Resumen

Aportamos un caso de incremento concomitante de los valores séricos de la enzima láctico deshidrogenasa (LD) y de las inmunoglobulinas IgA e IgG, en un paciente con poliartritis crónica y signos de enfermedad autoinmune, debido a la formación de complejos solubles entre estas inmunoglobulinas y las isoenzimas plasmáticas LD4 y LD5.

La naturaleza macromolecular de la elevación de la actividad de LD en este paciente, fue confirmada por electroforesis para isoenzimas de LD sobre gel de agarosa. La identificación de las inmunoglobulinas ligadas se llevó a cabo mediante una técnica de inmunosubstracción, utilizando anticuerpos específicos unidos a soportes sólidos, antes de la electroforesis. Con la exposición de la muestra de suero a los anticuerpos correspondientes se consigue la separación electroforética de las 5 bandas isoenzimáticas de LD y por tanto su identificación y cuantificación.

Abstract

We report a case the concomitant increase of lactate dehydrogenase enzyme (LD; EC 1.1.1.27), IgG and IgA immunoglobulins levels, in the serum from a patient suffering chronic polyarthritis and presenting signs of autoimmune disease, due to make of solubles complex between these immunoglobulins and LD4 and LD5 plasmatic isoenzymes.

The macromolecular nature of the patient's LD activity elevation, was demostrated by electrophoresis on agarose gel for LD isoenzymes. To identifity the bound immunoglobulins we propose a immunosubstration method, using specific antibodies coupled to solid supports, before the electrophoretic run. With samples of serun exposition to corresponding antisera is obtained the electrophoretic separation of the five LD isoenzymatic bands therefore its identification and quantification.

Recibido: 6-VIII-00
Aceptado: 1-XII-00

Correspondencia:
Mª Rosa Sánchez Navarro
Avenida Dr. Olóriz 16. 18012-Granada
rsanchez@hsc.sas.cica.es

Introducción

Las macroenzimas son complejos formados por la unión de enzimas con proteínas plasmáticas. Amilasa, creatin quinasa (CK), fosfatasa alcalina (ALP), aspartato aminotranferasa (AST), lactato deshidrogenasa (LD) etc., pueden ligarse a inmunoglobulinas IgG, IgA o a beta-lipoproteínas y formar complejos macromoleculares solubles, con un alto peso molecular y una vida media mayor que las enzimas no ligadas^1-5. La formación de estos complejos inmunoglobulina-enzima no está asociada a ninguna enfermedad específica sin embargo su presencia puede condicionar un aumento de los niveles séricos de la enzima de forma aislada y persistente y conducir a errores diagnósticos y terapias equivocadas^6-7.

La láctico deshidrogenasa (LD; EC 1.1.1.27), es una enzima del metabolismo intermedio presente, en todas las células del organismo, bajo cinco formas isoenzimáticas diferentes (LD 1,2,3,4,5), fácilmente identificables por electroforesis. Se han descrito macro-LD formadas por la unión de una o varias isoenzimas con inmunoglobulinas sin que se haya podido establecer relación con un proceso patológico determinado^{8- 13}.

Aportamos un caso de incremento concomitante de los valores séricos de lactato deshidrogenasa (LD) y de inmunoglobulinas IgA e IgG, en un enfermo con diagnóstico de poliartritis crónica, debido a la formación de complejos de estas inmunoglobulinas con las isoenzimas LD4 y LD5. Esta macro-LD fue confirmada por electroforesis para isoenzimas de LD sobre gel de agarosa y la identificación de las inmunoglobulinas ligadas se llevó a cabo utilizando técnicas de inmunosubstracción.

Material y Métodos

Actividad enzimática. Las actividades totales de LD, amilasa, CK, ALP, AST, γ-GT, se midieron a 37º C, en Autoanalizador Hitachi 917 con reactivos Boerhinger Mannheim (Automated Analysis for BM/Hitachi, 917, Mannheim, F.R.G).

Electroforesis de isoenzimas. Las isoenzimas de LD se separaron por electroforesis con el sistema Paragon, utilizando kits "Lactacte Dehydrogenase Isoenzyme Electrophoresis" (Beckman Instruments, Inc.,Fullerton CA, 92634-3100). Se utilizó gel de agarosa tamponado a pH 8,2. La electroforesis tuvo lugar a 100 voltios durante 20 minutos; una vez finalizada, se incubaron los geles con un substrato específico para la enzima durante 30 minutos a 45ºC en cámara húmeda. La cantidad relativa de las bandas se cuantificó a 600 nanómetros, en un densitómetro Appraise (Beckman Instruments) y la actividad de cada isoenzima se calculó como porcentaje de la actividad enzimática total.

