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INTRODUCCIÓN
El grupo Bacillus cereus está formado por bacterias Gram positivas, formadoras de endosporas y con forma bacilar. Dentro de este grupo se encuentran las especies Bacillus anthracis, B. cereus (sensu stricto), B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides, y B. weihenstephanensis1,2. Las tres primeras están altamente relacionadas desde un punto de vista genético3, existiendo muy pocas diferencias a nivel de secuencia en el cromosoma bacteriano. Debido a esta homología y a su nula patogenicidad para el ser humano, uno de los mejores simuladores de B. anthracis es B. thuringiensis4.
Bacillus thuringiensis es una bacteria patógena para muchos insectos, por lo que ha sido ampliamente utilizada en los últimos ochenta años en el control biológico de plagas. Actualmente, los bio-pesticidas basados en B. thuringiensis se emplean en todo el mundo para el control de insectos de los órdenes Lepidóptera, Díptera y Coleóptera5. También se ha descrito en esta bacteria actividad tóxica frente a otros invertebrados como nemátodos, protozoos y platelmintos. La toxicidad frente a los insectos reside en las llamadas proteínas cristal (Cry), las cuales cristalizan formando unos cuerpos de inclusión intracelulares que son letales para las larvas6. Dichas proteínas son codificadas por diversos genes denominados cry.
La reacción en cadena de la polimerasa o PCR, desarrollada inicialmente por Kary Mullis en 19877, supuso un avance muy importante en el análisis de cepas de B. thuringiensis con el objeto de descubrir proteínas insecticidas inéditas. En el año 1991 apareció la primera PCR que permitía predecir rápidamente la actividad insecticida de nuevas cepas de esta especie8. También se ha utilizado esta técnica para identificar y detectar diferentes genes cry: en la actualidad se conocen más de 75 familias de genes cry distintas, localizados normalmente en plásmidos; dentro de la familia de genes cry1, los cuales codifican para proteínas específicas de lepidópteros, existen hasta 14 genes distintos9,10. Asimismo, se han implementado diferentes PCRs en tiempo real (qPCR) para identificar distintas cepas de B. thuringiensis. Por ejemplo, Guidi et al. desarrollaron en 2010 una qPCR que permite detectar B. thuringiensis subsp. israelensis mediante la amplificación de los genes cry4Aa y cry4Ba11. Por otro lado, en el año 2015 se optimizó la primera qPCR que amplifica una secuencia cromosómica específica de B. thuringiensis subsp. israelensis12.
Bacillus thuringiensis es un simulador de Bacillus anthracis empleado muy a menudo en los ejercicios de entrenamiento de las Unidades Operativas de toma de muestras NBQ de las FAS. El objetivo del presente estudio es desarrollar y validar una PCR en tiempo real que permita la rápida identificación de esta bacteria, mediante la amplificación de un fragmento de 69 pb del gen cry1A.
MATERIALES Y MÉTODOS
Extracción y cuantificación del ADN molde
El material genético de la cepa HD-1 de B. thuringiensis subsp. kurstaki empleado en este estudio fue obtenido en el Laboratorio de Biología Molecular del INTA, a partir de un liófilo adquirido a la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT 4454). Para obtener un cultivo enriquecido en esporas se empleó medio de esporulación13, comprobando el proceso periódicamente mediante la tinción de Schaeffer-Fulton14. Tras medir la densidad óptica del cultivo a 550 nm, se incubó el mismo a 70ºC durante 30 minutos para eliminar las células vegetativas. Finalmente, se purificó el ADN total de las esporas mediante el kit QIAamp DNA Mini (Qiagen) siguiendo las recomendaciones del fabricante y se almacenó a -20 ºC.
