Familia de Secreted Frizzled - Related Proteins

La familia de glicoproteínas sFRP está conformada por un total de cinco miembros (sFRP1 - sFRP5), dentro de la cual se puede realizar una subdivisión atendiendo a la homología entre ellos. Por un lado, se encuentra la subfamilia 1Sarp, constituida por sFRP1, sFRP2 y sFRP5. Por otro lado, son sFRP3 y sFRP4 quienes conforman la subfamilia 2FrzB^5,6. Con respecto a su actividad, esta familia se ve encuadrada dentro de los "antagonistas de la vía de señalización del Wnt"⁷.

El silenciamiento del gen 8p11.21 en pacientes diagnosticados de cáncer de mama y de colon permitió la determinación del primer miembro de esta familia, sFRP1^4,5. Dicho gen codifica para una glicoproteína de 314 aminoácidos (aa) capaz de establecer puentes disulfuro con el receptor FZD^8,9. Comparando con el resto de miembros, ésta presenta una mayor homología con sFRP5^4,10. El segundo miembro, sFRP2, viene codificado por el gen 4q31.3, que da lugar a una proteína de 300 aa aproximadamente^5,11. La expresión de esta suele ocurrir a nivel del estroma tumoral en la mayoría de tipos de cáncer, al igual que sucede con su hermana sFRP4^4,12. Por su parte, sFRP3 viene codificada por el gen 2q32.1⁵. Esta glicoproteína fue uno de los primeros miembros de la familia en determinarse, que inicialmente se denominó FRZB debido a su actividad como antagonista de la vía de señalización del Wnt¹³. sFRP3 actúa regulando la polaridad epitelial, además de presentar un papel fundamental en la homeostasis del hueso y del cartílago^14,15. El último miembro de la familia, sFRP5, viene codificado por el gen 10q24.2⁵. La inhibición de la expresión de esta glicoproteína se encuentra relacionada con una gran variedad de patologías cancerígenas, como son el cáncer de próstata, el cáncer ovárico epitelial¹⁶ o el cáncer de mama, siendo incierto el papel de ésta en el melanoma¹⁷. La expresión de ésta se ve disminuida en la mayoría de tumores primarios, al igual que ocurre con su hermana sFRP1^4,18.

Estructura y localización genética y celular de sFRP4

sFRP4 se determinó por primera vez en 1997 de manos de Wolf y su equipo. En la literatura científica se pueden encontrar otras referencias a esta glicoproteína como FRP - 4, frpHE (FRP Human Endometrium), LOC6426, MGC26498 y FRZB2. Esta última denominación se debe a su homología (48,6%) con sFRP3 (FRZB1). Asimismo, sFRP4 es el miembro más conocido de la familia, la cual presenta diferencias fundamentales con el resto basadas en la presencia de seis residuos de cisteína unida mediante puentes disulfuro^5,19.

Estructuralmente, la proteína se caracteriza por estar conformada por un total de 364 aa y presentar un peso molecular aproximado de 39,9 kDa^5,19. Los plegamientos conformacionales posteriores a la síntesis de la proteína dan como resultado dos dominios independientes. Por un lado, encontramos el CRD, constituido por 110 - 120 aa y cuya fracción terminal guarda un 30% de homología con el dominio localizado en los receptores FZD. Ello se debe a la presencia de 10 residuos de cisteína en ambos dominios^5,19,20. Por otro lado, en el dominio NTR o NDL se aprecia una región de elevado contenido en serina y treonina. Este dominio es la diana perfecta para la acción de serina o treonina quinasas, al componerse de varios lugares de fosforilación serina/treonina (9 en el caso de los humanos). Además, los seis residuos de cisteína presentes en el dominio permiten el establecimiento de tres puentes disulfuro^5,6,21, ver figura 1.

Figura 1.  Representación de la localización genética del gen 7p14.1 y la estructura de la proteína sFRP4. En ella se aprecian dos dominios independientes y un péptido señal, que indica que ésta es una proteína secretada. 

