ORIGINAL

PREMIO AEBM.- REFERENCE 2002

Prevalencia de mutaciones C282Y, H63D y S65C en un colectivo

laboral del País Vasco

R.A. Torremocha*, M.C. Salido*, C. Santiago*, L. Chicharro*, I. López-Abadía**, M.J. Martín***,

F. Bandrés*, F. Gómez-Gallego* 

*Laboratorio de Biopatología. Dpto. de Toxicología y Legislación Sanitaria. Facultad de Medicina.

Universidad Complutense de Madrid. **Dpto. de Especialidades médico-quirúrgicas. Facultad de Medicina.

Universidad del País Vasco. ***Mutua Vizcaya Industrial. 

Palabras clave: Hemocromatosis hereditaria; hierro; gen HFE; mutaciones

Keywords: Hereditary haemochromatosis; iron; HFE gene; mutations 

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Resumen

En el presente trabajo se analizan las frecuencias de las mutaciones C282Y, H63D y S65C del gen HFE asociadas a hemocromatosis hereditaria en un colectivo de 225 trabajadores que acuden a reconocimiento médico laboral en la provincia de Vizcaya. Para ello se extrajo DNA genómico de muestras de sangre y se analizaron por PCR las regiones de interés. Posteriormente las mutaciones fueron identificadas mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. Los resultados muestran una mayor prevalencia de la mutación H63D (11,56% en homocigosis y 48% en heterocigosis). Por su parte, las mutaciones C282Y y S65C solo se presentan en heterocigosis en un 4,45% y en 2,22% de los casos, respectivamente. Estos resultados revelan una prevalencia de la mutación H63D mayor en este colectivo que en otras poblaciones estudiadas, tanto de España como de Europa, mientras que las otras dos mutaciones presentan frecuencias similares a las calculadas en otras poblaciones. 


Summary 

The present study analyses the frequency of the HFE gene mutations associated to hereditary hemochromatosis C282Y, H63D y S65C, from a working population sample of 225 individuals originating from a Vizcaya County. DNA was extracted from blood samples and mutations were detected by PCR followed by enzymatic digestion. Results showed a higher prevalence for the H63D mutation (11,56% were homozygous and 48% were heterozygous). In the other hand, C282Y and S65C mutations only were present in heterozygosis in 4,45% and 2,22%, respectively. These results reveal a higher prevalence for the H63D mutation in this working sample than those reported for other Spanish and European populations. C282Y and S65C frequencies calculated are lower than H63D prevalence, and similar to those estimated for other populations. 

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Correspondencia: Dr. Félix Gómez Gallego
Dpto de Toxicología y Legislación Sanitaria
Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid
Ciudad Universitaria
28040 MADRID
Tel: 91 394 15 76. Fax: 91 394 16 06
e-mail: fgomezga@med.ucm.es

El presente trabajo ha sido parcialmente financiado por la Fundación Mapfre Medicina, a través de la Convocatoria de Becas de Investigación 2000/2001.

Introducción 

La Hemocromatosis Hereditaria (HH) es una enfermedad genética de transmisión autosómica recesiva caracterizada por una elevada absorción de hierro a nivel de las criptas intestinales como consecuencia de una alteración en su metabolismo, lo cual provoca un depósito progresivo en distintos órganos, dando lugar al desarrollo de diferentes patologías¹. 

La HH es el defecto congénito del metabolismo más frecuente y se considera una enfermedad potencialmente grave debido a las lesiones celulares que pueden producirse en diferentes órganos como el hígado, corazón, articulaciones, piel o páncreas y a que durante gran parte de la vida puede desarrollarse de forma asintomática^2-4. De esta forma, un diagnóstico precoz y un tratamiento temprano con flebotomías pueden impedir que la enfermedad desemboque en cirrosis, cardiopatías, diabetes mellitus y otras lesiones irreversibles^1,5. 

