ARTÍCULO ORIGINAL

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EXPRESIÓN DE COLAGENASA-3 (MMP-13) EN 
CARCINOMAS EPITELIALES DE LOS PÁRPADOS

COLLAGENASE-3 (MMP-13) EXPRESSION IN EPITHELIAL CANCERS OF THE EYELIDS

ÁLVAREZ SUÁREZ ML¹, GONZÁLEZ VÁZQUEZ LO², BARBÓN GARCÍA JJ³, VÁZQUEZ ROJO J⁴, 
LAMELAS SUÁREZ-POLA ML⁴, VIZOSO PIÑEIRO FJ⁴

 

 

 

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Recibido: 4/12/02. Aceptado: 11/6/04.
Hospital de Jove. Gijón. Asturias.
1 Doctor en Medicina. Hospital Álvarez-Buylla. Mieres. Asturias.
2 Licenciado en Medicina.
3 Licenciado en Medicina. Hospital San Agustín. Avilés. Asturias.
4 Doctor en Medicina.

Correspondencia:
María Luisa Álvarez Suárez
C/. Juan Ochoa, n.º 1 7-D
33400 Avilés (Asturias)
España

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INTRODUCCIÓN

En los últimos tiempos se ha prestado un especial interés a los enzimas proteolíticos por su posible implicación en el proceso de transformación maligna debido a su importancia en la degradación de la matriz extracelular, facilitando la invasión tumoral y las metástasis (1). Se han descrito diferentes familias de estos enzimas proteolíticos, una de ellas la constituyen las metaloproteasas de matriz extracelular (MMPs) de las que se conocen al menos 20 proteasas que pueden ser clasificadas, en base a criterios estructurales y funcionales, en 4 grupos con diferente especificidad de sustrato: colagenasas, gelatinasas, estromalisinas y metaloproteasas de membrana.

La colagenasa-3 es un nuevo enzima proteolítico que pertenece junto a la colagenasa humana fibroblástica (MMP-1) y la neutrofílica (MMP-8), a una superfamilia de proteasas de la matriz extracelular que se caracterizan por su capacidad para fragmentar la triple hélice del colágeno en un único sitio. Sin embargo, presenta diferencias en la especificidad de sustrato, ya que mientras MMP-1 y MMP-8 fragmentan respectivamente los colágenos III y V, el colágeno tipo II parece ser el sustrato más específico de la colagenasa-3 (2,3). Pero además de esta acción degradativa sobre las fibrillas de colágeno, la colagenasa-3 presenta capacidad degradativa sobre otros elementos de la matriz extracelular como las gelatinas (2), proteoglicanos (4), colágenos tipo IV, X y XIV, fibronectina y tenascina (5). Esta amplia variedad de elementos de la matriz extracelular susceptibles de ser degradados por la colagenasa-3, unido a la expresión del gen de esta proteasa por algunos carcinomas, ha sugerido que este enzima podría desempeñar un papel relevante en la progresión de los tumores malignos (6,7).

MATERIAL Y MÉTODO

Material

Se investigó la expresión de colagenasa-3 en 23 casos de carcinoma basocelular de los párpados intervenidos en distintos centros de Asturias entre 1996 y 2001. La edad media de los pacientes fue de 66,2 años (intervalo: 36-90 años) y todos ellos fueron tratados mediante resección aislada o asociada a un colgajo o injerto en caso necesario. El seguimiento medio de los pacientes fue de dos años.

También se estudiaron 25 casos de carcinoma espinocelular de los párpados intervenidos en diferentes hospitales en los últimos cinco años. La edad media de los pacientes fue de 79,3 años (intervalo: 45-102 años) y la técnica quirúrgica utilizada fue similar a la del grupo anterior. El seguimiento medio fue igualmente de unos dos años.

Purificación de la proteína y obtención de anticuerpos

La colagenasa-3 se obtuvo a partir de bacterias recombinantes tal como describe Freije et al. (6) (1994) y los anticuerpos monoclonales contra la proteína fueron obtenidos por Fuji-Chemical Ltd (Japan).

Material histológico

Todos los tejidos fueron fijados durante 16 horas en formaldehído al 10%, tamponado con fosfato 0,1 M, pH 7,4. Posteriormente, las muestras tisulares fueron deshidratadas mediante pases sucesivos por etanol a concentraciones crecientes hasta el 99,5% y, finalmente, se aclararon en xilol y se incluyeron en parafina.

Preparación de las muestras y tinción inmunohistoquímica

La tinción inmunohistoquímica se realizó sobre cortes de 5 micras de los bloques de parafina siguiendo el método del polímero conjugado mediante el sistema Envision TM (Dako, Carpinteria, Calif., USA). Para ello, las muestras tisulares fueron previamente desparafinadas en estufa a 60ºC durante 30 minutos y, tras dos pases de 15 minutos en xilol, se hidrataron por pases sucesivos en metanol a concentración decreciente y agua desionizada.