Este gen codificante para sFRP4 presenta tres transcritos y se asocia con 29 fenotipos^5,19,22. Además, cuenta con la presencia de seis exones y una longitud de 10,99 kb, siendo dentro del primer exón donde se localiza el codón de iniciación para la traducción. Por otro lado, la transcripción del gen ocurre desde el telómero hacia el centrómero, es decir, en sentido opuesto ^5,19,22,23. Como producto de dicho proceso se obtiene un transcrito primario que cuenta con 2974 pares de bases (pb), de las cuales, 1041 pb conforman la secuencia codificante o mRNA maduro^5,19,22, ver figura 1.

La expresión de sFRP4 viene regulada mediante estrógenos y progesterona, de manera que podría intervenir en la morfología y función uterina²⁴. Por su parte, dicha proteína cuenta con una amplia presencia a nivel de tejidos humanos, destacando principalmente el estroma endometrial (existe una mayor expresión de la misma en la fase proliferativa del ciclo menstrual), ovario, riñón, cerebro, glándulas mamarias, cérvix, páncreas, estómago, colon y pulmón^5,24. A nivel celular, la síntesis de sFRP4 ocurre en el núcleo, mientras que las modificaciones posteriores y su almacenamiento se suceden en el retículo endoplasmático perinuclear. Con respecto a la secreción de la proteína, ésta tiene lugar mediante vesículas procedentes del retículo y dirigidas hacia la membrana celular. Tanto la localización celular como la secreción de sFRP4 están mediadas por el ligando Wnt3a. La presencia de éste se traduce en la formación de agregados oligoméricos entre sFRP4 y CRD en la región perinuclear y, por ende, se da una redistribución intracelular de la proteína^19,25.

Vías de señalización del Wnt y sFRP4

Desde el descubrimiento del primer gen codificante para Wnt (Wnt1) hasta hoy, se ha logrado identificar un total de 19 genes que codifican para estas glicoproteínas. La familia de proteínas Wnt presenta un alto grado de conservación a través de la evolución, desde el género Drosophila, hasta los vertebrados. Estas proteínas son fundamentales para el correcto desarrollo embrionario y el mantenimiento de la homeostasis en el adulto^7,26. La familia de ligandos Wnt hace referencia a un conjunto de glicoproteínas solubles que se caracterizan por unirse con receptores FZD, principalmente, y correceptores LRP5/6 (proteínas relacionadas con el receptor de lipoproteínas de baja densidad, LDL)⁷. Su actividad se centra en el inicio de una cascada de señalización donde la β - catenina juega un papel clave, diferenciando entre la vía canónica (dependiente de la β - catenina) y la vía no canónica (independiente de la β - catenina)²⁷.

Por su parte, los receptores FZD se integran dentro de una familia de proteínas constituidas por siete dominios transmembrana (7TM), los cuales se caracterizan por presentar CRDs en su fracción extracelular (N - terminal). Estos dominios son, de hecho, el lugar de unión de los ligandos Wnt a este receptor^6,28.

Vía Canónica

En la vía canónica, cuando el ligando Wnt no inicia la cascada, la β - catenina es objeto de fosforilación por acción del complejo proteico de destrucción. Este está constituido por la unión de las proteínas de andamiaje APC y Axina; las proteínas quinasas CK1 y GSK3β, y la E-3 ubiquitina ligasa β - TrCP^29,30,31. Ello permite actuar a la ubiquitina ligasa β - TrCP sobre la β - catenina, de manera que podrá ser degradada por el proteasoma^32,33. De esta forma, los factores de transcripción TCF/LEF reprimen los genes diana de la β - catenina mediante el reclutamiento de correpresores Groucho³⁴. Por otro lado, cuando el ligando Wnt se une al FZD y su correceptor LRP5/6, la vía se activa. Así, la proteína citoplasmática de andamiaje Dishevelled (Dvl) recluta a la Axina y permite la fosforilación del extremo citoplasmático del correceptor LRP5/6^{29,35,36,37,38}. Como resultado de ello se da la acumulación citoplasmática de la β - catenina y la translocación al núcleo de la misma, uniéndose a TCF/LEF y desplazando a los represores Groucho^29,34,29. Todo ello, junto con el reclutamiento de coactivadores transcripcionales como BCP y Pygo/Bcl - 9⁴⁰, permite la expresión de genes relacionados con la carcinogénesis como CCND1, MYC, axina2, DKK1 o LEF1^30,33, ver figura 2.

