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Archivos de la Sociedad Española de Oftalmología

versión impresa ISSN 0365-6691

Arch Soc Esp Oftalmol v.83 n.3 Madrid mar. 2008

 

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Caracterización genética de adenovirus aislados de conjuntivitis folicular y queratoconjuntivitis epidémica en un grupo de pacientes mexicanos

Genetic characterization of adenovirus isolated from follicular conjunctivitis and epidemic keratoconjuntivitis in a group of mexican patients

 

 

Mejía-López H.1, Santacruz-Valdés C.2, Matías-Florentino M.3

Instituto de Oftalmología Conde de Valenciana. Unidad de Investigación. México, D.F.
1 Doctora en Ciencias Biomédicas.
2 Doctora en Medicina. Oftalmóloga.
3 Licenciada en Ciencias Químico Biológicas.

Dirección para correspondencia

 

 


RESUMEN

Objetivo: Conocer los serotipos de adenovirus en pacientes mexicanos con conjuntivitis folicular y queratoconjuntivitis.
Métodos: Se analizaron por PCR específica para adenovirus, muestras de fondo de saco conjuntival inferior de 77 pacientes diagnosticados con conjuntivitis folicular por sospecha clínica de infección por adenovirus, de enero de 2005 a diciembre de 2006. La identificación de los serotipos se realizó por secuenciación automatizada.
Las secuencias de nucleótidos obtenidos fueron comparados con las secuencias reportadas en el GenBank. En el análisis de los resultados se utilizó la estadística descriptiva.
Resultados: Se analizaron 77 muestras de las cuales el 56% presentaron adenovirus. La secuenciación de cada muestra positiva permitió la identificación de Ad1, Ad2, Ad3 y Ad8; las secuencias de los serotipos fueron idénticas a las reportadas en el GenBank con las direcciones: AF 534906 y AY 224420 para una secuencia del gen que codifica el filamento de Ad1 y Ad2 respectivamente y AY 854180 y DQ 149614 para una secuencia del gen que codifica la proteína Hexón de Ad3 y Ad8 respectivamente. En el análisis estadístico, se pudo observar que no existe, en apariencia, una estacionalidad preferencial de los serotipos identificados.
Conclusiones: En este trabajo se identificaron los serotipos Ad1, Ad2 y Ad3 en pacientes con diagnóstico clínico de conjuntivitis folicular en el 2005, Ad2 fue el serotipo predominante. También se detectó en un brote de queratoconjuntivitis epidémica por Ad8. Desde el punto de vista epidemiológico, ningún serotipo encontrado parece tener estacionalidad preferente.

Palabras clave: Adenovirus, epidemiología molecular, conjuntivitis folicular, queratoconjuntivitis, infecciones oculares.


ABSTRACT

Objetive: To determine the adenovirus serotype in Mexican patients with folicular conjunctivitis and keratoconjunctivitis.
Methods: Adenovirus-specific PCR was used to analyze sample scrapings from the inferior fornix of patients with follicular conjunctivitis and clinical suspicion of adenovirus from January 2005 to December 2006. Identification of the serotype was made by automated sequencing. The nucleotide sequences obtained were compared with the reported sequences in GenBank. Descriptive statistical analyses were performed on the results.
Results: Of the 77 samples with clinical data of follicular conjunctivitis that were analyzed, 43 (56%) presented adenovirus. The sequencing of each positive sample allowed the identification of Ad1, Ad2, Ad3 and Ad8; the sequences of the serotype were identical those reported in GenBank with accession numbers: AF 534906 and AY 224420 for a sequence of the gene coding for the filament of Ad1 and Ad2 respectively, and AY 854180 and DQ 149614 for a sequence of the gene that codes for the Hexon protein of Ad3 and Ad8 respectively. From the statistical analysis it was possible to determine that a preferential seasonality of the serotype does not exist.
Conclusion: In this work the Ad1, Ad2 and Ad3 serotypes were identified in patients with clinical diagnosis of follicular conjunctivitis in 2005. Ad2 was the predominant serotype. Ad8 was also detected in an outbreak of epidemic keratoconjunctivitis. From an epidemiological point of view, no serotype found seems to have a preferred seasonality (Arch Soc Esp Oftalmol 2008; 83: 161-168).

Key words: Adenovirus, molecular epidemiology, follicular conjunctivitis, keratoconjunctivitis, ocular infections.


 

Introducción

Los Adenovirus (Ad) causan múltiples enfermedades clínicas que afectan sistemas ocular, respiratorio y gastrointestinal.

