Consideraciones finales

La inmunoterapia está comenzando a dar resultados significativos recientemente^69,70, pero todavía queda mucho camino por recorrer. Cada vez hay más evidencias experimentales que sugieren que la eficacia de los tratamientos anti-neoplásicos convencionales recaen en gran parte en la activación colateral del sistema inmunológico^2,3. La modificación genética de las células presentadoras de antígeno para activarlas constitutivamente podría mejorar su eficacia inmunoestimuladora.

 

Agradecimientos

Los autores quisieran agradecer a todo el personal de Navarrabiomed-FMS y al Complejo Hospitalario de Navarra.

 

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Dirección para correspondencia:
David Escors
Navarrabiomed-Fundación Miguel Servet
Recinto hospitalario
31008 Pamplona
E-mail: descorsm@navarra.es

Recepción: 24 de noviembre de 2014
Aceptación provisional: 25 de febrero de 2015
Aceptación definitiva: 10 de marzo de 2015