Vía no canònica

La vía no canónica suele iniciarse mediante los ligandos Wnt5a y Wnt11⁷. Dentro de ella, podemos diferenciar entre la vía del Calcio (Ca²⁺) y la vía de la Prioridad Celular Planar (PCP)^32,40. La primera de ellas se puede activar por unión del Wnt a FZD o bien al receptor ROR2 (tyrosine kinase - like orphan receptor - 2)⁴¹. Ello se traduce en una activación de las proteínas G, que actúan sobre la PLC, aumentando los niveles citoplasmáticos de DAGs (diacilglicéridos) e IP3 (inositol trifosfato). Por su parte, el IP3 difunde hasta el retículo endoplasmático liso (smooth endoplasmic reticulum, SER), permitiendo la liberación del Ca²⁺ contenido en éste^42,43,44. Cabe destacar que, el aumento del Ca²⁺ puede darse como resultado de la inhibición de la proteína quinasa G (PKG) mediante la acción de la proteína p38^33,45. El Ca²⁺ activa a la calcio/calmodulina dependiente de quinasa II (CaMKII) y, por ende, a la calcineurina, la cual interviene en la activación del NFAT (nuclear factor of activated T cells)^44,46. Por su parte, la actuación de los DAGs activa a la proteína quinasa C (PKC) a nivel de la membrana y como resultado de ello, el IκB actúa sobre el factor nuclear κB (NF - κB). Este último migrará al núcleo, de manera que, junto con el NFAT, intenvendrán como factores de transcripción^32,43, ver figura 2.

Por otro lado, la vía PCP se inicia cuando la unión de Wnt al FZD activa a las proteínas de unión a GTP RhoA y Rac, así como a sus quinasas efectoras: Rho - quinasa y JNK, promoviendo su translocación al núcleo^40,47. La vía se ve interrumpida por la acción las proteínas Van Gohg (Vangl) y Prickle (Pk)^35,48, ver figura 2. Esta vía se asocia con la reordenación del citoesqueleto y adhesión celular, regulando los movimientos de la célula y su disposición^35,40. Es importante mencionar que la cascada no tiene porqué ser estrictamente a nivel epitelial²⁸.

Figura 2.  Representación de las vías de señalización del Wnt. Se aprecian la vía canónica (en su estado activo e inactivo) y la vía no canónica (vía del calcio y de la Prioridad Celular Planar, PCP). 

Mecanismos de acción de sFRP4

Las modificaciones conformacionales posteriores a la síntesis de sFRP4 dan lugar a una homología del 30% entre los sitios de unión de los receptores FZD para los ligandos Wnt y los CRD de la proteína^19,20,24. En la actividad de sFRP4 se requieren la presencia tanto del dominio CRD como del NTR. Con respecto al papel del primero, es el lugar por el cual se establece la unión entre los ligandos Wnt y la glicoproteína mediante la formación de puentes disulfuro. Por otro lado, la importancia del domino NTR radica en que éste es el encargado de conferir estabilidad a la estructura proteica, permitiendo así una unión eficaz^5,6.

La homología existente entre el CRD de los receptores FZD y sFRP4 permite a los ligandos Wnt la capacidad de unirse tanto al receptor como a la proteína. De esta forma, en caso de que se establezca la unión con ésta última, no se desencadenará el inicio de la cascada de señalización del Wnt. Todo ello hace que se le atribuya a sFRP4 la función de inhibidor o modulador negativo de la vía, principalmente^{5,37,49,50,51}. Así mismo, se afirma que sFRP4 interviene como regulador competitivo en la vía de señalización del Wnt⁵². Por otro lado, existen estudios que sugieren que sFRP4 se puede comportar como un complejo proteico⁴. Atendiendo a dicha afirmación, se apunta que la actividad de la proteína va más allá de la inhibición de dicha vía, pudiendo actuar del mismo modo como transportador de proteínas o de ligandos Wnt de amplio rango. Es decir, llevando los ligandos de zonas con menor densidad de receptores, a aquellas donde existe una mayor concentración de los mismos^4,5.

