INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS

La crioconservación de los hematíes, permite su conservación por un período entre 10 y 30 años^1,2. Esta vida tan prolongada permite que estos componentes sean usados para mantener la disponibilidad de unidades de grupos sanguíneos poco frecuentes, o para crear almacenes de grupos sanguíneos de donante universal para fines militares^3,4. Estos componentes se han usado en el marco de conflictos bélicos desde mediados del siglo XX por distintos países, y actualmente el ejército americano tiene preposicionados almacenes de estos componentes en distintos niveles orgánicos, que tienen capacidad de procesamiento y almacenamiento⁵. Asimismo, existen estudios que indican que su uso tiene resultados clínicos similares a los obtenidos con hematíes líquidos^6,7. El Centro de Transfusión de las Fuerzas Armadas (CTFAS), para cumplir con la misión encomendada, mantiene un almacén de concentrados de hematíes glicerolizados y posteriormente congelados, que debido a que su periodo de caducidad alcanza los 30 años, deben ser monitorizados, para asegurar que la calidad del producto final obtenido tras la descongelación y desglicerolización es la establecida por los requisitos técnico-legales, y así integrarlos dentro del sistema de gestión de la calidad de nuestro centro.

El objetivo principal es determinar si las unidades de hematíes crioconservadas, existentes en el almacén del Centro de Transfusión de las Fuerzas Armadas (CTFAS), cumplen con las especificaciones técnicas establecidas tras su descongelación y desglicerolización y que permiten su uso clínico. Como objetivo segundario se marca el estudio de la evolución de diferentes parámetros de calidad en las unidades descongeladas y desglicerolizadas, conservadas a 4 ± 2°C, en el transcurso de los 14 días posteriores a su descongelación, en orden a establecer si se puede ampliar la caducidad, ya que sólo está certificada durante las 24 horas postdescongelación y desglicerolización por los fabricantes de los equipos de procesado y cualquier ampliación requiere una validación por parte de cada centro².

MATERIAL Y MÉTODOS

Del concentrado de hematíes descongelado y desglicerolizado, se procederá a hacer su pesaje para determinar el volumen neto de concentrado de hematíes a partir de la densidad; posteriormente se elaboran 3 alícuotas, (D0, D7 y D14) mediante uniones estériles realizadas con la conectora de tubos estéril TSCD-II^® (TERUMO) con bolsas de transferencia estériles y se conservarán a 4+/- 2ºC. De esta forma se pueden hacer determinaciones en distintos momentos sin exponer la misma unidad a extracciones repetidas.

Sobre estas alícuotas se realizarán las siguientes determinaciones:

Sólo se realiza en alícuota D0 ya que es un parámetro que sirve para asegurar un adecuado lavado del glicerol y sus cambios posteriores no son achacables al proceso de lavado. Se calcula la diferencia entre la osmolaridad de la solución conservante SAG-M (cloruro sódico, adenosina, glucosa y manitol) y la del sobrenadante.

No se realiza determinación de leucocitos residuales, ya que el producto inicial que se somete a glicerolización y posterior congelación, son concentrados de hematíes del CTFAS, que son sometidos a desleucotización universal mediante filtrado, que asegura el contenido máximo de leucocitos (< 1 x 10 6/unidad) por concentrado de hematíes y se comprueba a través de los controles de calidad de producto que periódicamente son realizados sobre los concentrados de hematíes líquidos.

Las determinaciones se realizarán en:

De los datos obtenidos, se realizará una estadística descriptiva (media, desviación estándar), se estudiará la correlación entre el tiempo de almacenamiento y los distintos parámetros (P de Pearson) y se aplicará el test de Student para establecer si existen diferencias significativas en los parámetros estudiados entre las muestras pareadas de las alícuotas. Se usan las fórmulas estadísticas del programa EXELL (Microsoft Office^®).

En todo momento se respeta la ley de protección de datos en el manejo de los mismos a lo largo del proceso, manteniendo el anonimato de los donantes de los componentes sometidos a estudio.

RESULTADOS

El resumen de los parámetros medidos tras la descongelación se presenta en la tabla 1. El tiempo previo de congelación de las unidades estudiadas fue, de media, 3.208 días (máx. 5.229; mín. 331). El volumen medio de las unidades finales obtenidas (alícuotas D0) fue de 282 ml (±11).

La osmolaridad del sobrenadante es indicativa de la cantidad residual de glicerol en la unidad final. El glicerol residual debe ser inferior al 1%, ya que niveles mayores puede inducir hemólisis tras la transfusión. Una osmolaridad inferior a 400 mOsm/Kg H₂O, asegura un nivel residual de glicerol inferior al 1%⁸. A nivel europeo, la exigencia en este aspecto es que la osmolaridad del sobrenadante sea como máximo 20 mOsm/L por encima de la osmolaridad de la solución de resuspensión. En nuestra muestra la diferencia de osmolaridad media fue de -0,21 mOsm/Hg H₂O (±5,85). La osmolaridad media del sobrenadante fue 350,7 ± 11 mOsm/Kg H₂O, que es similar a los encontrados en otros estudios⁹.

