ORIGINAL 

Rápida identificación del 7-dehidrocolesterol en pacientes

con Síndrome de Smith-Lemli-Opitz

E. García-Fuentes, M.I, Vicioso, E. del Castillo. 

Servicio de Análisis Clínicos. Hospital Materno-Infantil. Málaga. 

Palabras clave: síndrome de Smith-Lemli-Opitz, 7-dehidrocolesterol, colesterol oxidasa, métodos enzimáticos, espectometría ultravioleta. 

Key Words: Smith-Lemli-Opitz syndrome, 7-dehidrocholesterol, cholesterol oxidase, enzymatic assays, ultraviolet epectrometry.

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Resumen 

El síndrome de Smith-Lemli-Opitz es un trastorno autosómico recesivo caracterizado por unos bajos niveles de colesterol sérico y un acúmulo de su precursor, el 7-dehidrocolesterol. En los pacientes con este síndrome, el método enzimático normalmente utilizado para la medida del colesterol (basados en la colesterol oxidasa) da unos valores falsamente altos. El diagnóstico del síndrome siempre se tiene que confirmar poniendo de manifiesto valores elevados de 7-dehidrocolesterol. Hemos usado un método rápido y simple mediante espectrofotometría ultravioleta para la detección de dicho compuesto. El 7-dehidrocolesterol mostró un espectro ultravioleta característico, con unas absorciones máximas a 271, 282 y 293 nm. Este test parece ser suficientemente sensible para detectar niveles elevados de 7-dehidrocolesterol. Concluimos que la determinación por espectrofotometría ultravioleta del 7-dehidrocolesterol sérico es un método simple y barato para detectar rápidamente el síndrome de Smith-Lemli-Opitz en la mayoría de los laboratorios cínicos. 

Summary 

Smith-Lemli-Opitz syndrome is an autosomal recessive disorder characterised by a low serum cholesterol levels and an accumulation of his precursor, 7-dehydrocholesterol. The enzymatic method for cholesterol measurement (based on cholesterol oxidase) give falsely high values for serum cholesterol in samples from patients with this syndrome. However, the diagnosis should always be confirmed by demonstrating markedly increased concentration of 7-dehydrocholesterol. We used a simple and rapid method for detection of serum 7-dehydrocholesterol by use of ultraviolet spectrophotometry. 7-dehydrocholesterol showed characteristic ultraviolet spectrum with absorption maxim at 271, 282 and 293 nm. This test appears to be sensitive enough to detect increased levels of 7-dehydrocholesterol. We conclude that ultraviolet spectrophotometry determination of serum 7-dehydrocholesterol is a simple and cheap test to detect the Smith-Lemli-Opitz syndrome rapidly in clinical laboratories. 

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Recibido: 4-IX-00
Aceptado: 21-III-01

Correspondencia: Eduardo García Fuentes
Pintor Velázquez 12, 5º E
18002 Granada

 

Introducción 

El síndrome de Smith-Lemli-Opitz (S-SLO) es un trastorno autosómico recesivo descrito en 1964 por Smith y cols.¹. Se caracteriza por múltiples anomalías congénitas. Los rasgos clínicos más típicos son microcefalia, retraso del crecimiento y desarrollo, anomalías faciales (micrognatia, ventanas nasales en anteversión, etc.), malformaciones a nivel genital (criptorquidia, hipospadias, genitales ambiguos, etc.) y en las extremidades (polidactilia, clinodactilia, etc.), defectos cardiacos, catara 
tas y otras numerosas anomalías tanto a nivel externo como en los órganos internos². 

La incidencia del S-SLO en la población caucásica de América del Norte se estima en 1:20.000 nacimientos. En España existen menos casos descritos, aproximadamente unos 20^3,4. 

Recientemente se demostró que en el S-SLO existían unos niveles anormalmente bajos de colesterol y elevados los de su precursor, el 7-dehidrocolesterol [5,7-colestandien-3ß-ol] (7-DHC)⁵ y el 8-dehidrocolesterol [5,8-colestandien-3ß-ol] (8-DHC)⁶. Estas anomalías bioquímicas son debidas a un bloqueo de la síntesis del colesterol, exactamente a nivel de la 7-dehidrocolesterol-Δ⁷-reductasa (7-DHC-Δ⁷-R), enzima responsable de la reducción del doble enlace C7-8 del 7-DHC (fig. 1)^7,8. 

Figura 1. Esquema simplificado de la biosíntesis del colesterol a partir de acetato. Las dos rutas señaladas convierten el colesterol, principalmente la de la derecha. El déficit de 7-DHC-A7-reductasa provoca el bloqueo de la biosíntesis del colesterol en los sujetos homozigotos con síndrome de Smith-Lemli-Opitz, con el consiguiente acúmulo de su precursos, el 7-DHC.