Los Ad humanos pertenecen a una amplia familia de 51 serotipos descritos y que se encuentran clasificados en seis subgéneros (A-F) basados en varias características bioquímicas y moleculares (1,2). Las infecciones que producen estos virus están íntimamente relacionadas con su tropismo en diversos tejidos (3). En la literatura se ha mostrado la variedad de serotipos de Ad pertenecientes a los subgeneros B (Ad3 y Ad7), C (Ad1, Ad2, y Ad5), o E (Ad4), como causantes esporádicos de conjuntivitis, conjuntivitis folicular o fiebre faringo-conjuntival (4-6). Los brotes epidémicos son producidos por el subgenero D fundamentalmente por Ad8 asociado a queratoconjuntivitis epidémica (7,8).

La tipificación precisa de los serotipos es crucial en los estudios epidemiológicos así como en la calidad del diagnóstico. Esto implica, que la identificación en muestras oculares de los serotipos Ad1, Ad2 y Ad5 que afectan preferentemente vías respiratorias (subgénero C) es menos grave en el pronóstico de el cuadro oftalmológico, que la detección de serotipos como el Ad8, Ad19 y Ad37 los cuales son los agentes más comunes en la queratoconjuntivitis hemorrágica, una infección ocular altamente contagiosa y discapacitante (7,8).

El objetivo de este trabajo fue conocer los serotipos de adenovirus en muestras de pacientes con diagnóstico clínico de conjuntivitis folicular y queratoconjuntivitis que acudieron a la consulta externa de nuestro instituto. Se utilizó para ello una PCR específica para detectar el virus y la identificación de los serotipos se realizó por secuenciación automatizada, una técnica que permite la caracterización del ADN.

 

Sujetos, material y métodos

Muestras clínicas

Se analizaron muestras de pacientes diagnosticados con conjuntivitis folicular por sospecha clínica de infección por adenovirus, de enero de 2005 a diciembre de 2006. Los criterios de inclusión implicaron pacientes con hiperemia conjuntival de intensidad variada, quemosis y edema palpebral acompañado o no de síntomas generales. La toma de la muestra se realizó mediante un raspado de saco conjuntival inferior con un hisopo de arginato de calcio (Eurotubo, S.A. España), que se introdujo posteriormente en un medio de transporte que contenía 50mg/ml de gentamicina, 500U de penicilina-estreptomicina/ml, fungizona 1 mg/ml y 5% albúmina sérica bovina en un buffer de Hank (Gibco, Invitrogen LT. USA).

Extracción de ADN

La extracción de ADN se realizó con el mini kit QIAamp según protocolo de Quiagen (QIAGEN, Sciences. Meryland, USA). El material genético fue almacenado a -20ºC hasta su procesamiento.

PCR genérica

Fueron usados para amplificar un producto de PCR de 140pb, Los oligonucleótidos 5’-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3’ y 5’-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3’. Este amplificado corresponde a una región altamente conservada del ADN que codifica para la proteína Hexón constituyente de los capsómeros de todos los tipos de adenovirus. Como controles se usaron los ADNs de Ad1, Ad2 y Ad5, aislados de pacientes con infección respiratoria aguda, proporcionados gentilmente por la Maestra en Ciencias Irma López Martínez, Laboratorio de Infecciones Respiratorias del Instituto de Diagnóstico y Referencias Epidemiológicos de la Secretaría de Salud (México, D. F.). Cada reacción fue realizada según el protocolo de Elnifro EM y cols (9) en un termociclador GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer Co. Norwalk, Connecticut). Los productos de PCR se analizaron en geles de agarosa al 1,5% teñidos con bromuro de etidio (1 ug/ml). Se usó como marcador estándar de pesos moleculares el Ready-Load 100 bp DNA Ladder (Invitrogen Co.).