La hemoglobina media libre en el sobrenadante en nuestra muestra fue de 0,064 g/unidad (±0,02), el 100% de las unidades tienen niveles <0,2 g/unidad. La concentración de hemoglobina sobrenadante media fue de 0,096 ± 0,02 g/dl, que es similar a la del estudio de Cetinkaya¹⁰ y superior a la serie de Pritts¹¹.

El hematocrito (v/v) medio fue de 0,503 (±0,05), el contenido medio de hemoglobina de la unidad (g/unidad) fue 41,1 g (±4,1). Estas cifras están por encima de las descritas en otras series^11,12.

Los hemocultivos resultaron todos negativos, tanto para aerobios como para anaerobios.

El pH medio de los componentes fue de 6,37 ± 0,13. Nuestra serie tiene valores algo inferiores a los descritos en otros estudios^9-11,13.

En cuanto a la evolución de los parámetros en las distintas alícuotas, en función del tiempo de almacenamiento, se resumen en la tabla 2 y tabla 3.

La hemoglobina sobrenadante media total (g/unidad) fue de 0,064, 0,82 y 1,44 g/unidad los días 0, +7 y +14 respectivamente (p = 0,0005 D0-7, p = 0,00004 D7-14, p = 0,0001, D0-14). Este incremento a lo largo del almacenamiento es conocido, se atribuye a una tasa de hemólisis de los hematíes conservados, y en nuestro estudio es estadísticamente significativo en todos los periodos de tiempo estudiados (figura 1). Los datos de concentración de hemoglobina en el sobrenadante (g/dl) son 0,096 ± 0,02 g/dl (D0), 0,59 ± 0,43 g/dl (D7) y 1,01 ± 0,67 g/dl (D14) (P = 0,003 D0-D7, p = 0,003 D7-D14, p = 0,00001 D1-D14). Estas cifras en el D0 son similares a otros estudios, pero las cifras en D7 y D14 son superiores a las encontradas en la bibliografía^9,11.

Figura 1.  Niveles de hemoglobina (Hb) libre en el sobrenadante durante el almacenamiento a 4ºC. 

El hematocrito medio (v/v) fue de 0,503 (D0), 0,508 (D7) y 0,524 (D14) (p = 0,16 D0-D7, p = 0,002 D7-D14, p = 0,0003 D0-D14).

El contenido medio de hemoglobina del concentrado de hematíes (g/unidad) fue 40,8 (D0), 40,11 (D7) y 40,65 (d14) (p = 0,017 D0-7, p = 0,07 D7-D14, p = 0,49 D0-D14).

El pH del sobrenadante fue 6,362 (D0), 6,436 (D7) y 6,411 (D14) respectivamente (p = 0,036 D0-D7, p = 0,22 D7-D14 y p = 0,20 D0-D14), con un cambio significativo entre D0-D7, pero al aumentar el tiempo de almacenamiento se pierde la significación, indicando una estabilización del pH a D14. Estos datos son coincidentes con estudios de similar diseño⁹, pero estudios con almacenamiento más prolongado a 4°C, encuentran un descenso progresivo del pH¹¹.

Los hemocultivos resultaron negativos, tanto para aerobios como para anaerobios, en todas las alícuotas D0, D7 y D14.

En cuanto a la influencia del tiempo de almacenamiento congelado, se observa que la hemoglobina sobrenadante no tiene correlación con el tiempo de congelación en D0 y D7 (R = 0,41 y R = 0,17), pero sí en D14 (R = 0,97).

DISCUSIÓN

Los hematíes congelados, desde su uso incipiente por parte del ejército estadounidense en la guerra de Vietnam³, se consideran un elemento útil para cubrir necesidades hemoterápicas en entornos austeros. De este modo, han sido usados, en mayor o menor medida por parte de la sanidad militar holandesa, australiana y checa, entre otros, en distintas zonas de operaciones^14-16. Estos productos, a nivel clínico, han demostrado no ser inferiores a los hematíes líquidos convencionales, conservados a 4°C^6,7 siendo perfectamente válidos para su uso en pacientes con necesidades hemoterápicas. Los concentrados de hematíes crioconservados, posteriormente descongelados y desglicerolizados, deben de reunir unas características de calidad preestablecidas¹, independientemente del tiempo previo de congelación, que puede llegar hasta 30 años.