Aunque el término hemocromatosis se conoce desde hace más de cien años⁶, en 1935 se sugiere su naturaleza de enfermedad hereditaria⁷ y en 1976 se asocia la hemocromatosis con determinados alelos del locus HLA⁸ no fue hasta el año 1996 cuando se identificó un gen candidato para la hemocromatosis⁹. Este gen se denominó HFE y se localizó en el brazo corto del cromosoma 6, en el locus 6p21.3, muy cerca de la posición donde se sitúa el gen de HLA. Precisamente, el hecho de haber conseguido aislar este gen ha posibilitado el análisis de su secuencia identificándose varias mutaciones relacionadas con el desarrollo de la HH. Las principales son la sustitución de una cisteína por una tirosina en posición 282 de la proteína (C282Y), producida por una transición de una guanina por una adenina en posición 845 (845 G→A)⁹ y el cambio de una histidina por un aspártico en posición 63 (H63D), provocada por una sustitución de una citosina por una guanina en el nucleótido 187 (187 C→G)⁹. Recientemente se ha identificado una nueva mutación que también se ha relacionado con sobrecargas ligeras de hierro. Se trata de una sustitución de una serina por una cisteína en posición 65 (S65C), consecuencia de un cambio de adenina por timina en el nucleótido 193 (193 A→T)¹⁰. 

Desde un punto de vista funcional, el gen HFE expresa una proteína también denominada HFE que interviene en la homeostasis del hierro a través de su unión al receptor de transferrina, modulando la interacción entre la transferrina y su receptor¹¹. Atendiendo a las características estructurales (Figura 1), la mutación C282Y se localiza en el dominio α3 de la molécula y provoca la destrucción de un puente disulfuro, impidiendo la asociación con la β2-microglobulina y su expresión en la superficie celular^11,12. Las otras dos mutaciones, H63D y S65C se localizan en el dominio α1, ejerciendo su efecto sobre la función proteica por un mecanismo molecular diferente del de la mutación C282Y, ya que se ha demostrado que, al menos, la mutación H63D no altera la interacción con la β2-microglobulina ni la expresión de la proteína en la superficie celular¹³. 

 

Desde un punto de vista clínico, la técnica más habitual en la actualidad para detectar la HH consiste en la determinación del índice de saturación de transferrina (IST), el cual sitúa el umbral de sospecha por encima de valores del 45% ¹⁴. Sin embargo, se han descrito casos de falsos positivos¹⁴ (en situaciones de otras enfermedades) y de falsos negativos⁵ (en jóvenes y mujeres), que unidos a la alta prevalencia de las mutaciones asociadas a HH, donde se ha calculado que en población caucasoide aproximadamente un 10% es heterocigoto para alguna mutación y un 0,7% es homocigoto¹⁵ hacen considerar la posibilidad del cribado genético en determinadas situaciones. 

El objetivo del presente estudio, por tanto, es el de establecer las prevalencias de las mutaciones C282Y, H63D y S65C en una muestra de población laboral de la provincia de Vizcaya (País Vasco) con el fin de obtener datos epidemiológicos que puedan permitir relacionar la presencia de estas mutaciones con la incidencia de la HH en esta población, habida cuenta de las características con que se desarrolla en muchos casos. 


Material y métodos 

Pacientes: se analizaron las mutaciones C282Y, H63D y S65C del gen HFE en un colectivo de 225 individuos de la provincia de Vizcaya (País Vasco), varones anónimos que acuden a reconocimiento médico laboral durante el primer semestre de 2001 con edades comprendidas entre 21 y 61 años. 

Análisis genético: para la detección de las mutaciones se extrajo el DNA genómico de sangre periférica anticoagulada con EDTA con el método clásico del fenol/cloroformo y posterior precipitación alcohólica. Posteriormente, se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) las zonas a estudiar con cebadores específicos¹⁶ que delimitan los codones donde se localizan las mutaciones. Las condiciones de PCR fueron las siguientes para ambas mutaciones: desnaturalización inicial 95 ºC 5 min; 35 ciclos de 95 ºC 1 min, 55 ºC 45 seg, 72 ºC 1 min; extensión final 72 ºC 5 min. Posteriormente, los productos de PCR obtenidos se sometieron a una digestión enzimática durante 2 horas con endonucleasas de restricción que cortan el DNA en sitios concretos y permiten determinar la presencia o ausencia de las mutaciones. Las enzimas de restricción utilizadas fueron: SnaB I para la detección de la mutación 845 G→A (C282Y), Bcl I para la detección de la mutación 187 C→G (H63D) y Hinf I para la mutación 193 A→T (S65C) (Tabla I). Los resultados del proceso de digestión se visualizaron en geles de agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio. 