La tinción inmunohistoquímica se realizó en los siguientes pasos:

1. Inclusión de las muestras tisulares hidratadas en tampón fosfato 20 mmol/pH 7,2.
2. Incubación con anticuerpo primario monoclonal (dilución 1:200) en tampón fosfato pH 7,2, durante 40 minutos a temperatura ambiente.
3. Lavado en tampón fosfato.
4. Incubación con el polímero enzima conjugado durante 30 minutos a temperatura ambiente.
5. Lavado con tampón fosfato.

La presencia del enzima fue revelada con diaminobenzidina (DAB) líquida incluída en el mismo kit comercial del sistema de detección (Dako, Carpintería Ca, U.S.A). El revelado fue de 5 minutos siendo detenido el proceso de tinción mediante lavado con tampón fosfato pH 7,2.

Las preparaciones se contrastaron con hematoxilina de Mayer durante 30 segundos, haciéndose virar ésta con agua corriente. Finalmente, las preparaciones fueron deshidratadas en metanol a concentración creciente y xilol para su posterior montaje en medio permanente (Entellan, MercK, Darmstadt, Alemania).

Para el análisis de la tinción inmunohistoquímica, las preparaciones histológicas fueron evaluadas por dos patológos con una reproductividad del 90%.

Análisis estadístico

El análisis de la posible relación entre la tinción inmunohistoquímica para la colagenasa-3 en los tumores y los factores clínico-patológicos fue examinada por el test de chi-cuadrado, con corrección de Yates cuando fue necesario. El nivel de significación estadística establecido fue del 95% (p<0,05). El análisis se realizó con el paquete estadístico SPSS (versión 9.0).

RESULTADOS

La tabla I recoge las características clínico-patológicas de los 23 casos de carcinomas basocelulares de párpado con respecto a la edad y sexo de los pacientes, localización, tipo histológico; y también de aspectos relacionados con su tratamiento tales como el estado del margen quirúrgico o la necesidad de tratamiento coadyuvante. Sólo uno de los pacientes recibió tratamiento tras la resección del tumor debido a la importante afectación del borde quirúrgico y que consistió en una nueva exéresis. Durante el período de seguimiento clínico de los pacientes (media: 25,6 meses; intervalo: 12-38 meses) no se detectó ningún caso de recidiva tumoral.

Las características clinicopatológicas de los 25 casos de carcinoma espinocelular de los párpados se recogen en la tabla II. En 4 casos fue precisa una segunda intervención para eliminar los márgenes tumorales afectados. Durante el período de seguimiento clínico de los pacientes sólo se registró una recidiva de la enfermedad (seguimiento medio: 20,16 meses; intervalo: 4-53 meses).

En lo que se refiere a la expresión de colagenasa-3 (figs. 1 a 4), hemos encontrado una tinción inmunohistoquímica positiva para esta proteína en 15 (65%) de los 23 carcinomas basocelulares de párpado que se localizó en el citoplasma de las células tumorales. Ocasionalmente, también puede observarse una tinción positiva para la colagenasa-3 en el citoplasma de los fibroblastos peritumorales. Las características de la expresión de colagenasa-3 en relación a las variables estudiadas se recogen en la tabla III. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en relación con la edad y sexo de los pacientes, localización y tipo histológico del tumor, ni con la afectación del margen quirúrgico tras la resección.

Fig. 1. Carcinoma basocelular con tinción inmunohistoquímica 
positiva para colagenasa-3 (400x).

Fig. 2. Carcinoma basocelular con tinción inmunohistoquímica 
negativa para colagenasa-3 (400x).

Fig. 3. Carcinoma espinocelular con tinción inmunohistoquímica 
positiva para colagenasa-3 (400x).

Fig. 4. Carcinoma espinocelular con tinción inmunohistoquímica 
negativa para colagenasa-3 (400x).

Los carcinomas epidermoides palpebrales expresan la colagenasa-3 en mayor porcentaje, ya que 22 (88%) de los 25 tumores estudiados fueron positivos para esta proteína. La tinción inmunohistoquímica se localiza, igualmente, en el citoplasma de la célula tumoral y, ocasionalmente, en los fibroblastos peritumorales pero además hemos detectado una mayor expresión de colagenasa-3 en la frontera de la invasión tumoral en este tipo de tumores. La tabla 4 muestra la expresión de colagenasa-3 en relación con las características de los pacientes y sus tumores. El análisis estadístico no reveló una relación significativa entre las características de los pacientes y de sus tumores, y la expresión de colagenasa-3.

