Preparación de la matriz extracelular y propiedades bioestructurales

La matriz extracelular (MEC) es diseñada y producida por las células residentes de cada tejido y órgano, encontrándose en un estado de equilibrio dinámico con su entorno (9). La estructura y función molecular de la MEC proporciona los medios por los cuales las células adyacentes se comunican entre ellas y con el ambiente externo (10). Además, proporciona un medio de soporte para nervios, vasos sanguíneos y linfáticos, y para la difusión de nutrientes (9). No se ha caracterizado completamente la compleja organización tridimensional de la estructura y función molecular que compone la MEC, haciendo imposible la síntesis de este biomaterial en el laboratorio (11). Se han usado varias formas de MEC como matrices biológicas para promover la remodelación de tejidos y órganos, incluyendo piel, intestino, hígado y páncreas, entre otros tejidos (9). Muchas de estas MEC se han comercializado para aplicaciones terapéuticas variadas.

Las características microscópicas y estructurales de la matriz juegan un papel importante en la modulación de las células que la contactan, controlando su habilidad para migrar en la MEC o influyendo sobre un fenotipo celular específico (11). La estructura y arquitectura tridimensional de la MEC se puede preservar a través de procesos que requieren la eliminación de las células (11). La preparación de la MEC, a partir de un tejido, se realiza durante varias etapas que pueden afectar sustancialmente la bioestructura del aloinjerto y el tipo de respuesta inflamatoria e inmunológica del huésped (9). El tejido donante a partir del cual se prepara la MEC debe ser separado mecánicamente de estructuras tisulares indeseables. Diferentes bancos tisulares han empleado procesos y protocolos distintos para asegurar una desinfección y esterilización apropiada de los aloinjertos. No existe un proceso de esterilización mandatorio que sea exigido por la administración de alimentos y drogas de los Estados Unidos (FDA). Cada banco tisular utiliza una combinación compleja de técnicas patentadas incluyendo irradiación, remojo y lavado con antibióticos, liofilización y criopreservación, entre otras. Después de llevar a cabo estos protocolos, se efectúa con frecuencia una esterilización terminal mediante irradiación gamma o con óxido de etileno.

También existe gran variedad de formas para obtener la MEC de los tejidos y eliminar el contenido celular (9). La remoción de componentes antigénicos asociados con las membranas celulares y componentes intracelulares de órganos y tejidos es fundamental para disminuir o evitar una respuesta inmunológica adversa (9).

El principal objetivo de cualquier protocolo de descelularización es remover todo el material celular sin afectar la composición, integridad mecánica y actividad biológica de la MEC remanente (9). Después de eliminar el contenido celular mediante alguno de los métodos utilizados (sonificación, agitación, congelación y descongelación), se realiza un enjuague y remoción de las células remanentes en la MEC (11). Algunos detergentes usados en este proceso pueden dañar el colágeno, alterando las propiedades mecánicas de la MEC (12). Lovekamp y cols. (13), demostraron que la remoción de las glucosaminas del aloinjerto puede tener un efecto negativo sobre el comportamiento viscoelástico del tejido, debido a que una de sus mayores características funcionales es la retención de agua.

A raíz del proceso de eliminación de células y esterilización, muy pocos aloinjertos mantienen un estado de hidratación (9). Se pueden prevenir cambios en la estructura tisular, tales como el colapso de las fibras colágenas y la formación de adherencias físicas entre las moléculas de la matriz, impidiendo la pérdida de agua (11). Microscopía electrónica de matrices hidratadas y liofilizadas demuestran cambios en la arquitectura tisular después de la remoción del agua (9). Los aloinjertos que conservan su hidratación después del proceso de eliminación de células y esterilización tienden a presentar in vitro mejor adhesión e infiltración celular que las matrices sometidas a deshidratación y rehidratación (14). Sin embargo, la mayor desventaja de los materiales hidratados, es la filtración continua de factores de crecimiento solubles desde el aloinjerto durante su proceso de almacenamiento (9).

Los aloinjertos son deshidratados con frecuencia mediante liofilización antes de la esterilización final. La deshidratación favorece la manipulación de los injertos y limita la pérdida de factores de crecimiento durante el almacenamiento (11). Algunos investigadores han documentado cambios bioestructurales de aloinjertos procesados mediante liofilización. Es así como Freytes y cols. (14), observaron que la liofilización disminuye in vitro la máxima elongación de las matrices, alterando la morfología de las fibras colágenas y el crecimiento de las células sobre el injerto. Adicionalmente, matrices liofilizadas almacenadas a temperatura ambiente o refrigeradas por períodos superiores a un año, mostraron un incremento en la carga y rigidez máxima, y un aumento en la elongación máxima, respectivamente (15). Por otra parte, Gilbert y cols. (16), encontraron que la liofilización disminuye significativamente el espesor de la matriz pero también reduce la habilidad del material para reabsorber la misma cantidad de agua que estuvo presente antes de someterse al proceso de liofilización, debido a la remoción de glucosaminas. Algunos bancos tisulares combinan antibióticos y liofilización, sin embargo, la contaminación bacteriana puede ser reducida pero no completamente eliminada mediante lavado con soluciones antibióticas (17). Además, antes de realizar la intervención, es necesario evaluar si el paciente es alérgico a los antibióticos usados.

