NOTA TÉCNICA 

Citoquímica de la fosfatasa ácida. Consideraciones metodológicas 

A. Santana, A. Lemes, B. Bolaños, A. Parra, M. Martín, Teresa Molero. 

Servicio de Hematología. Hospital de Gran Canaria "Dr. Negrín". 

Palabras clave: fosfatasa ácida, métodos citoquímicos, colorantes diazoicos, eritoblastos. 

Key Words: acid phosphatase, citochemical methods, diazo dyes, erithroblasts. 

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Recibido: 6-VII-00
Aceptado: 1-XII-00

Correspondencia: Angelina Lemes Castellano
Servicio de Hematología. Hospital de GC "Dr. Negrín"
Barranco de la Ballena s/n
35020 Las Palmas de Gran Canaria
E-mail: alemes@correo.hpino.rcanaria.es

I. Introducción 

Las fosfatasas ácidas (FA) son enzimas hidrolíticas, de localización lisosómica, pertenecientes al grupo de las fosfomonoesterasas, que actúan sobre los ésteres del ácido fosfórico^1,2. 
La detección citoquímica de la FA en el diagnóstico hematológico queda prácticamente restringida al estudio de los síndromes linfoproliferativos agudos o crónicos. El 90% de las leucemias agudas linfoblásticas (LAL) de estirpe T y el 5% de las no T presentan una reacción positiva de localización centrosómica³, siendo negativa en el resto de las LAL. De igual modo, los síndromes linfoproliferativos crónicos de línea T suelen cursar con intensa positividad para esta enzima. De particular interés resulta el estudio de la FA en la tricoleucemia, ya que la actividad enzimática posee un patrón de distribución celular específico y una característica resistencia al tartrato⁴. 
La mayoría de los métodos de visualización citoquímica de la actividad FA se basan en la generación de colorantes diazoicos⁵. En ellos, las células a estudio son sometidas a incubación con un sustrato, de forma que el producto de la reacción pueda interaccionar con una sal diazoica (reacción de copulación), provocando la aparición de un precipitado coloreado⁶. 
La dificultad de obtener buenos resultados en la citoquímica de la FA tras el cambio a un nuevo hospital, nos hizo profundizar en los aspectos técnicos de la misma. Analizando la descripción de las técnicas clásicas^7,8 y, usando reactivos y material disponible en nuestro laboratorio, hemos logrado realizar una adaptación empírica de la técnica clásica basada en la generación de reacciones simultáneas de captura⁹, obteniendo resultados muy superiores a los que siempre habíamos accedido. 
El método adaptado que se presenta cumple los requisitos básicos que nos habíamos propuesto alcanzar: preservación de la actividad enzimática, alta especificidad y sensibilidad de la tinción, facilidad de realización y obtención de unos resultados microscópicos de excelencia que permitan una valoración fiable. 

II. Técnica. 

La técnica citoquímica adaptada que presentamos puede realizarse eficazmente sobre extensiones de sangre periférica (SP) o médula ósea (MO). Asimismo, se ha comprobado su eficacia en otro tipo de muestras, incluidas aquéllas que necesitan de citocentrifugación previa como es el caso de los lavados broncoalveolares. Se describen a continuación las diferentes etapas del proceso, todas ellas de extrema importancia en la obtención final de resultados de excelencia. 

IIa. Preparación de reactivos. 

Solución Fijadora: disolver en 100ml de agua destilada 0,48 g de ácido cítrico (4,5 mM); 0,34 g de citrato trisódico dihidratado (2,3 mM) y 0,09 g de cloruro sódico (3,1 mM). Añadir 262,9 g de acetona (9,02 M) y 16,54 g de formaldehído (1,09 M). Disolver bien, ajustar el pH a 6,0 y aforar a 500 ml con agua destilada. Almacenar a 4 °C. 
Tampón Acetato: disolver 25,4 g de acetato sódico (1,86 M) en 50 ml de agua destilada. Añadir 3,6 ml de ácido acético glacial (0,64 M). Aforar a 100 ml con agua destilada. Filtrar con filtro de acetato de celulosa estéril de 0,45 mm y comprobar que el pH=5,5. Almacenar a 4°C hasta su uso. 
Tampón Tartrato: disolver 14,4 g de acetato sódico (2,11 M) en 50 ml de agua destilada. Añadir 1,05 ml de ácido acético glacial (0,18 M) y 3 g de ácido L(+) tartárico (0,4 M). Disolver completamente, filtrar con filtro estéril de 0,45 mm y comprobar que pH=4,9. Guardar a 4°C hasta su uso. 

IIb. Procedimiento técnico. 