Según los trabajos de Pawar & Rao y Claudel et al., se pueden resumir los diversos mecanismos de acción de sFRP4 como modulador de la vía de señalización del Wnt en los siguientes puntos.

De esta forma, se puede apreciar que sFRP4 interviene en la regulación de tres vías metabólicas relacionadas con el Wnt, como son la vía canónica, la vía no canónica del calcio y la vía no canónica PCP. Por otro lado, se ha observado que las proteínas sFRP son capaces de interaccionar con otras moléculas diferentes a las que intervienen en las vías del Wnt, como es el caso de la BMP (bone morphogenetic protein)⁵.

sFRP4 en el cáncer de mama

La génesis tumoral requiere de multitud de procesos celulares como son el desarrollo, la proliferación, la migración y la apoptosis; en los cuales las vías de señalización del Wnt presentan un papel clave^2,3,7. Por ello, se puede afirmar la existencia de una correlación entre la cascada de señalización del Wnt y el cáncer de mama en humanos^7,53. Además, se ha descrito que sFRP4 es una pieza clave para el inicio de la apoptosis en el cáncer de mama a través de la inhibición de la vía de señalización Akt/PKB, la cual bloquea la apoptosis^2,3.

El medio condicionante tumoral (tumour conditioned medium, TCM) que conforma el microambiente es necesario para que se den los cambios adecuados en la morfología y la función de aquellos componentes celulares no cancerígenos que rodean al tumor, como es el caso de las células madre mesenquimales, macrófagos, células endoteliales, células epiteliales y fibroblastos. Como resultado de la presencia de este TCM, se originan fibroblastos asociados al tumor (tumour - associated fibroblasts, TAFs), los cuales contribuyen a la progresión y metástasis tumoral⁵⁴. Debido a las diversas propiedades que presenta sFRP4 (antitumorales, antiangiogénicas y propoapoptóticas) se ha demostrado que la proteína juega diferentes papeles en el desarrollo del cáncer de mama⁵⁵. Como ejemplo de dicha intervención, se ha observado que sFRP4 interfiere en la diferenciación de las células madre adiposas derivadas del tejido mesenquimal (adipose derived mesenchymal stem cells, ADMSCs), evitando que éstas muestren un fenotipo carcinogénico y favoreciendo la respuesta al tratamiento^54,55.

El desencadenamiento de la carcinogénesis se asocia con eventos erráticos ocurridos a nivel genético y epigenético^24,56. El mecanismo por el que los niveles de sFRP4 se ven disminuidos en el cáncer de mama es la hipermetilación del promotor, debido a un fallo en la actividad del enzima DNA metiltransferasa 1 (DNMT1). Como consecuencia de ello, la pérdida de las funciones contribuye a la activación de la vía del Wnt en la génesis tumoral mamaria^1,24,57. En resumen, se afirma que la metilación del promotor conlleva una disminución en la expresión de sFRP4.

Por su parte, la complejidad etiológica que presenta el cáncer de mama, donde intervienen multitud de procesos, hace que sFRP4 presente varios frentes de actuación en los que su papel puede ser clave^6,58. Atendiendo a diversos estudios in vitro realizados sobre tejidos cancerígenos de diverso tipo, entre ellos el tejido mamario; existe una disminución en la expresión de sFRP4 en dicha enfermedad. De esta forma, un aumento en los niveles de la proteína se tradujo en una reversión de la patología^6,7,55. Sin embargo, se ha podido determinar que, en ciertos casos, un aumento en la expresión no se corresponde necesariamente con la apoptosis celular o con una disminución de los mecanismos anteriores. Esto puede deberse a la implicación de sFRP4 en otras vías de señalización⁵⁵. Todo ello lleva a pensar que una disminución en la expresión de sFRP4 se asocia con la aparición del cáncer de mama.