La cuantificación del material genético de B. thuringiensis subsp. kurstaki se realizó en el espectrofotómetro ND-1000 (Thermo Fisher Scientific. Para determinar el número de equivalentes de genoma completo (egc), se calculó primero el número de moles que hay en una cantidad determinada de ADN (en gramos), diviendo esa cantidad por el peso molecular del genoma. Para calcular el peso molecular del genoma en Daltons (D), se multiplicó la longitud del mismo en pares de bases (6.600.000 pb en este caso) por el peso molecular de un par de bases (650 D). Luego, mediante el número de Avogadro (6,022x1023 moléculas por mol) se determinó el número de moléculas de ADN que hay en dicho número de moles, es decir, el nº de equivalentes de genoma completo. La fórmula simplificada para el cálculo de los egc es la siguiente: Número de egc = (cantidad * 6,022x1023) / (longitud * 1x109 * 650).
Optimización de la PCR cualitativa en tiempo real
Los cebadores y la sonda utilizados en este ensayo han sido diseñados en el laboratorio de bio-detección de DGA Maîtrise NRBC (Vert-le-Petit, Francia) mediante el software Primer Express 2.0 (Applied Biosystems) y la secuencia de referencia AY319967 (GenBank Accession Number). La sonda de hidrólisis lleva incluidos dos Locked Nucleic Acids (LNA), lo que permite reducir mucho su longitud sin que disminuya su temperatura de hibridación, aumentando así la especificidad del ensayo. La secuencia de todos ellos se indica en la Tabla 1.
Tabla 1 Cebadores y sonda utilizados para amplificar el gen cry1A.
| Nombre | Secuencia nucleotídica 5’>3’ | Modificaciones |
|---|---|---|
| BtF | TGT AAT ACC GCC ACA GGA TAA TAG TG | -- |
| BtR | GTA ACA TGA CCC AAT CGA TGG CTA A | -- |
| Bt LNA | CCA CC+T CG+T GCG GGA | 5’ FAM, 3’ BHQ1 |
+ indica las posiciones de los LNA (+LNA).
La amplificación se llevó a cabo en el equipo LightCycler 2.0 (Roche) empleando el kit LightCycler Taqman Master (Roche), con 5 µl de ADN molde en un volumen final de 20 µl. Los reactivos empleados y sus concentraciones se muestran en la Tabla 2. Para optimizar el ensayo se probaron tres temperaturas de hibridación distintas (58, 60 y 62 ºC). Las condiciones de amplificación finales fueron las siguientes: 1 ciclo de 95 ºC durante 10 minutos (activación de la polimerasa); 45 ciclos de 95 ºC durante 10 segundos (desnaturalización) y 60 ºC durante 1 minuto (hibridación y extensión). En todos los ensayos se utilizó ADN de B. thuringiensis subsp. kurstaki CECT 4454 como control positivo y agua libre de nucleasas como control negativo de contaminación (No Template Control, NTC). Todos los experimentos de qPCR fueron realizados siguiendo las recomendaciones de la guía MIQUE15.
Tabla 2 Composición y volúmenes de la mezcla de reacción.
| Reactivo | Concentración inicial | Volumen por muestra | Concentración final |
|---|---|---|---|
| H20 grado PCR | 9,4 µl | ||
| Cebador BtF | 10 µM | 0,6 µl | 0,3 µM |
| Cebador BtR | 10 µM | 0,6 µl | 0,3 µM |
| Sonda Bt LNA | 5 µM | 0,4 µl | 0,1 µM |
| LC Taqman Master | 5X | 4 µl | 1X |
El análisis de los resultados se realizó de forma automática en el canal 530 nm mediante el software LC versión 4.1. Los productos de la qPCR también se analizaron en un gel de agarosa al 2% para verificar los resultados. El tamaño del fragmento amplificado en esta qPCR es de 69 pb.
Validación del ensayo
Eficiencia, linealidad y límite de detección
Se realizaron diluciones seriadas 1/10 del ADN de la cepa HD-1 de B. thuringiensis subsp. kurstaki (CECT 4454), desde 1,3x106 hasta 1,3x10-1 egc en 5 µl. La curva estándar incluyó 8 puntos de dilución, cada uno por triplicado. Se representó gráficamente el valor de Cq obtenido frente al logaritmo en base 10 de la concentración del ADN, y los puntos de la curva se ajustaron a una recta mediante una regresión lineal. A partir de la pendiente de la curva estándar se determinó la eficiencia de la reacción de amplificación mediante la siguiente fórmula: Eficiencia = 10(-1/pendiente) -1.