  

DISCUSIÓN

La colagenasa-3, además de ser expresada en procesos fisiopatológicos tales como la osificación fetal (8), procesos reproductivos asociados a la ovulación o involución uterina tras el parto (9,10), úlceras venosas crónicas (11), procesos inflamatorios (12) o reparación de heridas (13) entre otros, también ha sido identificada en distintos tipos de carcinomas como carcinomas mamarios (6), condrosarcomas (14), carcinomas escamosos de cabeza y cuello (15), carcinomas escamosos de vulva (16), carcinoma esofágico (17), carcinomas de vejiga urinaria (18) y carcinomas cutáneos escamosos y de células basales (19,20). También ha sido descrita su expresión por los melanomas cutáneos malignos (21).

El hecho de que la colagenasa-3 no se exprese en la dermis normal ni en lesiones cutáneas benignas parece indicar que su expresión por los carcinomas cutáneos es consecuencia de los procesos asociados con la transformación maligna celular. De hecho, nuestros resultados confirman los datos publicados sobre la expresión de colagenasa-3 por los carcinomas basocelulares, aunque observamos discrepancias en cuanto a la localización de la expresión del enzima (19,20). Así, nosotros detectamos la tinción inmunohistoquímica para la colagenasa-3 en la mayoría de las células cancerosas y sólo ocasionalmente en los fibroblastos peritumorales, mientras que Airola y cols. detectan la expresión de mRNA de la proteasa solamente en áreas focales con diferenciación escamosa (19). Más recientemente, y con técnicas de hibridación «in situ», Varani y cols. han detectado la expresión de colagenasa-3 por el epitelio normal adyacente al tumor, pero raramente en el tumor mismo o en el estroma peritumoral (20).

Nuestros resultados, en relación con la expresión de colagenasa-3 por los carcinomas escamosos, muestran un único patrón de expresión casi restringido a las células malignas, al igual que los de Airola y cols. (19); aunque ocasionalmente se detectó también tinción en los fibroblastos peritumorales. Así mismo, y al igual que dichos autores, encontramos una mayor expresión de colagenasa-3 en la frontera de la invasión tumoral. De acuerdo con esta observación, se ha detectado la co-localización de la expresión de colagenasa-3 y laminina-5, un componente de la membrana basal que promueve la movilidad del queratinocito, y que se ha sugerido, ayuda en la invasión de las células tumorales mediante el establecimiento de adhesiones focales a la matriz (19,22). La co-localización de la colagenasa-3 y la laminina-5 en la frontera de la invasión tumoral de los carcinomas escamosos de piel, apoya la hipótesis de que la colagenasa-3 está asociada a la invasión tumoral. Hemos observado un mayor porcentaje de carcinomas escamosos de párpado colagenasa-3 positivos (88%) en comparación al porcentaje de carcinomas basocelulares positivos para esta proteasa (65%), lo que podría deberse, de igual manera, al diferente comportamiento biológico de ambos tipos de tumores. Ambos son proliferaciones malignas originadas a partir de células epidérmicas (queratinocitos) inmaduras, pero que difieren significativamente en cuanto a su agresividad, ya que los carcinomas basocelulares muy raramente metastatizan mientras que los escamosos muestran, en cambio, cierto potencial metastásico. Se han descrito ciertos aspectos de la biología molecular de estos dos tipos de tumores que pueden justificar tales diferencias, y así, se ha demostrado que los carcinomas escamosos muestran, en comparación con los basocelulares, un aumento en la expresión de la integrina a6/CD49f, que facilita la adhesión de las células tumorales a la laminina de la membrana basal vascular, una disminución en la expresión de los colágenos IV y VII, y un incremento de la expresión de MMP-2 y MMP-9 lo cual parece explicar el mayor potencial metastásico de este tipo de carcinomas (23).

El origen celular de la producción de colagenasa-3 en el contexto tumoral sigue estando sometido a cierta controversia. Existen estudios que indican que la proteasa es predominantemente producida por las propias células malignas de algunos carcinomas como los de mama (24), escamosos de piel (19), vulva (16), cabeza y cuello (15), melanoma (21) y urotelio (18). Sin embargo, existen otros datos que demuestran la producción de colagenasa-3 en el compartimento estromal del cáncer de mama (7) y más recientemente por los miofibroblastos en el foco estromal del componente invasivo de los carcinomas «in situ» de mama (25). Todas estas diferencias pueden depender de los diferentes métodos de determinación, de los anticuerpos utilizados, o por diferencias en el origen celular de la producción de colagenasa-3 en función de los distintos tumores. De cualquier forma, parece evidente que la inducción de la producción de esta proteasa está ocasionada por una combinación de factores localizados en el microambiente de la frontera de la invasión tumoral y, como consecuencia de las interacciones entre las células cancerosas y el estroma circundante.

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