El diagnóstico clínico de este síndrome no siempre se puede realizar en base a los rasgos clínicos y muchas veces puede pasar inadvertido. Por esto, y con el objetivo de establecer con certeza la existencia del S-SLO, se necesita del diagnóstico bioquímico de dicho síndrome, el cual se realiza poniendo de manifiesto una importante elevación de los niveles séricos del 7-DHC y 8-DHC. El mejor método para el análisis del 7-DHC es la cromatografía gaseosa/espectrometría de masas (CG/EM)⁶. Para ello se necesita disponer de un material muy costoso y sofisticado, el cual no se encuentra normalmente en los laboratorios clínicos. 

Debido a esto, hemos adaptado un método espectrofotométrico reciente⁹ muy simple y rápido para la detección cualitativa al ultravioleta (UV) del 7-DHC sérico. El estudio se realizó con el fin de evaluar el uso de la determinación espectrofotométrica del 7-DHC para la detección de este síndrome. 


Material y métodos 

Pacientes 

Se analizó el suero de un paciente de 5 meses de edad con el diagnóstico clínico de S-SLO y de 80 sujetos (40 niños y 40 adultos) sin los signos y síntomas clínicos típicos de dicho síndrome, alguno de los cuales estaban bajo algunas condiciones clínicas especiales (ictericia, hipercolesterolemia, pancreatitis, insuficiencia renal crónica, traumatismo, etc.). Estas personas fueron incluidas como controles con el fin de observar la posible existencia de algún falso positivo en el método de detección al UV del 7-DHC. 

Determinación cualitativa del 7-DHC 

El método empleado⁹ se basa en la obtención del espectro de absorción característico del 7-DHC, el cual muestra unos picos máximos en el UV a 271, 282, y 293 nm¹⁰. 

En un primer paso se realiza una extracción de lípidos del suero. Se toma una alícuota de 200 μl de suero en un tubo de cristal, añadiéndosele 6 volúmenes (1.2 ml) de mezcla extractora n-hexano:etanol (5:1, v/v). Tras agitación en vortex durante 30 s, se centrifuga a 3000 r.p.m. durante 1 min. Se recoge la fase superior (n-hexano) y se transfiere a una cubeta de cuarzo de 1 ml para la medida de la absorbancia en el UV en un espectrofotómetro Ultrospec III (Pharmacia LKB, Suecia). 

Se realizan medidas consecutivas de la absorbancia en un rango de longitudes de onda comprendido entre 220 y 300 nm, utilizándose n-hexano como blanco de todas las determinaciones. La determinación del cociente entre las absorbancias a 282 y 234 nm se realizó para eliminar la absorbancia de fondo existente a 282 nm, la cual parece ser debida a sustancias que tienen su máxima absorción a 234 nm⁹. 

Determinación del colesterol total 

La medida del colesterol total (CT) se realizó mediante un método enzimático (CHOD-PAP, Olimpus Diagnostica, Ireland) en un OLYMPUS AU800. En un primer paso, los ésteres de colesterol son hidrolizados gracias a la colesterol esterasa. Posteriormente la totalidad del colesterol, tanto el libre como el procedente de la hidrólisis, es oxidado mediante la colesterol oxidasa a Δ4-colestenona. El H₂O₂ producido en esta reacción se determina cuantitativamente gracias a una peroxidasa, la cual transforma la 4-aminofenazona y el fenol en 4-(p-benzoquinona-monoimino)-fenazona, midiéndose este compuesto espectrofotométricamente. 

Determinación por cromatografía gaseosa 

La confirmación de los niveles de CT y 7-DHC en el paciente con S-SLO se realizó mediante cromatografía de gases (CG). 

Estadística 

Los datos se expresan como media ± SD. 

Resultados 

Análisis cualitativo al UV del 7-DHC 

El espectro de absorción al UV del suero del paciente con S-SLO se muestra en la figura 2. Dicho espectro muestra unos picos de absorción máximos a 271, 282 y 293 nm, los cuales son característicos del 7-DHC (tabla 1). 

Fig 2. Espectro ultravioleta obtenido a partir del suero del paciente en S-SLO.

 

	Absorbancia	Absorbancia	Absorbancia	Absorbancia
	271 nm	282 nm	293 nm	282/234
Paciente S-SLO	1.121	1.170	0.794	2.88
Controles (n=80)*	0.065 ± 0.028	0.061 ± 0.024	0.063 ± 0.015	0.25 ± 0.07

En la figura 3 se representa el intervalo de espectros obtenidos a partir de los sueros control. En ningún caso se encuentra ni el espectro típico ni los picos máximos propios del 7-DHC. 

Figura 3. Intervalo de espectros ultravioleta obtenidos a partir del suero de los controles

Por otro lado, se comprueba que el cociente entre las absorbancia a 282 y 234 nm es muy superior en el paciente objeto de estudio que en los controles (tabla 1). 



Análisis enzimático del colesterol 

La tabla 2 nos muestra la concentración de CT determinada por el método enzimático, el cual utiliza la colesterol oxidasa. Para el paciente con S-SLO se observan unas concentraciones bastante inferiores a las obtenidas en los controles de su misma edad. 

	CT	CT (CG)	7-DHC (CG)
Paciente S-SLO	40	29.2	49.2
Controles (n=40)	149 ± 23 *	100-180**	< 0.3**

Análisis por cromatografía de gases del 7-DHC y el colesterol 

La CG de la muestra de suero del paciente con S-SLO nos confirma una concentración muy elevada de 7-DHC. 