Para descartar la presencia de otras macroenzimas se realizaron electroforesis de ALP, amilasa, y CK, con el sistema Paragon/Beckman. Las isoenzimas de ALP se separaron sobre gel de agarosa tamponado en buffer (Tris/borato, pH 9,45), utilizando kits Isopal Plus (Analis, Namur, Belgium), utilizándose para la confirmación de las diferentes fracciones metodología complementaria, previa a la electroforesis; para facilitar la separación de las bandas se incubó, una alícuota de suero con neuraminidasa Isopal (Beckman P/N 446145), (100 µL de suero + 20 µL de neuraminidasa: 30 minutos a 37ºC); para confirmar y/o diferenciar la fracción ósea y macromolecular se utilizó la precipitación con lecitina del germen de trigo, (Lecitin WGA, Boehringer Mannheim, 1065769), (100 µL de suero + 100 µL de lecitina: 30 minutos a temperatura ambiente y posterior centrifugación durante 15 minutos a 3500 rpm)¹⁴.

Las isoamilasas se separaron sobre gel de agarosa tamponado en buffer (Tris/Borato, pH 6,95) utilizando kits Isoamyl (Analis, Namur, Belgium). Las isoenzimas de CK se separaron con el sistema Paragon Electrophoresis System (Beckman, CK, P/N 655930), utilizándose gel de agarosa tamponado a pH 7.

En todos los casos, la cantidad relativa de las bandas se cuantificó con un densitómetro Appraise/Beckman, a 600 nanómetros para isoenzimas de ALP e isoamilasas y midiendo la fluorescencia a 340 nanómetros, para las isoenzimas de CK. La actividad de cada isoenzima se expresó como porcentaje de su respectiva actividad enzimática total.

Identificación de inmunoglobulinas ligadas. La identificación de las Inmunoglobulinas ligadas a LD se llevó a cabo utilizando una técnica de inmunosubstracción, que permite extraer una clase de inmunoglobulina de una muestra de suero por medio de un soporte sólido acoplado a un fijador para la inmunoglobulina específica. 155 µL de muestras de suero diluidas (1:7) fueron expuestas, a dos soportes sólidos conteniendo fijador especifico para IgA e IgG (155 µL de anticuerpo IgA antihumano ligado a agarosa; 155 µL de proteína G recombinada ligada a agarosa ) después de exponer cada muestra a los soportes sólidos se las sometió, de nuevo, a eletroforesis para isoenzimas de LD.

Otros parámetros bioquímicos. Electroforesis de proteínas séricas e inmunofijación (IFE/s) se determinaron por Electroforesis capilar de zona (Sistema Paragon CZE 2000 de Beckman). Inmunoglobulinas e inmunocomplejos circulantes (ICC) por inmuno-nefelometría cinética empleando el analizador de proteínas específicas Array 360 de Beckman. Marcadores tumorales por enzimoinmunoensayo de micropartículas (MEIA) con el sistema AXSYM/Abbot.

La bibliografía se obtuvo gracias al Servidor de la Hemeroteca de la Facultad de Medicina de Granada, utilizando el método on-line y recuperando las publicaciones sobre el tema incluídas en el sistema internacional MEDLINE desde los años 1978 a 1999.

Resultados

Caso Clínico: varón de 52 años de edad que acude a la consulta de Reumatología de nuestro Centro, con una historia, iniciada hace 1 año, de inflamación de 5º dedo de pie izquierdo, que se atribuyó a gota, y posteriormente poliartralgias en forma de brotes que afectan a pies, tobillos, hombros y manos y que en los últimos meses se acompaña de anorexia y perdida de peso. A la exploración física destaca tumefacción con aumento de calor local de MCFs, carpos, rodillas y tobillo izquierdo. Limitación y dolor en codos y hombros. Ecografía hepática y TAC toracoabdominal normal. La gammagrafía ósea confirma poliartritis de grandes articulaciones.

La analítica pone de manifiesto, VSG> 100, PCR >20, LDH 1300 UI/L, g-GT 96 UI/L, FA 486 UI/L, hiperproteinemia (9,4 g/dl) con IgG e IgA elevadas, Inmunocomplejos circulantes (ICC) 8,44 µg/ml y leucocitosis (10.200) con neutrofilia (70%), como datos a valorar.

Resultados: La tabla I muestra los valores de los parámetros analíticos más relevantes encontrados en este paciente. La electroforesis de isoenzimas de LD muestra un complejo macromolecular de LD4 y LD5 que justifica el aumento de la aumento de la actividad sérica total de la enzima. En la figura 1, se muestra el perfil isoenzimático LD del paciente y se compara con el perfil de un individuo normal.