Los frotis de las muestras a estudio, tras su secado al aire durante al menos 10 minutos, deben ser fijados en la solución fijadora fría (4°C) durante exactamente 30 segundos. Tras esta corta fijación, las muestras deben ser lavadas con abundante agua bidestilada a presión dejando escurrir el exceso de agua. 
La solución de incubación debe ser preparada "in situ" tal y como sigue: 44 ml de agua bidestilada, 3 ml de tampón acetato, 3 ml de sustrato Naftol ASBI fosfato (Naphtol AsBi Phosphoric Acid Solution, Sigma Diagnostics, St Louis, USA) conteniendo 12,5 mg/ml de C₁₈H₁₅BrNO₆P y 24 mg de la sal diazotada estable 2-metil-4-(2-metilfenil)-azobencenodiazosulfato (Fast Garnet GBC Sulfate Salt, Sigma Chemical Co, St Louis, USA). Disolver mediante agitación durante al menos 5 minutos y filtrar la disolución dos veces consecutivas a través de papel de filtro dispuesto en pliegues. La solución rojiza traslúcida de pH 5,2, debe ser introducida entonces en un vaso de Coplin junto a los frotis y a un pequeño imán, de tal forma que la solución cubra totalmente las extensiones y que el imán pueda girar libremente, preferiblemente en la zona central del vaso (figura 1). 

Figura 1. Disposición de las extensiones y la solución de incubación en el Vaso de Coplin.

Hemos comprobado que la mezcla de reacción descrita es válida para la incubación simultánea de hasta cuatro preparaciones, disminuyendo la intensidad final de las células positivas si se introducen un número superior de muestras en la misma. Las muestras deben ser incubadas en oscuridad durante 2 horas a temperatura ambiente, situando el vaso de Coplin sobre un agitador magnético que se someterá a agitación máxima. Es importante que la reacción de incubación se desarrolle en un lugar alejado de corrientes de aire, cambios bruscos de temperatura y de vapores o disolventes volátiles. 
Tras el periodo de incubación, los portaobjetos deben ser lavados en agua corriente. Una forma eficaz de realizar el lavado consiste en depositar los portaobjetos en los extremos de un vaso de Coplin, situando el mismo bajo la corriente de agua de un grifo. De esta forma y con la regulación adecuada del flujo de agua, se consigue que el chorro de agua impacte en el fondo del vaso de Coplin generando multitud de burbujas de aire que arrastran hacia arriba cualquier depósito indeseado. Tras 10 minutos de dicho lavado, las muestras deben ser pasadas por agua destilada a presión, dejándolas escurrir suficientemente. 
Las muestras de MO son contrastadas durante 15 minutos en una disolución de Hemalumbre de Mayer (Leucognost, Merck, Alemania) y Azul de Metileno (1,4% p/v en etanol, Sigma, St Louis, USA) en una proporción de 3 a 1 (v/v), tras lo cual son lavadas en agua corriente durante 10 minutos siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente. En el caso de SP u otro tipo de muestras, se prefiere el contraste con una disolución de Azul de Metileno (1 ml de Azul de Metileno (1,4% p/v en etanol, Sigma, St Louis, USA), 5 ml de agua destilada y 4 ml de etanol absoluto) durante 15 minutos, tras lo cual deben ser lavadas en agua corriente durante exactamente 1 minuto. 
Tras aclarado rápido con agua destilada, las muestras deben ser secadas al aire durante 10 minutos pudiendo ser montadas en cualquier medio disponible (en nuestro caso usamos EUKITTR, Alemania). La visualización microscópica permite observar las células contrastadas en color azul, apareciendo un precipitado granular rojo intenso en aquéllas que presenten actividad FA positiva. No debe aparecer difusión ni fondo apreciable (figuras 2 y 3). 

Figura 2. Linfocito maduro y neutrófilo en sangre periférica mostrando positividad para fosfotasa ácida de localización centrosómica y citoplasmática difusa  respectivamente (x 1000).

Figura 3. Células plasmáticas de médula ósea en un paciente con Mieloma Múltiple presentando positividad
granular para fosfatasa ácida (x 1000).

Para la comprobación de la tartrato-sensibilidad, el procedimiento general es idéntico pero es necesario una mezcla de incubación, de pH final 5,0, ligeramente diferente: 41 ml de agua destilada, 3 ml de tampón acetato, 3 ml de Naftol ASBI fosfato( Naphtol AsBi Phosphoric Acid Solution, Sigma Diagnostics, St Louis, USA) conteniendo 12,5 mg/ml de C₁₈H₁₅BrNO₆P y 3 ml de tampón tartrado en los que deben disolverse 24 mg de Fast Garnet GBC(Fast Garnet GBC Sulfate Salt, Sigma Chemical Co, St Louis, USA). 