Identificación de serotipos

Serotipos específicos fueron identificados por secuenciación, se usó para ello oligonucleótidos que reconocen el gen que codifica para el filamento de los adenovirus del subgénero C. El oligonucleótido corriente arriba AdCF 5’-TGCTTGCGCTHAAAATGGGCA-3’, es común en los cuatro Ad de este subgénero y los oligonucleótidos corriente abajo Ad1R CGAGTATAAGACGCCTATTTACA-3’, Ad2R 5’-CGCTAAGAGCGCCGCTAGTA-3’ y Ad5R 5’-ATGCAAAGGAGCCCCGTAC-3’ pertenecen al ADN que codifica el filamento de los serotipo específicos, estos permiten la obtención de los amplicones de 630pb, 204pb y 455pb, respectivamente (10). Se usaron además los oligonucleótidos AdnU7 5`-TTCCCCATGGCNCACAACAC-3` y AdnU4’ 5`-GCCTCGATGACGCCGCGGTG-3` que amplifican una secuencia de 1004 pb que corresponden al gen de la proteína Hexón que comparten los serotipos Ad2-8, Ad11, Ad14, Ad19, Ad37, Ad40 y Ad41 (11). Para la secuenciación de ADN se utilizó el kit BigDye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA) que contiene cada ddNTP marcado con fluorescencia, el volumen de reacción fue de 10uL con 10ng del ADN a secuenciar y 1uM de cada primer. Los productos de la reacción fueron purificados en Columnas CentriSep (Princeton Separations. Applied Biosystems.) y analizados en un secuenciador ABI Prism 310 (Applid Biosystems.) Las secuencias de nucleótidos obtenidas fueron comparados con las secuencias de nucleótidos reportadas en el GenBank.

 

Resultados

Pacientes estudiados

Se analizaron 77 muestras de raspado de fondo de saco conjuntival inferior de pacientes con conjuntivitis folicular con sospecha de infección por adenovirus. Las figuras 1, muestran características clínicas que con frecuencia se observaron en pacientes infectados con adenovirus esporádicos (Ad1, Ad2 y Ad3).


Fig. 1. Conjuntiva edematosa con folículos y microhemorragias
en un paciente con infección por Ad2.

 

PCR genérica

La PCR genérica demostró la presencia de adenovirus en 43 muestras que representan el 56% de la muestra total. En la figura 2 se muestran el amplificado de 140pb, que corrobora la presencia de adenovirus en una muestra positiva, obtenido con los oligonucleótidos genéricos. La tabla I muestra los hallazgos clínicos de los pacientes que resultaron positivos al PCR para adenovirus. Cabe destacar que el ojo rojo y la quemosis son un común denominador en todos los casos; con respecto a las microhemorragias así como los folículos, se observaron con más frecuencia en los casos por Ad3 y Ad8. Llama la atención en los casos por Ad8 se identificó como signo clínico sobresaliente, la presencia de membranas y el involucro corneal, manifestado clínicamente como queratitis punteada superficial e infiltrados (fig. 3). Con respecto a la sintomatología y hallazgos concomitantes se puede observar que la rinorrea, faringitis y adenomegalia resaltan como características dominantes en los virus respiratorios así como en Ad3.

 


Fig. 2. Gel 1,5% de agarosa teñido con bromuro de etidio que
representa un ejemplo de amplificación del PCR genérico;
Línea 2=control negativo; Línea 3= amplificado de 140 pb. M,
marcador estándar Ready-Load 100 bp DNA.

 

 


Fig. 3. Queratoconjuntivitis epidémica por Ad8. A) Folículos
hipertróficos a nivel de tarso superior; B) Formación de pseudomembranas;
C) Infiltrados corneales subepiteliales; D) Descamación de piel periorbital.

 

Identificación de serotipos

Debido a que la PCR genérica sólo demuestra la presencia del virus, se utilizó una técnica más específica para identificar el serotipo correspondiente. Las 43 muestras positivas en la PCR genérica fueron secuenciadas, esto permitió la identificación de Ad1, Ad2, Ad3 y Ad8. Las secuencias de nucleótidos obtenidas fueron idénticas a las reportadas en el GenBank con las direcciones: AF 534906 y AY 224420 para una secuencia del gen que codifica el filamento de Ad1 y Ad2 respectivamente y AY 854180 y DQ 149614 para una secuencia del gen que codifica la proteína Hexón de Ad3 y Ad8 respectivamente. La figura 4 compara la presencia de casos de conjuntivitis por adenovirus del 2005 y del 2006, en ella puede observarse que no existe, en apariencia, una estacionalidad preferencial de los serotipos identificados sin embargo debe mencionarse que en el mes de junio la distribución por número de casos fue mayor. La tabla II muestra la distribución de los serotipos en los meses estudiados, puede observarse que Ad1 se encontró en dos muestras, Ad2 en veintiuno, Ad3 en diez y Ad8 en once de ellas. Los Ad2 y Ad3 se comportaron de manera semejante durante el 2005 siendo que Ad2 se presentó con mayor frecuencia en los meses de junio y julio. Cabe subrayar que en el 2006 se manifestó de manera súbita un brote epidémico por Ad8, en dos casos identificados en el mes de marzo, en donde se encontró el caso índice. En la muestra estudiada Ad8, fue predominante en la segunda mitad del año. En abril del 2005 se identificaron coinfectando en una muestra los serotipos Ad1 y Ad2.