Finalmente, se ha observado que en concentraciones crecientes de glucosa sFRP4 interviene de forma negativa tanto en la adhesión, como en la capacidad de renovación de las células madre cancerosas (CSCs). Esto indica que la acción antiproliferativa de sFRP4 es independiente de aquellos nutrientes exógenos que son clave para el microambiente. Por otro lado, la acción de la proteína disminuye el ratio NAD⁺/NADH, haciendo a las CSCs más susceptibles al estrés inducido por las especies reactivas de oxígenos (EROs). Así mismo, sFRP4 es capaz de intervenir en el metabolismo de la glutamina, disminuyendo por tanto la secreción de glutamato⁵⁵. Todos estos mecanismos permiten afirmar que sFRP4 altera el metabolismo de las células madre cancerosas.

sFRP4 y el tratamiento del cáncer de mama

En el tratamiento del cáncer de mama se pueden seguir diversas estrategias. La principal de ellas es la cirugía, la cual se suele combinar con quimioterapia, radioterapia u hormonoterapia. Sin embargo, los numerosos efectos adversos y la posibilidad de desarrollar resistencia al tratamiento, hacen que los esfuerzos científicos se dirijan a buscar tratamientos que aborden la patología de una forma más específica^44,59,60.

Desde el descubrimiento de sFRP4, esta proteína se ha asociado con el inicio y el desarrollo del cáncer⁵⁵. De acuerdo con dicha afirmación, existen estudios que se han focalizado en dicha proteína y el tratamiento del cáncer de mama. Siguiendo esta línea, se ha descrito un aumento de la apoptosis como resultado de la intervención de sFRP4 en el ciclo celular de las células cancerosas^2,3,61. Dicha actividad se ve incrementada cuando la proteína se asocia con tratamiento quimioterápico. Ello se debe a un aumento en la actividad de la caspasa3, de manera que se aprecia un deterioro importante en las membranas mitocondriales de las CSCs. Todo ello indica que las células se encuentran próximas a la muerte. Además, sFRP4 actúa promoviendo la expresión de genes proapoptóticos (Bax) y disminuyendo la de genes antiapoptóticos (Bcl - x1), así como la de genes procarcinogénicos (ABCG2, CNDD1)⁶¹.

Por su parte, el uso de los ligandos Wnt y sus receptores como diana terapéutica demostró eficacia en modelos humanos y animales, aunque sus efectos en la metástasis del cáncer de mama no son contundentes⁷. Así mismo, se ha llegado a establecer una correlación entre el papel que desempeñan las CSCs en el inicio y desarrollo de la enfermedad con la vía de señalización del Wnt^44,61,62. Las CSCs se caracterizan por encontrarse formando agregados, que dan lugar a estructuras esferoides. De esta forma, se ha visto que el tratamiento de sFRP4 en combinación con los quimioterápicos doxorrubicina y cis - platino da como resultado la segregación de dichas estructuras y una disminución en el número de receptores en la membrana. Por lo tanto, se puede afirmar que sFRP4 permite a los agentes quimioterápicos que actúen inhibiendo la proliferación⁶¹.

Anteriormente se ha apuntado que la disminución de la expresión de sFRP4 se debe a la hipermetilación del promotor por acción errática de la DNMT1^1,24,57. De este modo, se ha obtenido una disminución de la supervivencia de las CSCs tumorales y una menor progresión de la enfermedad a través del aumento de la expresión de sFRP4 mediante el uso de agentes desmetilantes, como la 5 - azacitidina¹.

Finalmente, la diosgenina (DG) es una saponina esteroídica que se encuentra de forma natural en plantas como el ñame o el fenogreco y que se caracteriza por presentar propiedades antitumorales en determinados tipos de cáncer. Este fenómeno tiene su explicación en la activación de la proteína p53 y la vía de las caspasas. Por su parte, el tratamiento de CSCs procedentes de tumores mamarios, mediante la combinación de sFRP4 y DG como agentes terapéuticos, se tradujo en una disminución de la supervivencia de las células y una menor progresión de la enfermedad⁶³.