 

Resultados y discusión 

Se han identificado las mutaciones C282Y, H63D y S65C en un total de 225 muestras de sangre pertenecientes a un colectivo laboral de la provincia de Vizcaya. En el análisis de la mutación C282Y, tras la digestión con SnaB I se detecta un único fragmento de 400 pb en los individuos sanos mientras que en los heterocigotos se visualizan tres fragmentos de 400, 290 y 110 pb respectivamente. En la mutación H63D, tras la digestión con Bcl I es posible visualizar un fragmento de 160 pb en individuos sanos, 2 fragmentos de 220 y 160 pb en heterocigotos y un solo fragmento de 220 pb en individuos homocigotos. Por lo que respecta a la mutación S65C, tras la digestión con Hinf I se observa un fragmento de 165 pb en individuos sanos y dos fragmentos de 220 pb y 165 pb en heterocigotos (Figura 2). 

 

Los resultados obtenidos a partir del análisis genético de las mutaciones C282Y, H63D y S65C aparecen reflejados en la Tabla II. Por lo que respecta a la mutación C282Y, 10 de los 225 individuos analizados resultaron ser heterocigotos, mientras que el resto presentaron un genotipo normal. No se identificaron individuos homocigotos para esta mutación. Estos resultados proporcionan una frecuencia del alelo mutado de 2,3% en este colectivo estudiado (Tabla III). La determinación de la mutación H63D reveló la presencia de 26 individuos homocigotos, 108 heterocigotos y 91 sanos, proporcionando una frecuencia del alelo mutado de 35,5% (Tabla III). El análisis de la mutación S65C mostró la existencia de 5 individuos heterocigotos, siendo el resto normales para esta mutación. La frecuencia calculada para el alelo mutado fue de 1,2% (Tabla III). Adicionalmente, también se detectaron 5 individuos dobles heterocigotos para las mutaciones C282Y/H63D, 1 doble H63D/S65C y 1 C282Y/S65C. 

 

La prevalencia de la mutación C282Y ha sido estudiada profusamente en diferentes poblaciones europeas. Algunos estudios han postulado el origen celta de esta mutación reflejando un gradiente descendiente de incidencia de norte a sur^17-19. Destaca su mayor frecuencia en poblaciones del norte de Europa: Finlandia (5,2%)²⁰, Gran Bretaña (5,9 - 8,5%)²⁰, Islandia (6,7%)²¹, Noruega (6,4%)²¹ o Irlanda (10%)²¹. Por el contrario, la menor prevalencia se encuentra en el área mediterránea, con frecuencias del 1,4% en Grecia²¹, el 1% en Italia²² y del 0% en Turquía²¹. Por lo que respecta a la población española, la prevalencia de esta mutación se sitúa en valores comprendidos entre el 4,4% en Cantabria²³ y el 2% en la región central²⁴. Otros estudios han estimado una frecuencia para la mutación C282Y del 3% y del 3,6% en población catalana y vasca, respectivamente, aunque con un número de individuos analizados tan reducido que pueda haber dado lugar a una sobreestimación de esta prevalencia²¹. Recientemente, otro trabajo realizado con población del País Vasco sitúa esta prevalencia en un 5,2%²⁵. 

Los resultados obtenidos en este colectivo de población laboral con una prevalencia de la mutación C282Y del 2,3% están dentro de los valores estimados para otros colectivos de España. Adicionalmente, parece que la penetrancia de esta mutación en la población del País Vasco no es muy elevada, habida cuenta de los estudios realizados en pacientes con sobrecarga de hierro, donde su incidencia es de sólo el 57% en homocigosis y del 11% en heterocigosis, asociada a la mutación H63D²⁵. Esta situación está en desacuerdo con lo que ocurre en otros escenarios, donde la mayor parte de los casos de sobrecarga están directamente relacionados con la presencia de la mutación C282Y^{9, 26, 27}. 