La concentración de CT obtenida mediante este método es aún más baja que la obtenida por el método enzimático (29.2 frente a 40 mg/dl). 



Discusión 

El S-SLO es una enfermedad congénita asociada a numerosas anomalías, retraso mental y variabilidad fenotípica. Los signos y síntomas de la enfermedad no son específicos y pueden ser confundidos con otras enfermedades³. 

Recientemente se ha descubierto que este síndrome está causado por un déficit de la enzima 7-dehidrocolesterol-Δ⁷-reductasa^7,8. La disminución del colesterol y la elevación de la concentración sérica de 7-DHC son características de esta enfermedad y se pueden usar para el diagnóstico bioquímico del S-SLO. 

La determinación del CT suele ser realizada en la mayoría de los casos mediante métodos enzimáticos. El análisis del CT por el método CHOD-PAP nos muestra una concentración bastante disminuida. Sin embargo, cuando lo analizamos por CG detectamos unos niveles más bajos de CT. Esto, junto con estudios previos^11,12, nos hacen sospechar que el 7-DHC puede interferir en la medida del colesterol sérico. Aparentemente, la enzima colesterol oxidasa utilizada en el método CHOD-PAP no discrimina bien entre el colesterol y el 7-DHC. Algo semejante pone de manifiesto Slotte cuando estudia la colesterol oxidasa procedente de un hongo¹³. 

Aunque el test enzimático utilizado para la medida del colesterol sérico en este síndrome da valores de CT falsamente elevados, casi siempre éstos se encuentran lo suficientemente bajos como para sospechar, junto con el diagnóstico clínico, del S-SLO. 

Aunque la disminución del colesterol es típica de este síndrome, y nuestro paciente así lo manifiesta, en algunos casos aislados no están muy disminuidas dichas concentraciones, pudiendo pasar desapercibido el síndrome. 

Para un correcto diagnóstico bioquímico del síndrome se deben de poner de manifiesto valores elevados de 7-DHC. La identificación de este compuesto necesita de un equipamiento costoso y sofisticado (CG), no disponiéndose habitualmente de él en la mayoría de los laboratorios clínicos. 

En la CG se requiere de una hidrólisis previa de la muestra con el fin de convertir el alto porcentaje de 7-DHC esterificado⁷ en su forma libre. Posteriormente se tiene que tratar la muestra para convertir el 7-DHC en un derivado, el cual ya puede ser analizado directamente en el cromatógrafo de gases. El método utilizado en este trabajo tiene la ventaja frente a la CG de que no necesita hidrólisis previa de los ésteres de 7-DHC ya que detecta tanto la forma libre como la esterificada⁹. Tampoco necesita del segundo tipo de reacción anteriormente comentado. Únicamente se tiene que realizar una sencilla extracción de los lípidos mediante la mezcla extractora n-hexano:etanol. 

Muchos esteroles, entre ellos el 7-DCH, pueden ser identificados y cuantificados mediante espectrofotometría UV. La longitud de onda máxima observada depende del tipo, posición y extensión del sistema insaturado conjugado. El principal pico de absorción máxima se sitúa a 282 nm (figura 2). Junto con el anterior se encuentran otros 2 picos a 271 y 293 nm, aunque no tan importantes. El conjunto del espectro, con sus tres picos de máxima absorción, es característico del 7-DHC. Este espectro típico se debe a la presencia del sistema Δ^5,7-dieno homoanular en la molécula del 7-DHC. A pesar de no cuantificar la presencia del 7-DHC, la simple observación del espectro obtenido al UV nos confirma la existencia de altas concentraciones de dicho compuesto. 

A pesar de no estar afectados los controles por el S-SLO, existe una ligera absorbancia a 282 nm. Esta absorbancia de fondo puede ser eliminada si consideramos el cociente entre las absorbancias a 282 y 234 nm⁹. De esta forma el cociente entre dichas absorbancias también lo podemos utilizar para el diagnóstico bioquímico del S-SLO (tabla 1), al diferenciar claramente al paciente con S-SLO del resto de los sujetos normales. El método utilizado es muy rápido y sencillo y permite ser empleado en la mayoría de los laboratorios dada la sencillez de los aparatos necesarios. 

Aunque este método sólo lo hemos podido evaluar en un paciente con S-SLO (por la escasa incidencia en nuestra población), hemos visto que tiene un 100% de sensibilidad y especificidad. No hemos encontrado falsos positivos entre todos los controles analizados. 

En conclusión, para un correcto diagnóstico del S-SLO se necesita de la determinación bioquímica de los niveles de colesterol y 7-DHC. Los métodos enzimáticos normalmente utilizados para la medida del colesterol son suficientes como para detectar la disminución de dicho compuesto. La CG, a pesar de dar valores más exactos, no se encuentra de manera habitual en los laboratorios clínicos. La determinación al UV del 7-DHC nos proporciona un método rápido, sencillo y con suficiente sensibilidad como para ser utilizado en el S-SLO. 

 

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