Figura 1. A: perfil isoenzimático de un suero normal (LD: 1,2,3,4,5).
B: perfil isoenzimático del suero del paciente (LD: 1,2,3, macro-LD).

Las Inmunoglobulinas IgA (1250 mg/dl) e IgG (2600 mg/dl) están elevadas pero el proteinograma y la inmunofijación por substracción (IFE/s) descartan la presencia de bandas monoclonales. La electroforesis de las diferentes isoenzimas, amilasa, ALP y CK descartan también la existencia de otras macroenzimas.

La exposición de la muestra de suero diluído a los anticuerpos específicos permite la separación de las 5 bandas isoenzimáticas de LD y por tanto su identificación y cuantificación.

La figura 2, muestra una placa de electroforesis de LD, en la que se puede apreciar las diferentes isoenzimas correspondientes a: suero de un individuo normal; suero del paciente mostrando la macro-LD de sus isoenzimas LD4 y LD5 y suero del paciente después de someter la muestra de suero a la inmunosubstracción de las inmunoglobulinas ligadas.

Figura 2. Electroforesis de LD en placa de agarosa :1,9 suero del paciente diluido (1:2); 2, 3, suero del paciente sin diluir; 4,10 suero normal; 5,6 electroforesis del suero del paciente tras exposición a anticuerpos IgA antihumano ligado a agarosa; 7,8 electroforesis tras exposición del suero a proteína G recombinada ligada a agarosa.

Discusión

Los complejos inmunoglobulinas-enzimas son desórdenes caracterizados por un aumento persistente de la actividad sérica de la enzima ligada. El significado fisiopatológico y el mecanismo implicado en la formación de estos complejos macromoleculares son poco conocidos. En la mayor parte de los casos, el hallazgo suele ser casual y se ha descrito tanto en individuos sanos como en pacientes con enfermedades diversas y aparentemente no relacionadas.

En general se puede sospechar la presencia de una macroenzima cuando los niveles séricos de una determinada enzima aparecen elevados, de forma aislada, sin clínica que lo justifique y hay que descartar su presencia para evitar diagnósticos equivocados. Las macroenzimas son siempre una potencial causa de error; una macro-CK puede interferir los métodos de inmunoinhibición empleados para la determinación de CKMB dando resultados falsamente elevados de este importante marcador bioquímico del infarto agudo de miocardio. También, cuando estos complejos aparecen asociados con algún tipo de patología, pueden ser causa de desorientación en el diagnóstico, así, una macroamilasemia asociada a dolor abdominal inducirá a pensar en una pancreatitis^15,17.

En el caso concreto de la láctico deshidrogenasa y, aunque el significado no está claro, la presencia en el suero de complejos macromoleculares LD, se ha relacionado con enfermedades autoinmunes, hepáticas, miocárdicas y lesiones malignas^18-22.

Presentamos el caso de un paciente, diagnosticado de poliartritis crónica de grandes articulaciones, que presentaba un aumento de los niveles séricos de LD. La electroforesis de isoenzimas de LD, sobre gel de agarosa, demostró la presencia de un complejo macromolecular formado por las isoenzimas LD4 y LD5 con, probablemente, las inmunoglobulinas plasmáticas IgG e IgA, las cuáles también aparecían elevadas en el suero de este enfermo.

Para determinar la naturaleza de las proteínas ligadas a las isoenzimas de LD se utilizaron técnicas de inmunosubstración. La primera inmunofijación por substracción (IFE/s) fue descrita por Aguzzi y Poggi en 1977, se realizó utilizando antisueros específicos unidos a bolas de sepharose antes de la separación electroforética. La muestra de suero es incubada con las bolas de sepharose unida a los antisueros correspondientes, a ellas se unen las respectivas inmunoglobulinas formando unos complejos de alta densidad que precipitan desapareciendo del sobrenadante, que es utilizado para la separación electroforética^23-25.

Con la inmunosubstracción de las inmunoglobulinas se consiguió, no solo confirmar la naturaleza de las proteínas ligadas sino también la separación, identificación y cuantificación de las 5 isoenzimas de LD la muestra.

En este paciente se descartaron la existencia de otras macroezimas. La razón por la que se forman complejos LD en el suero de este enfermo no está clara y podría explicarse bien por la presencia de moléculas de IgA e IgG con una alta afinidad por la LD normal, o alternativamente, por una alta afinidad por las IgA e IgG normales de las isoenzimas de LD como consecuencia de alguna alteración no definida en el suero del paciente. Mas información acerca del mecanismo de formación de complejos entre enzimas e inmunoglobulinas serian necesarios para poder establecer el significado de la formación de complejos macromoleculares de LD y su posible relación con un proceso patológico determinado.

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