La mutación H63D presenta una prevalencia mayor que la mutación C282Y en todas las poblaciones estudiadas. Su relación con la HH no está perfectamente definida, aunque se ha sugerido que puede alterar los mecanismos de regulación involucrados en el transporte de hierro modificando la interacción entre la proteína y los ligandos¹² y se ha observado una mayor incidencia en pacientes afectados de HH que no presentan la mutación C282Y o que la presentan en heterocigosis^9,16. En esta mutación no se observa una variación en las frecuencias de norte a sur, como ocurría con la mutación C282Y, de forma que el área mediterránea presenta prevalencias del mismo orden que poblaciones más septentrionales. Las frecuencias estimadas oscilan entre el 29,5% de Holanda²¹ y el 6,7% de algunas regiones de Rusia²¹. Respecto a otros estudios realizados con poblaciones españolas, en un colectivo de 50 individuos en Cataluña y de 28 en el País Vasco se calculó una prevalencia del 24 y del 30,5%, respectivamente²¹. Estos datos se confirmaron posteriormente en otro estudio realizado con 115 individuos del País Vasco²⁵ y con 422 de Cataluña²⁷. Las prevalencias obtenidas en el colectivo laboral de la provincia de Vizcaya (35%) representan el valor más elevado obtenido en población española y europea, confirmando los estudios arriba mencionados y reflejando la alta incidencia que tiene esta mutación en el País Vasco. 

Por lo que respecta a la mutación S65C, su significado fisiológico sobre la sobrecarga ligera de hierro aún es controvertido. Existen diferentes estudios con resultados contradictorios que indican tanto la relación de la presencia de esta mutación en pacientes afectados de HH que no presentan las mutaciones C282Y ni H63D¹⁰ como los que afirman que no existe una asociación directa entre la presencia de la mutación S65C y una predisposición genética en el acúmulo excesivo de hierro²⁸. En este sentido, su estudio parece indicado en aquellos casos de sobrecarga de hierro en los que está presente alguna otra mutación en heterocigosis²⁹, aunque quizá la estructura tridimensional resuelta de la proteína HFE pueda aportar información adicional acerca del papel de esta sustitución en la función biológica¹¹. En el presente colectivo laboral estudiado, la prevalencia de esta mutación (1,2%) fue superior a la estimada en otras poblaciones (0,36% en el noreste de España y 0,6% en Alabama)^29,30; e inferior a otros estudios realizados con población del País Vasco (3,0%)²⁵ y del estado de Utah (5,5%)¹⁰. 

Los resultados obtenidos muestran que la prevalencia de las mutaciones asociadas a HH es muy alta en el colectivo laboral del País Vasco, especialmente la mutación H63D, en la que se ha detectado un 11,56% de individuos homocigotos y un 48% de heterocigotos. Desde un punto de vista clínico, es necesario recordar que la HH hay que definirla en términos de fenotipo, no de genotipo y aunque la identificación de alguna de las mutaciones es insuficiente para el diagnóstico³¹ hay que tener en cuenta que la presencia de alguna mutación en homocigosis confiere una susceptibilidad genética para desarrollar HH. 

A pesar de que algunos trabajos no consideran necesario la utilización del cribado genético en población general^32-35, en algunos casos se contempla la posibilidad de incluirlos en áreas donde la penetrancia es elevada³¹, habida cuenta de la posibilidad de identificar precozmente individuos asintomáticos en la población³⁶. En nuestro estudio, teóricamente, si extrapoláramos los resultados a la totalidad de la población de Vizcaya, sería previsible detectar 128000 individuos homocigotos para la mutación H63D y 35000 dobles heterocigotos. También es de destacar que, aunque los individuos heterocigotos son únicamente portadores de la enfermedad, dado el carácter recesivo, es importante considerar esta circunstancia, habida cuenta de la observación del riesgo aumentado que poseen los heterocigotos de padecer enfermedad cardiovascular^37,38. Adicionalmente, también se ha indicado la relación de la mutación H63D con el riesgo desarrollar hepatopatía alcohólica avanzada³⁹. 

En conclusión, aunque el principal medio de diagnóstico de la HH es la evaluación bioquímica de alteraciones en algún parámetro asociado al metabolismo del hierro (principalmente el IST) es necesario considerar las ventajas que desde un punto de vista de vigilancia de la salud puede representar la realización de la detección genética de las mutaciones, sobre todo en las fases tempranas de la enfermedad cuando ésta cursa de forma asintomática. Además de la utilidad meramente clínica, la realización de este análisis genético permitiría la identificación de familiares potencialmente afectos de alguna mutación y de individuos homocigotos sin síntomas en población general. De igual forma, unos valores bioquímicos alterados en pacientes sin estas mutaciones genéticas supone un gran estímulo en la búsqueda e identificación de nuevas mutaciones en el gen HFE o en otros involucrados en los fenómenos de absorción de hierro. 

 

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