Asimismo, el coeficiente de correlación R2 obtenido en la regresión lineal se utilizó para determinar la linealidad del ensayo de qPCR.
El límite de detección (LOD) de un ensayo se corresponde con la menor concentración de ADN (en equivalentes de genoma completo por reacción) que se detecta de forma reproducible con una probabilidad del 95%. Así, para 20 repeticiones, el límite de detección fue aquel nivel más bajo que presentó uno o ningún resultado negativo. Para la determinación del cutoff value, se calculó el Cq medio del LOD + 2 veces la desviación estándar (X + 2SD) y el resultado se redondeó al número entero más próximo16.
Inclusividad y exclusividad
La especificidad del método se evaluó con 1 cepa diana de B. thuringiensis subsp. kurstaki, 14 cepas no diana estrechamente relacionadas (8 cepas de B. anthracis y 6 cepas de B. cereus) y 10 cepas no diana no relacionadas (5 cepas de otras especies del género Bacillus y 5 cepas de otros géneros). El estudio de inclusividad se realizó por lo tanto con 1 cepa diana, y el de exclusividad con 24 cepas no diana. La cantidad de ADN estuvo comprendida entre 1x103 y 1x104 egc por reacción de amplificación.
La exclusividad se calculó como el porcentaje de cepas bacterianas no diana que no dieron reactividad cruzada con respecto al total de cepas utilizadas, mientras que la inclusividad fue el porcentaje de cepas de la misma subespecie que fueron detectadas por el ensayo.
Evaluación inicial del método
Durante las Escuelas Prácticas en Riesgos Tecnológicos de la UME, celebradas en noviembre de 2016, el Laboratorio de Biología Molecular del INTA participó en la identificación molecular de B. thuringiensis en las muestras recogidas por los equipos de intervención participantes (UME y Regimiento NBQ “Valencia” Nº 1). El personal de la UME preparó dos escenarios biológicos. El primero simulaba un atentado ferroviario, mientras que el segundo fue un laboratorio clandestino. Las muestras biológicas fueron preparadas con un desinfectante comercial denominado Bactur (Becker Microbial Products), compuesto por esporas de la cepa HD-1 de B. thuringiensis subsp. kurstaki. En el Laboratorio de Biología Molecular se recibieron 2 muestras: 0224A (sustancia pulverulenta de color marrón) y 0224B ((líquido de color amarillento). Tras realizar una extracción de ADN total con el kit QIAamp DNA Mini (Qiagen), ambas muestras se amplificaron por qPCR para detectar la presencia de dicha bacteria.
RESULTADOS
Optimización del ensayo
Se probaron tres temperaturas diferentes de hibridación / extensión (58, 60 y 62ºC) para optimizar el ensayo. A 60ºC se consiguió reducir el límite de detección del ensayo hasta la dilución 10-6 (lo que equivale a 13 egc por reacción) y aumentar la eficiencia de la reacción de amplificación al 93%, por lo que se procedió a completar la validación del nuevo método de detección de B. thuringiensis.
Validación del ensayo
Eficiencia y Linealidad del Ensayo
Se analizaron 8 diluciones seriadas 1/10 (desde 1,3x106 egc por reacción hasta 1,3x10-1) por triplicado del ADN de la cepa HD-1, obteniéndose los resultados que se muestran en la figura 1. Como puede verse en dicha figura, el rango lineal del ensayo abarca las 6 primeras diluciones, esto es, desde 1,3x106 hasta 1,3x101 egc por reacción, con un valor R2 igual a 0,9993. La eficiencia de la reacción de amplificación en el rango lineal del ensayo fue del 93%, lo que está dentro de los márgenes establecidos en el laboratorio.