III. Discusión 

Las extensiones o improntas de las muestras pueden permanecer a temperatura ambiente sin fijar durante semanas, sin pérdida aparente de la actividad enzimática. Aunque el almacenaje de las muestras en frío ayude a la preservación de la actividad enzimática, coincidimos con aquellos autores que observan en él más inconvenientes que ventajas10. En cuanto a la solución de fijación, se ha optado por la combinación de tres reactivos (acetona, formol, citrato) en concentraciones tales que permiten preservar con eficacia la actividad enzimática y la morfología celular. 
El sustrato (un éster fosfato del Naftol ASBI), permite una tinción altamente cromogénica sin apenas fondo ni difusión. A pesar de su baja solubilidad acuosa y su lenta actividad hidrolítica, los largos periodos de incubación necesarios favorecen una reacción de captura más eficaz⁷. Las concentraciones del sustrato que utilizamos, algo superiores a las descritas como óptimas¹⁰, aseguran que no haya limitación de sustrato en nuestra habitual incubación simultánea de cuatro extensiones. El uso de un menor número de extensiones permite reducir proporcionalmente el volumen de sustrato descrito. 
En cuanto al agente copulador, está descrito que el derivado diazotado de la pararosanilina, útil en la detección histoquímica de la actividad FA, es menos eficaz en su demostración citoquímica^7,9. Por el contrario, la sal diazo estable conocida como Fast Garnet GBC, destaca por su facilidad de manejo y sus peculiaridades químicas, que permiten obtener como resultado final un precipitado rojo muy visible. Añadir más cantidad de Fast Garnet GBC, no sólo no mejora la tinción, sino que ayuda a la precipitación inespecífica durante la incubación. 
Las soluciones madre de los tampones permiten su conservación a 4°C durante meses y aseguran, al añadirlas en los volúmenes descritos, una capacidad tamponante suficiente para que la actividad FA se desarrolle eficazmente. Aunque está descrito que el pH óptimo de actuación1 de la FA oscila entre 4,7 y 5,5, los mejores resultados se han conseguido manteniendo el pH de incubación a 5,2 o a 5,0 (tartrato-sensibilidad). De esta manera, minimizamos la degradación de la sal diazo y la inhibición de la actividad enzimática debida al Fast Garnet GBC, descrita por algunos autores7. 
Aunque el tiempo de incubación podría reducirse bastante mediante incubación a 37°C, su desarrollo a temperatura ambiente (24-25°C) durante 2 horas, utilizando una agitación mágnetica, consigue minimizar la descomposición de la sal diazo, logrando con ello menor turbidez y, por tanto, un mínimo background. 
El procedimiento de lavado con agua corriente descrito es un paso fundamental cuya realización correcta asegura la eliminación de residuos y precipitados inespecíficos, que alteran y dificultan el análisis microscópico. Se consigue, asimismo, elimi nar el efecto conocido como "salting out", consistente en la aparición de precipitado abundante en células que sólo deben presentar débil positividad (neutrófilos). 
Dada la importancia del reconocimiento celular en la evaluación de la FA, utilizamos dos tipos de contrastante de tal forma que, los núcleos celulares pueden ser apreciados suficientemente bien junto al precipitado rojo específico. Las extensiones pueden ser montadas tanto en medios acuosos como orgánicos. 
Aunque el precipitado rojo obtenido es relativamente lábil y debe ser observado dentro de las 24 horas de realizada la tinción, las muestras montadas pueden ser conservadas semanas a -20°C. 
Durante la adaptación de la técnica descrita hemos podido observar, al igual que otros estudios^10,11, actividad de FA en precursores eritroides, cuya positividad es considerada por algunos autores^1,12 como expresión de patología. En este sentido, el estudio de la FA en 26 muestras de MO pertenecientes a donantes sanos puso de manifiesto una actividad de débil a moderada en aproximadamente el 21% de los eritroblastos (figura 4). De este modo, podemos concluir que la presencia de actividad FA en los eritroblastos no implica necesariamente un hallazgo patológico, al menos cuando se observa en la intensidad y cuantía descrita. 

Figura 4. Eritoblasto ortocromático en médula ósea de un individuo sano, mostrando positividad para fosfatasa ácida con patrón citoplasmático granular localizado (x 1000).

 

Creemos que los datos y especificaciones mostradas pueden ser de utilidad a aquellos grupos de trabajo que, como nosotros, encuentren, en un momento dado, dificultad en la obtención de resultados robustos en la citoquímica de la FA y que no deseen re currir a kits comerciales que, por otra parte, no siempre se adaptan con flexibilidad a las diferentes peculiaridades de los laboratorios de Hematología. 

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