Diferentes estudios han indicado que la esterilización final de los aloinjertos también puede tener un efecto perjudicial sobre sus propiedades bioestructurales (9, 18-20). Recientemente, se demostró una disminución de las propiedades mecánicas de la MEC después de la exposición a óxido de etileno, irradiación electrónica e irradiación gamma (18). Gouk y cols. (19), estudiaron los efectos de la irradiación gamma sobre el Alloderm^®, encontrando que dosis menores a 15 kGy (dosis gamma baja) incrementa la solidez de las matrices dérmicas y no afecta la proliferación de fibroblastos in vitro, sin embargo, sus propiedades se minimizan en dosis gamma superiores, ocasionando reducción significativa de la elasticidad del aloinjerto y mayor susceptibilidad a la degradación proteolítica, influyendo en la síntesis y depósito de nuevo colágeno (19). Estos resultados fueron corroborados por Balsly y cols. (20), utilizando aloinjertos de tejidos blandos y duros, pero empleando un punto de corte superior para la irradiación gamma baja (18,3-21,8 kGy). No se ha estudiado detalladamente el mecanismo que ocasiona cambios en las propiedades bioestructurales después de usar oxido de etileno e irradiación electrónica (9), pero se han documentado reacciones tisulares del huésped cuando se usan aloinjertos tratados con oxido de etileno (21).

Presencia de material genético en los aloinjertos

Los donantes de aloinjertos son examinados para evaluar la presencia de algunas patologías y los tejidos donados son especialmente procesados para prevenir la transmisión de enfermedades. Los donantes son serológicamente evaluados para enfermedades virales tales como VIH, hepatitis B y C, citomegalovirus, virus linfotrófico-T humano y sífilis. Posteriormente se determina la carga bacteriana en el injerto y se descarta cualquier tejido que presente niveles altos de contaminantes o niveles microbianos elevados. Sin embargo, es posible encontrar patógenos e infecciones en los aloinjertos a pesar de someterse a procesos de evaluación rigurosos, debido principalmente a las limitaciones de la metodología de evaluación (22). La liofilización es un proceso que disminuye la inmunogenicidad de los tejidos removiendo el agua inter e intra molecular, mediante sublimación a temperaturas y presiones bajas (9), sin embargo, se ha informado la inhabilidad de este proceso para inactivar completamente el VIH (23, 24). En el año 2004 un estudio evaluó las tasas de virulencia en los tejidos donados en Estados Unidos (25). La prevalencia de pruebas positivas confirmadas en los aloinjertos fue: 0,093% para anti-VIH, 0,22% para antígeno de hepatitis B, 1,091% para antivirus hepatitis C, y 0,068% para antivirus linfotrófico-T. Los autores concluyeron que las tasas de prevalencia de infecciones por los virus mencionados anteriormente, son inferiores en los donantes de tejidos, comparados con la población general. Sin embargo, la probabilidad de virulencia no detectada en el momento de la donación de tejido es más alta en los donantes de tejidos que en los donantes de sangre. Además, un patógeno puede ser transmitido durante el período de ventana inmunológica, etapa en el cual es serológicamente indetectable (26), posibilidad que es remota si se aplica un examen de ácidos nucleicos (27, 28). Sin embargo, el examen de ácidos nucleicos disminuye esta fase a aproximadamente siete días para VIH e infecciones con virus de hepatitis C y a ocho días para infección con virus de hepatitis B (28). Además, solamente desde agosto de 2007, se requiere el examen de ácidos nucleicos como parte de las regulaciones de la administración de drogas y alimentos de los Estados Unidos (FDA), aunque es aplicado desde el 2005 por la Asociación Americana de Bancos Tisulares (AATB) (28).

Desafortunadamente, los donantes no son examinados para la presencia de otros ADN virales (papilomavirus y virus herpes) con inmenso potencial para transmitir un espectro amplio de enfermedades (27). Igualmente, algunas patologías de aparición reciente transmitidas por priones, no pueden ser evaluadas adecuadamente por la carencia de pruebas serológicas apropiadas (29).

Los protocolos de procesamiento tisular humano varían ampliamente pero la mayoría incluye una solución de inactivación viral (27). Sin embargo, el ADN viral que se incorpora en el genoma del huésped puede ser transmitido si el ADN permanece intacto y funcional en el aloinjerto (27). Choe y Bell (30), determinaron la presencia de material genético en aloinjertos procesados comercialmente (Alloderm^® y Faslata^®).