Límite de detección del método
Se analizaron 20 repeticiones de las diluciones 10-6, 10-7 y 10-8 del ADN de la cepa HD-1 en diferentes días. En la figura 2 se muestran los resultados de un día. En la Tabla 3 aparecen los resultados de las 20 repeticiones. El método de análisis utilizado fue el automático.
Figura 2 Límite de detección del método. Curvas de amplificación y valor de Cq obtenido (detección cualitativa).
Como puede verse en la Tabla 3, todos los resultados de la dilución 10-6 fueron positivos, mientras que en la dilución 10-7 hubo 15 resultados positivos y 5 negativos. El límite de detección se estableció por lo tanto en la dilución 10-6 con una probabilidad del 95%, lo que equivale a 13 egc (95 fg) por reacción.
A partir de los valores obtenidos en la dilución 10-6 se calculó el valor medio y la desviación estándar, obteniéndose un cutoff value de 38 (ver Tabla 4).
Inclusividad y exclusividad
Con estas nuevas condiciones se analizó únicamente 1 cepa de B. thuringiensis subsp. kurstaki, ya que en el laboratorio de bio-detección de DGA Maîtrise NRBC habían examinado 150 cepas distintas de B. thuringiensis, comprobándose que esta qPCR es específica para el gen cry1A y puede detectar casi todas las subespecies (comunicación personal). El estudio de exclusividad se realizó con 24 cepas no diana en total. Se analizaron 14 cepas no diana estrechamente relacionadas (esto es, de las especies más próximas a B. thuringiensis, que son B. cereus y B. anthracis) y 10 cepas no diana no relacionadas (de otras especies del género Bacillus y de otros géneros bacterianos patógenos para el hombre). Las cepas empleadas y los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 5. Sólo se obtuvo un valor de Cq inferior a 38 y banda de 69 pb en la cepa HD-1 de B. thuringiensis subsp. kurstaki. Todas las cepas empleadas en el estudio de especificidad fueron detectadas por amplificación de un fragmento del ADNr 23S para confirmar la presencia de ADN bacteriano (datos no mostrados). La inclusividad y la exclusividad del nuevo método de identificación de B. thuringiensis fueron por lo tanto del 100%.
Tabla 5 Resultados del estudio de especificidad.
| Especie | Cepa | Nº colección / Procedencia | Resultado qPCR |
|---|---|---|---|
| B. thuringiensis | HD-1 | CECT 4454 | positivo |
| B. thuringiensis | HD-1 | Bactur | positivo |
| B. anthracis | Hankow hide | NCTC 2620 | negativo |
| B. anthracis | Sterne | NCTC 8234 | negativo |
| B. anthracis | St Marys | NCTC 5444 | negativo |
| B. anthracis | Paddintong VI | NCTC 109 | negativo |
| B. anthracis | Fildes | NCTC 1328 | negativo |
| B. anthracis | 282 | NCTC 7752 | negativo |
| B. anthracis | 1501 | NCTC 7753 | negativo |
| B. anthracis | Vollum | NCTC 10340 | negativo |
| B. cereus | NRRL B-569 | ATCC 10876 | negativo |
| B. cereus | desconocido | ATCC 14579 | negativo |
| B. cereus | 278/04/A3 | aislado clínico | negativo |
| B. cereus | 435/06/A4 | aislado clínico | negativo |
| B. cereus | 1235/06/A5 | aislado clínico | negativo |
| B. cereus | 131/07/A6 | aislado clínico | negativo |
| B. atrophaeus | NRS 1221A | CECT 38 | negativo |
| B. subtilis | NRS 231 | ATCC 6633 | negativo |
| B. flexus | desconocido | CECT 62/02B | negativo |
| B. mycoides | NRS 273 | CECT 4128T | negativo |
| B. circulans | 548/07/A11 | aislado clínico | negativo |
| Y. pestis | NCTC 144 | NCTC 144 | negativo |
| C. burnetti | Nine mile | desconocido | negativo |
| B. melitensis | ReV1 Biovar1 | desconocido | negativo |
| B. mallei | NCTC 10245-03 | NCTC 10245-03 | negativo |
| R. rickettsii | Smith | desconocido | negativo |
Evaluación inicial del método
Se evaluó el nuevo método desarrollado con 2 muestras procedentes de un simulacro organizado por el Grupo de Riesgos Tecnológicos de la UME. En ambas muestras se obtuvo una identificación positiva de B. thuringiensis (Tabla 5), confirmándose de esta manera la idoneidad del nuevo método molecular desarrollado.
