Recibido: 10/2/05. Aceptado: 20/9/05.
Hospital Cruz Roja y Hospital Ramón y Cajal. Madrid. España.
1 Doctor en Medicina.
2 Doctor en Biología.
3 Licenciado en Medicina.

Correspondencia:
J.S. López García
Servicio de Oftalmología
Hospital Central de Cruz Roja
Avda. Reina Victoria, 26
28003 Madrid
España
E-mail: docsantilopez@hotmail.com

INTRODUCCIÓN

La aniridia es una anomalía congénita en el desarrollo del ojo que presenta una escasa incidencia en la población (1:65.000-95.000). Generalmente se trasmite mediante una herencia autonómica dominante, aunque puede también presentarse de forma esporádica. Está provocada por una alteración en el gen PAX 6 localizado en el brazo corto del cromosoma 11 (1,2). Se caracteriza por una pérdida parcial o completa del iris y otras anomalías como nistagmus, cataratas, glaucoma, queratopatía, hipoplasia foveal, hipoplasia macular, etc. (3). En algunos casos, sobre todo en los que se presentan de forma esporádica, asocia anomalías extraoculares como el tumor de Wilms ya sea sólo o formando parte del llamado síndrome WAGR (Tumor de Wilms, aniridia, anomalías genito-urinarias y retraso mental) (4).

La queratopatía en la aniridia congénita afecta a un 15-20% de los pacientes. Es producida por una disfunción metabólica que disminuye el número de células madre limbocorneales provocando una insuficiencia del limbo para mantener un epitelio fenotípicamente corneal. Como consecuencia de este déficit limbal se produce una conjuntivalización y vascularización de la córnea con la consiguiente pérdida de visión (5). Estos cambios en el epitelio de la superficie ocular pueden ser la causa de la frecuente sequedad ocular que presentan estos pacientes (6).

El tratamiento de la queratopatía asociada a la aniridia dependerá del grado de insuficiencia limbal. La insuficiencia límbica puede ser total o parcial dependiendo del número de células madre afectadas. Clínicamente se caracteriza por una vascularización del epitelio corneal, inflamación crónica, defectos epiteliales persistentes y recurrentes, fotofobia, opacidad estromal y pérdida de visión. En la actualidad el trasplante de limbo sigue siendo la técnica quirúrgica más extendida para el tratamiento de pacientes con deficiencia limbal total (7), si bien las nuevas técnicas de trasplante de células madre limbales cultivadas sobre membrana amniótica (MA) se están desarrollando con gran rapidez (8-10). En algunos casos el trasplante de limbo se asocia a queratoplastia lamelar o penetrante (11,12).

El trasplante de membrana amniótica (TMA) es también utilizado para el tratamiento de la insuficiencia limbal, sobre todo en casos de defectos limbares parciales (13,14). La MA se empleó por primera vez en oftalmología en 1940 para la reparación de defectos conjuntivales (15), aunque es a partir de la década de los 90 cuando el TMA se desarrolla considerablemente (16,17). En el presente trabajo se pretende estudiar, mediante citología de impresión y biopsia limbal, el patrón morfológico de recuperación tanto de las células del epitelio corneal como del estroma en ojos de pacientes con aniridia después del tratamiento con TMA.

SUJETOS, MATERIAL Y MÉTODOS

En la selección de pacientes, técnicas aplicadas y manejo de las muestras se cumplieron las normas internacionales y nacionales para estudios clínicos. A todos los pacientes que, de forma voluntaria, quisieron intervenir en este estudio se les solicitó por escrito la aceptación de su participación.

Se ha realizado un estudio prospectivo sobre 14 ojos con aniridia congénita y clínica de insuficiencia limbal parcial que fueron tratados con TMA. El seguimiento post-quirúrgico fue de 24 meses. La edad media en el momento de la operación fue de 37 años (comprendidos entre los 21 y 57 años). Todos los pacientes presentaron clínica de insuficiencia limbal moderada caracterizada por fotofobia, disminución de visión, inflamación crónica de la superficie ocular, lagrimeo, 3 o más episodios de erosiones recidivantes o úlceras recurrentes en los últimos 6 meses y en la exploración con lámpara de hendidura se observaba una inestabilidad permanente de la película lagrimal y un pannus vascular periférico.