Se evaluaron 16 muestras de dos tipos de aloinjertos cadavéricos humanos (dérmicos acelulares y fascia lata) liofilizados y gama irradiados. Todas las muestras fueron sometidas a extracción del ADN y se utilizó reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificarlo. Además, se efectuó espectrofotometría para cuantificar y electroforesis para determinar el tamaño de los fragmentos de ADN. El promedio de concentración de ADN en los injertos de fascia lata y dérmicos fue 258,3 ± 80,1 y 272,8 ± 168,8 μg/gm por tejido, respectivamente. Igualmente, Hathaway y Choe (27), determinaron la presencia, cuantificaron la concentración y evaluaron la longitud del ADN, en aloinjertos cadavéricos humanos disponibles comercialmente, mediante el mismo protocolo empleado en el estudio descrito anteriormente. Se evaluaron 10 muestras de cada una de las siguientes marcas comerciales: Mentor Corp., Musculoskeletal Transplant Foundation, Regeneration Technologies y Life Cell Corp. Los injertos cadavéricos se procesaron después de obtener los tejidos de los donantes. El aloinjerto Tutoplast^® procesado por Mentor es descelularizado, gama irradiado y tratado con peróxido de hidrógeno, hidróxido de sodio y acetona. Musculoskeletal Transplant Foundation procesa sus injertos remojándolos en gentamicina y agua estéril, y mediante liofilización. Regeneration Technologies los introduce en povidona-yodo, tratados con ácido ascórbico y procesados por liofilización. La dermis cadavérica Alloderm^® de Life Cell Corp. es descelularizada, inactivada para virus y liofilizada. De las 40 muestras evaluadas 39 contenían segmentos de ADN entre 400 y 2000 pares de bases (pb). Varió ampliamente la cantidad individual, sugiriendo heterogeneidad en la obtención o procesamiento de los tejidos en las diferentes marcas comerciales. Basado en la espectrofotometría, no se observaron diferencias significativas en la cantidad de ADN encontrado por mg. de tejido (767,5 μg/mg para Mentor, 863,5 μg/mg para Musculoskeletal Transplant Foundation, 931 μg/mg para Regeneration Technologies y 526 μg/mg para Life Cell; p = 0,07). La cantidad de aloinjertos con segmentos de ADN de 400 pb, varío según la compañía procesadora (9 en Mentor y 10 en cada una de las marcas restantes). Se encontraron segmentos de ADN de 700 pb en cada uno de los 10 aloinjertos tratados por tres fabricantes, mientras que en los procesados por Mentor no se halló ninguno. Se observaron segmentos de ADN de 2.000 pb, solamente en las matrices alodérmicas procesadas por Life Cell. Los autores teorizaron que el hidróxido de sodio usado por Mentor puede ser responsable de esta variabilidad, debido a su capacidad para destruir efectivamente el ADN. Señalaron además, la poca claridad del mecanismo de acción de las soluciones antimicrobianas empleadas para tratar de destruir el ADN de los aloinjertos y la poca efectividad de la liofilización para eliminar el ADN. Los autores enfatizan la limitación de la PCR para detectar segmentos de ADN superiores a 2.000 pb y su implicación en la evaluación de los aloinjertos, ya que la longitud de muchos genomas virales, como el papiloma humano y el polioma, es de 5.000 y 8.000 pb. Los autores concluyeron que su investigación no muestra que el ADN aislado de los aloinjertos sea infeccioso, sino que está presente a pesar de procesos tisulares extensos, además, no se determinó si los segmentos genéticos encontrados provenían de los donantes o de otras fuentes como bacterias o virus.

Conclusiones

Los bancos tisulares utilizan diferentes técnicas patentadas para preparar los aloinjertos, cada una con procesos particulares. El objetivo de estas técnicas es erradicar e inactivar los microorganismos infecciosos mientras al mismo tiempo se preservan las propiedades biomecánicas de los tejidos. No existen estudios que prueben con suficiente evidencia superioridad en la efectividad o eficacia de alguno de estos procesos, lo cual implica la realización de más estudios clínicos para validarlos.

Es fundamental que el periodoncista esté familiarizado con el proceso de esterilización empleado en las matrices alodérmicas que usa en cirugía periodontal y utilizar preferiblemente aloinjertos acreditados por la Asociación Americana de Bancos Tisulares.

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Dirección para correspondencia:
Carlos Martín Ardila Medina
Carrera 47 No. 20 sur 46
Envigado Antioquía Colombia
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martinardila@gmail.com

Fecha de recepción: 2 de junio de 2008.
Aceptado para publicación: 16 de junio de 2008.