Los productos obtenidos inmediatamente tras la descongelación y desglicerolización de los concentrados de hematíes crioconservados y almacenados en el CTFAS cumplen las especificaciones exigidas por las normas técnicas y de calidad² en todos sus parámetros, tanto en volumen, hematocrito, hemoglobina total por unidad, hemoglobina libre en el sobrenadante, osmolaridad y control microbiológico (tabla 4). Estos datos demuestran que los productos almacenados en nuestro centro, algunos hasta 18 años, están adecuadamente conservados, son idóneos para su uso clínico y que el proceso de descongelación y desglicerolización es adecuado y no deteriora el producto.

Otro aspecto a analizar es el efecto del almacenamiento a 4°C de los componentes, tras su descongelación y desglicerolización sobre los parámetros de calidad de los mismos. Las variables estudiadas, a lo largo de los 14 días de estudio, experimentan cambios acordes a los descritos previamente en la bibliografía^13,17-23. Estos parámetros se mantienen dentro de los límites requeridos por la Unión Europea² hasta el día 14, todos excepto la hemoglobina total en el sobrenadante, que se va incrementando con el tiempo como ocurre en los hematíes conservados, pero supera la cifra aceptable a los 7 días (D0-D7 p = 0,0005, D7-D14 p = 0,00004), lo cual puede indicar una tasa de hemólisis aumentada durante el almacenamiento respecto a los concentrados de hematíes no crioconservados. Este dato probablemente se deba a un deterioro del sistema metabólico de los hematíes, tanto, por la congelación, como por el proceso de descongelación y desglicerolización. Esta observación es coincidente con lo descrito en el trabajo de Pritts¹¹, que describe un desarrollo más acelerado de las lesiones por almacenamiento en el periodo postdescongelación de los hematíes crioconservados en comparación con los hematíes conservados a 4°C.

Estos datos hacen que, en nuestro centro, la caducidad de estos productos, no pueda validarse más allá de las 24 horas establecidas por las normas técnicas², ya que no se puede establecer de forma precisa a partir de qué momento la hemoglobina sobrenadante total de la unidad supera el límite tolerable, debido a que no se realizan determinaciones hasta el día 7. Para establecer con mayor precisión esta caducidad serán necesarios nuevos estudios con mayor tamaño muestral y con un diseño específico para este objetivo con mediciones con intervalos de tiempo más pequeños.

Otro aspecto interesante es la influencia del tiempo de almacenamiento congelado en la calidad de los componentes finales obtenidos. Los estudios publicados indican que la duración de la congelación contribuye mínimamente a la lesión celular^24-26, y no debiese existir relación entre dicho tiempo y la calidad del producto final; este dato se confirma en nuestro estudio, como demuestra la ausencia de correlación entre el tiempo de congelación y los parámetros de calidad estudiados en D0. Sin embargo, cuando se incrementa el tiempo de almacenamiento desde el proceso de descongelación, en el día 14, aparecen mayores niveles de hemoglobina sobrenadante en aquellos concentrados que tienen mayores tiempos de congelación, lo que puede sugerir un efecto negativo del tiempo de congelación sobre la tasa de hemólisis del producto, provocando un incremento de la misma en fases tardías del almacenamiento postlavado y por tanto de los niveles de hemoglobina total en el sobrenadante.

CONCLUSIONES

Los hematíes crioconservados almacenados en el CTFAS están adecuadamente conservados, aún cuando algunos tienen hasta 18 años de almacenamiento, y los componentes descongelados y desglicerolizados, son aptos para su uso clínico ya que cumplen las especificaciones técnicas exigidas². La caducidad de los componentes descongelados y desglicerolizados, en nuestro centro y en el momento actual, no puede extenderse más allá de las primeras 24 horas tras la descongelación y desglicerolización, certificadas por los fabricantes de la ACP-125 y de lo establecido por el European Directorate for the Quality of Medicines and Health Care². Estos componentes, como ya se ha observado en experiencias previas, pueden constituir, por su larga caducidad y la posibilidad de generar almacenes de grandes cantidades, una reserva estratégica para hacer frente a necesidades súbitas y de grandes cantidades. Por otro lado, en zona de operaciones constituye una herramienta que permite mejorar la logística de suministro de componentes sanguíneos, ya que la corta vida media de los hematíes líquidos hace que el suministro tenga que ser muy frecuente, con el riesgo de sufrir interrupciones por la dificultad en el transporte a grandes distancias, o que el consumo supere los almacenes en zona, debido a las dificultades en la previsión de necesidades hemoterápicas que caracterizan las operaciones militares y que pueden ser muy elevadas en cortos periodos de tiempo. El preposicionamiento de hematíes congelados en zonas de operaciones puede aportar seguridad e independencia de suministro durante periodos largos de tiempo, en caso de pérdida de la cadena logística, bien como fuente principal de concentrados de hematíes o bien para salvar roturas de almacén por consumos muy elevados de aparición brusca. Todo lo anteriormente expuesto nos debe hacer reflexionar sobre el valor estratégico de disponer de un almacén de hematíes crioconservados y de los medios materiales y humanos, necesarios para su despliegue y uso sobre el terreno, en caso necesario.