El TMA se realizó previa descongelación y lavado en tampón PBS de las piezas de MA. Éstas fueron separadas del papel de nitrocelulosa y colocadas sobre la superficie ocular con el epitelio hacia arriba y el mesénquima en contacto con el ojo cubriendo córnea, limbo y conjuntiva proximal. Se tensó la MA, eliminando el exceso de ésta, y se suturó con nylon 10/0 (fig. 1). La cirugía se realizó bajo anestesia retrobulbar o peribulbar. Una vez finalizada la intervención quirúrgica se colocó una lente terapéutica, manteniéndola durante tres o cuatro semanas. El tratamiento post-quirúrgico consistió en un tratamiento tópico con ofloxacino 0,3% y con dexametasona 0,1% cuatro veces diarias.

Fig. 1. Colocación del TMA. La MA se despliega con el epitelio hacia arriba 
y el mesénquima en contacto con la superficie ocular. Posteriormente se recorta 
el exceso de MA y se sutura a conjuntiva con nylon de 10/0.

El seguimiento clínico se hizo al día siguiente del transplante, a la semana, al mes, a los 3, a los 6, a los 12, a los 18, y a los 24. La evaluación de la superficie corneal después de la cirugía se efectuó mediante citología de impresión del epitelio corneal y mediante biopsia limbal. La citología se realizó previa a la intervención y a los 3, 6, 9, 12 y 24 meses después de la intervención. La biopsia se realizó en el momento de colocar el TMA y a los 9 meses de éste. Las muestras se procesaron tanto para estudio mediante microscopía óptica como electrónica.

Para la citología de impresión, las muestras obtenidas de los cuatro cuadrantes fueron recogidas sobre tiras de papel millipore HAWP304 de 5x5 mm de tamaño, fijadas en etanol al 96% y teñidas con PAS-hematoxilina de acuerdo con el protocolo de Locquin y Langeron modificado por Rivas et al. (18), observándose posteriormente al microscopio óptico. El criterio utilizado para el diagnóstico en la citología corneal se basó en la forma y tamaño de las células, la separación entre ellas, su tamaño nuclear, la tinción del citoplasma, las alteraciones nucleares, la relación núcleo-citoplasma y la presencia de conjuntivalización corneal. Para valorar el grado de afectación, las células corneales fueron graduadas en una escala que iba de 0 a 5 grados, según la clasificación de la metaplasia escamosa propuesta por Murube y Rivas (2003) (19). Estos autores distinguen cinco grados de alteración celular y un grado 0 que recoge las características normales de las células.

La biopsia se realizó previa anestesia tópica de la superficie ocular con anestésico doble (Colircusí anestésico doble^®, Alcon Cusí, S.A. Barcelona) instilada en el fondo de saco conjuntival. El tamaño de la muestra limbal fue aproximadamente de 2 mm², y el procesamiento de ésta siguió el protocolo habitual del laboratorio de Anatomía Patológica del Hospital Ramón y Cajal, excepto en la fijación, en la que para poder estabilizar la capa de mucina de la película lagrimal ésta se realizó en glutaraldehido al 1,5% con bromuro de hexadeciltrimetilamonio (HTAB) en tampón fosfato; posteriormente se realizó una segunda fijación en glutaraldehido al 1% con ácido tánico al 1% en el mismo tampón y, por último, una tercera fijación en tetraóxido de osmio al 1% en tampón Palade. Las muestras se deshidrataron en concentraciones crecientes de acetona (30, 50, 70, 90 y 100%) y óxido de propileno. El medio de contraste consistió en una solución de acetato de uranilo al 2% añadido a la acetona al 70%, proporcionando un mayor contraste a las membranas del tejido. La inclusión se realizó en Araldita (Durcupan-Ciba). El seccionamiento de las muestras se realizó en un ultramicrotomo modelo Reichert-Jung, Ultracut E. Los cortes histológicos para el estudio en microscopio óptico se obtuvieron de un grosor aproximado de 2 micras y se tiñeron con azul de Richardson. Para el estudio mediante microscopio electrónico, los cortes se obtuvieron de un grosor de 70 nanómetros y se tiñeron con citrato de plomo.

