ORIGINAL

Modificación de la técnica de determinación de 

mucopolisacáridos que utiliza azul de dimetilmetileno

E. Aranzadi, M.D. Miramar, E. Leiva, E. Relaño, J.F. Escanero

Servicio de Bioquímica Clínica. Hospital Universitario "Miguel Servet".

Departamento de Farmacología y Fisiología. Facultad de Medicina. Universidad de Zaragoza.

Palabras clave: Mucopolisacáridos o glicosaminoglicanos (GAG), cetilpiridinio (CPC), azul de dimetilmetileno (DMB), condroitín sulfato. 

Keywords: Mucopolisaccharides or glycosaminoglycans (GAG), cetylpiridinium (CPC), dimethyl-metilene blue (DMB), condroitine sulphate.

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Resumen

Una de las técnicas con colorantes catiónicos (azul de dimetilmetileno) utilizadas en los laboratorios clínicos para el screening de mucopolisacaridosis recomienda la precipitación de los GAG o mucopolisacáridos con CPC. En este trabajo se introdujo una modificación que consistió en eliminar la fase de precipitación, con objeto de evitar las posibles pérdidas de muestra que pudieran tener lugar con las sucesivas decantaciones en las orinas con valores elevados y en las de valores más bajos, aparte de la simplificación que representa para la técnica. Los resultados confirmaron la hipótesis, encontrándose diferencias significativas (p<0.01) en los valores de GAG en orinas de dos mucopolisacaridosis (valores más altos) y un adulto normal (valores más bajos). Para el rango de valores intermedios, ambas técnicas, precipitando y sin precipitar, proporcionan idénticos resultados. En conclusión, con la modificación propuesta se simplifica la técnica y se gana fiabilidad en la determinación de los valores extremos de GAG en orina.

Summary 

One of the cationic colouring (dimethyl-metilene blue) techniques used in Clinical Laboratories for the screening of mucopolisaccharidosis recommends the GAG or mucopolisaccharides precipitation with CPC In this paper was introduced a modification that consisted in eliminating the precipitation phase in order to avoid any posible loss of sample which could take place in the consecutive decantations of the urines; moreover, it leads to a simplification of the technique. The results confirmed the initial hypothesis; a significant diference (p<0.01) between the measured urinary GAG in two confirmed mucopolysccharidosis (the highest levels) and a normal adult (the lowest level) was found. Within the medium levels, both techniques (precipitation and no precipitation) have identical results. In conclusion, the suggested modification not only simplifies the technique but also it makes it more reliable in the extreme urinary GAG levels. 

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Recibido: 23-V-01 
Aceptado: 4-IX-01

Correspondencia: Estanislao Aranzadi Aburto 
C./ Coso, 55, 4º. 
50001-Zaragoza

Introducción

Las mucopolisacaridosis son enfermedades que resultan de la deficiencia de, al menos, 11 enzimas específicas implicadas en el catabolismo lisosomial de los mucopolisacaridos o glicosaminoglicanos (GAG): dermatán sulfato, heparán sulfato, condroitín sulfato y keratán sulfato. El diagnóstico clínico se realiza, en primer lugar, por el hallazgo de una elevada excreción de GAG en orina por cromatografía en capa fina¹ y se confirma por la determinación de la hidrolasa lisosomial correspondiente que se halla deficitaria o ausente. 

Para la determinación cuantitativa de los GAG en orina existen diferentes métodos: los más antiguos usaban técnicas turbidimétricas, basadas en la precipitación de los GAG con sales de amonio cuaternarias (cloruro de cetilpiridinio: CPC), o la separación de los mismos por electroforesis o HPLC y los más recientes utilizan colorantes catiónicos que producen metacromasia, como el azul de Alcian o el azul de dimetimetileno (DMB). En este trabajo se propone una modificación de la técnica de Panin et al.² en la que, previamente a la utilización del DMB, se recomienda la precipitación de los GAG^3,4,5 para minimizar o eliminar las interferencias que producen tanto las glicoproteínas como otros compuestos, tales como diferentes sales presentes en la orina. La modificación consiste en la realización de la técnica directamente, soslayando la precipitación, con objeto de evitar la posible pérdida de GAG de las muestras (orinas) cuando los valores son muy elevados o muy bajos.

Material y métodos

1. Material biológico.
Las muestras de orina utilizadas en este estudio fueron remitidas al Laboratorio de Bioquímica Clínica a partir de diferentes servicios del Hospital Universitario "Miguel Servet". Dichas muestras corresponden a cinco niños y un adulto normales y dos mucopolisacaridosis confirmadas: un Morquio de 10 años y un Sanfilippo tipo B de dos.

2. Métodos. 
A todas las muestras se les hizo un estudio comparativo procediendo a determinar los GAG precipitando con CPC y directamente sin precipitar. Posteriormente y con objeto de precisar las diferencias encontradas entre las dos metodologías se realizó la comparación en diferentes diluciones obtenidas a partir de la solución estándar.

3. Solución estándar. 
Como solución estándar se utilizó una mezcla de condroitín sulfatos A, B y C (Merck) a la concentración de 10 mg/100 ml.