DISCUSIÓN
El rango lineal del ensayo estuvo comprendido entre 1,3x106 y 1,3x101 egc por reacción, con una buena correlación entre el valor de Cq obtenido y la cantidad de ADN (R2 igual a 0,9993). El análisis de regresión lineal mostró además una eficiencia de la qPCR del 93,4%, cerca del factor de amplificación ideal de 2 por cada ciclo de PCR. Los experimentos de qPCR realizados indicaron que el límite de detección del ensayo (al 95% de probabilidad) es de aproximadamente 13 egc (95 fg) por reacción; esta sensibilidad analítica es mayor que la de otras qPCR específicas para detectar B. thuringiensis subsp. kurstaki, una con sonda Taqman desarrollada por Crighton et al.17 y otra con SyBr Green publicada por Douville et al18. Recientemente se ha publicado una nueva qPCR para identificar B. thuringiensis subsp. kurstaki, pero los autores no determinaron el límite de detección del método19. Por último, el cutoff value del ensayo aquí descrito se estableció en el ciclo 38. Todos estos resultados indican que el ensayo de qPCR presentado en este estudio permite una rápida detección, específica de secuencia, de B. thuringiensis con una elevada sensibilidad analítica.
La cepa HD-1 de B. thuringiensis subsp. kurstaki empleada en este estudio fue correctamente identificada con los cebadores y la sonda de hidrólisis diseñados. Se observó además un producto de PCR del tamaño esperado y la ausencia de otros amplicones inespecíficos. Por otro lado, ninguna de las 24 cepas no diana utilizadas mostró un resultado positivo, lo que indica que tanto los oligonucleótidos como la sonda empleados no presentan reactividad cruzada con otros microorganismos, tanto genéticamente relacionados como no relacionados. Todas estas cepas fueron detectadas por amplificación de un fragmento del ADNr 23S para confirmar la presencia de ADN bacteriano. Para completar el proceso de validación será necesario utilizar muestras medioambientales reales contaminadas con B. thuringiensis, con el objeto de determinar la sensibilidad y especificidad diagnósticas del método, así como implementar un control interno de inhibición20.
Desde el punto de vista de la biodefensa, es importante disponer de un ensayo molecular rápido, sensible y específico que permita la identificación de B. thuringiensis, simulador de B. anthracis. Este agente biológico es empleado muy a menudo en los ejercicios de entrenamiento de las Unidades Operativas de toma de muestras NBQ de las FAS, siendo necesaria su posterior identificación en el laboratorio de referencia para poder corroborar la correcta recogida de dichas muestras. De hecho, se ha realizado una evaluación inicial del método en muestras procedentes de un simulacro organizado por la UME, con un resultado altamente satisfactorio.
CONCLUSIONES
Se ha optimizado y validado una PCR en tiempo real con sonda de hidrólisis que identifica de forma específica Bacillus thuringiensis, simulador de Bacillus anthracis, mediante la amplificación parcial del gen cry1A. La eficiencia (93%) y linealidad (R2 0,9993) del método fueron adecuadas. Dicha qPCR presentó una elevada sensibilidad, con un límite de detección de 13 equivalentes de genoma completo (95 fg) por reacción al 95% de probabilidad. Tanto la inclusividad como la exclusividad del nuevo método molecular fueron del 100%.