RESULTADOS

La citología corneal realizada previa al tratamiento mostró únicamente en algún caso signos de conjuntivalización, caracterizada por la presencia de un escaso número de células caliciformes de pequeño tamaño y vacías de contenido mucínico. Las células epiteliales presentaron una metaplasia escamosa grado 3 ó 4. Su tamaño celular fue superior a las 900 µm2 y el tamaño nuclear de unas 90 µm². Las alteraciones nucleares más comunes fueron la aparición de núcleos picnóticos y binucleados. La relación núcleo-citoplasma estuvo bastante alterada siendo muy común una tinción metacromática, y en menos casos basófila, del citoplasma. La presencia de células inflamatorias fue escasa (fig. 2). La biopsia limbal mostró células de gran tamaño en todas las capas con gran citoplasma, estando bastante separadas entre ellas. Las microvellosidades fueron muy pequeñas y la capa de mucina estuvo algo adelgazada y en algunas localizaciones discontinua. La membrana basal presentó un aspecto algo adelgazado con respecto a personas normales. El estroma fue moderadamente denso con presencia de algunas células inflamatorias. Los vasos sanguíneos presentaron generalmente un calibre algo reducido (fig. 3).

Fig. 2. Citología de impresión en la córnea de un paciente con aniridia antes del TMA. 
Las células epiteliales con muy grandes, con citoplasmas metacromático y numerosas alteraciones nucleares.
Se observa una célula caliciforme muy alterada. Tinción PAS-hematoxilina. Aumento original x40.

Fig. 3. Biopsia realizada previa a la cirugía de TMA. Se aprecia una delgada capa de mucina, 
así como algunas células caliciformes en el epitelio limbocorneal. 
El tejido conectivo del estroma es moderadamente denso. 
Tinción azul de Richardson. Aumento original x40.

Desde el punto de vista clínico, la epitelización de la córnea se completó antes de los dos meses en casi todos los pacientes; sin embargo, a partir del 8.º-9.º mes, algunos pacientes comenzaron a presentar defectos epiteliales y úlceras recurrentes. La neovascularización corneal periférica mejoró antes de los dos meses, así como la transparencia corneal lo que contribuyó a la mejora de 0,3 en la agudeza visual.

En la citología de impresión realizada a los tres meses del TMA no se encontraron en ningún caso signos de conjuntivalización del epitelio corneal. Se apreció una notable mejoría de las células epiteliales en cuanto al grado de metaplasia. No observamos células epiteliales de la MA en ningún caso. Las células corneales presentaron un tamaño significativamente menor (alrededor de unas 600 µm²) con pequeños espacios intercelulares. La tinción del citoplasma fue casi siempre eosinofila, mejorando también significativamente la relación núcleo-citoplasma. El tamaño nuclear fue similar al normal (alrededor de 95 µm²), siendo poco frecuente la presencia de alteraciones nucleares.

En la citología realizada a los 6 meses tampoco encontramos en ningún caso presencia de células caliciformes en el epitelio corneal. Las células epiteliales presentaron un tamaño de unas 400 µm² estando relativamente unidas entre sí. La tinción del citoplasma fue eosinófila y la relación núcleo-citoplasma menor de 1:6. Apenas se encontraron alteraciones nucleares y el tamaño nuclear fue similar al normal (fig. 4).

Fig. 4. Citología de impresión en la córnea de un paciente con aniridia 
seis meses después del TMA. Las células epiteliales presentan un aspecto
 casi normal, con citoplasmas eosinófilos y núcleos pequeños. 
Tinción PAS-hematoxilina. Aumento original x40.

En la citología realizada a los 9 meses se encontró presencia de células caliciformes en dos ojos. Éstas fueron de tamaño pequeño y con pobre contenido mucínico. Las células epiteliales presentaron un tamaño superior al encontrado en la citología de los 6 meses (unas 600 µm²), aumentando ligeramente el espacio intercelular. La tinción del citoplasma siguió siendo eosinófila, aunque aumentó la relación núcleo-citoplasma a 1:8. Se encontraron algunas alteraciones nucleares como células binucleadas, si bien el tamaño nuclear no varió significativamente con respecto a personas normales. El estudio mediante biopsia mostró que tanto el epitelio como el estroma estuvieron próximos a la normalidad, si bien las células epiteliales presentaron una tamaño superior al encontrado en personas controles. Las microvellosidades y el glicocáliz también mejoraron con respecto a la situación inicial. La capa de mucina mejoró significativamente y la membrana basal presentó un mayor grosor y continuidad. El estroma presentó una notable organización en cuanto a la disposición de las fibras de colágeno, no siendo significativa la presencia de células inflamatorias. Los vasos sanguíneos y los linfáticos fueron prácticamente normales (fig. 5).