4. Técnicas utilizadas.
Para la determinación de los GAG se utilizó la técnica de Panin et al.². La precipitación con CPC se llevó a cabo según el método descrito por Humbel y Chamoles¹, utilizado en la purificación y extracción de los GAG en el desarrollo de la cromatografía en capa fina para el diagnóstico de las mucopolisacaridosis, doblando las cantidades de muestra y reactivos, por ser la técnica de precipitación preconizada por diferentes autores^3,4,5 muy laboriosa y engorrosa. 

La creatinina fue determinada por la reacción de Jaffé modificada por Díez Antoñanzas⁶. 

5. Tratamiento estadístico de los datos. 
Los resultados obtenidos fueron tratados con el programa estadístico Sigma con un PC compatible.

Resultados y discusión 

Los resultados de GAG en las muestras biológicas (orinas) de los siete niños (cinco normales y dos mucopolisacaridosis) y del adulto se representan en la tabla 1. 

 

En dicha tabla se muestran las diferencias significativas, tanto en el adulto (valores de GAG más bajos) como en las dos mucopolisacaridosis, en las que fue preciso realizar varias diluciones de la orina para la obtención de resultados. 

Para la comprobación y precisión de los resultados anteriormente descritos se hicieron dos curvas una precipitando y la otra sin precipitar a partir de una serie de diluciones de la solución estándar. Los resultados obtenidos se representan en la figura 1. 

 

Las dos curvas que se muestran en la figura, son diferentes a las "patrón" que se realizaron para el cálculo de los valores normales (7), porque incluyen los puntos 0.1 y 0.2 mg/100 ml. En ellas se observa que son logarítmicas desde 0.1 mg/100 ml, al contrario de lo que afirman Panin et al. (2), quienes sostienen que son lineales hasta 3 mg/100 ml. Como casi todos los resultados en el screening de las mucopolisacaridosis se leen a nivel de 0.015 hasta 0.03 UA de DO, que corresponden de 0.1 hasta 0.25 mg/100 ml de concentración de GAG, siendo precisamente a estos niveles, en los que las diferencias de extinción óptica son más acusados y dadas las elevadas diluciones que hay que efectuar se minimizan en gran medida las posibles interferencias que pudieran existir por las mencionadas glicoproteinas y otros compuestos. Además, y como quiera que los puntos 0.1 y 0.2 mg/100 ml están demasiado juntos en la gráfica de DO y concentración hasta 10 mg/100 ml, se hizo una segunda hasta 0.5 mg/100 ml (ver el recuadro pequeño en la figura 1), en donde se observa que las curvas se cruzan y también mucho mejor las acusadas diferencias en las DO de los 2 puntos de 0.1 y 0.2 mg/100 ml de concentración. De esta manera se demuestra que cuanto mayor sea la dilución en la curva precipitada, tanto mayor será también la pérdida de muestra debida a las sucesivas decantaciones. Un hecho similar ocurre en la determinación de los GAG, en el screening de las mucopolisacaridosis. 

Los resultados de los puntos 0.1 y 0.2 mg/100 ml se representan en la tabla 2, en donde se indican las desviaciones estándar y comparación de medias que resultaron significativas para ambos puntos. 

 

Las conclusiones obtenidas son las siguientes: 

1º En las muestras cuyas diluciones son muy elevadas (1/30, 1/40 o superiores), como ocurre en las mucopolisacaridosis, y en las que su contenido en GAG es muy bajo (adultos), el efecto de las sucesivas decantaciones en la precipitación con CPC influye estadísticamente en el resultado. 

2º La técnica directa recomendada, comparativamente con otros procedimientos descritos, no ha proporcionado hasta la fecha falsos positivos ni negativos, siendo los valores de referencia de 24-261 mg/g de creatinina, para 75 casos⁷. 

 

Bibliografía 

1. Humbel R, Chamoles N A. Sequential thin layer chromatography of urinary acidic glycosaminoglycans. Clin Chim Acta 1972; 40: 290-293.          [ Links ]

2. Panin G, Naia S, Dall' Amico R, Chiandetti L, Zachello F, Catassi C, Felici L, Coppa V. Sample spectrophotometric quantification of urinary excretion of glycosaminoglycan sulfates. Clin Chem 1986; 32/11: 2073-2076.          [ Links ]

3. Di Ferrante N. The measurement of urinary excretion of mucopolisacharides. Anal Biochem 1967; 21: 98-106.          [ Links ]

4. Goldberg J M, Cotlier E. Specific isolation and analysis of mucopolisacharides (glycosaminoglycans) from human urine. Clin Chem Acta 1972; 41: 19-27.          [ Links ]

5. Pennock C A, White F, Murphy D, Charles R G, Kerr H. Excess glycosaminoglycan excretion in infancy and childhood. Pediat Scand 1973; 62: 481-491.          [ Links ]

6. Díez Antoñanzas J. Tesis doctoral. Facultad de Medicina de Zaragoza, 1972.          [ Links ]

7. Aranzadi E. Obtención de valores de normalidad con la técnica del azul de dimetilmetileno. Diag Biol 2000; 49: 18-22.         [ Links ]