 


Fig. 4. Comparación del número de casos de conjuntivitis por
adenovirus en los años estudiados. Las barras en gris representan
 los casos del 2005 y las negras al 2006.

 

 

Discusión

Todos los pacientes de este estudio (77) fueron diagnosticados con conjuntivitis folicular. Adenovirus fue el responsable del 56% de los casos; es relevante mencionar, que los síntomas de esta entidad clínica no son patognomónicos de una infección por adenovirus ya que otros patógenos pudieron ser la causa del cuadro como son Coxackie, Citomegalovirus o Enterovirus (12-14). En nuestro reporte mostramos el comportamiento epidemiológico de adenovirus responsables de conjuntivitis folicular en el curso de 24 meses en nuestro instituto. Según la distribución de los casos parecen no tener un comportamiento estacional. Durante el año 2005, Ad1 y Ad2 así como Ad3 descrito en casos esporádicos, fueron identificados en las muestras estudiadas en comparación, con un brote de conjuntivitis epidémica por Ad8 durante el 2006. Los serotipos Ad1 y Ad2 (subgénero C), son predominantemente responsables de infecciones respiratorias, sin embargo, se ha reportado que una conjuntivitis folicular puede ocurrir como parte de un síndrome respiratorio-faríngeo o como una entidad separada; la enfermedad está frecuentemente acompañada de linfoadenopatía (4-6). En este estudio se identificaron como signos consistentes asociados a la presencia de Ad1 y Ad2 ojo rojo y quemosis. Los síntomas más comunes fueron dolor, ardor, prurito, fotofobia y lagrimeo, destacando la sensación de cuerpo extraño. Como hallazgos concomitantes la rinorrea, faringitis y adenomegalias fueron observadas, destacando este último como una característica de infección respiratoria asociada a adenovirus, como se ha descrito en la literatura.

Los serotipos Ad3 y Ad7 afectan preferentemente a niños. Son causantes de conjuntivitis folicular o fiebre faringo-conjuntival. El cuadro clínico se caracteriza por fiebre, faringitis, adenopatías, hiperemia conjuntival, lagrimeo y conjuntivitis folicular aguda. La conjuntivitis cursa con ojo rojo, quemosis y edema palpebral intenso, lagrimeo y secreción fibrinopurulenta. En el 30% de los casos se desarrollan lesiones corneales en forma de queratitis punteada superficial. El proceso se resuelve favorablemente en aproximadamente dos semanas sin dejar secuelas excepto en el caso de que hayan existido complicaciones (1,4). En nuestro estudio el cuadro clínico por Ad3 en comparación con los virus respiratorios (Ad1 y Ad2) manifestó mayor presencia de folículos, microhemorragias, rinorrea y una asociación importante con faringitis. Otros serotipos tales como Ad4, Ad9-11, Ad15-17, Ad 20 y 22 (subgénero C, D y E), también pueden estar asociados con este síndrome, sin embargo epidemiológicamente, estas infecciones pueden ocurrir esporádicamente o causar enfermedad en un grupo menos numeroso de contacto.

En la población estudiada se identificó Ad8 del subgénero D. Este serotipo representa la causa clásica de la queratoconjuntivitis epidémica producida por Ad8, Ad19 o Ad37. Es un cuadro viral altamente contagioso que afecta preferentemente a adultos. En ocasiones el cuadro clínico se acompaña de malestar general, odinofagia y febrícula. El inicio puede ser muy agudo con sensación de cuerpo extraño importante, edema conjuntival y palpebral así como hiperemia y lagrimeo abundante. A las 24 horas de iniciado el cuadro se pueden observar folículos en la conjuntiva tarsal y bulbar predominantemente inferior. Esta sintomatología progresa rápidamente y alcanza un óptimo alrededor del tercer día. La secreción que en principio es serosa, se transforma en serofibrinosa y continúa a la formación de pseudomembranas. Entre el tercer y quinto día, el cuadro se torna bilateral aunque la afección del ojo contralateral es siempre más leve que la del primero. En el 80% de los casos la queratitis punteada superficial se presenta al inicio. Estas lesiones se resuelven en un plazo no inferior a 15 días pudiendo producir depósito de inmunocomplejos subepiteliales a nível de la capa de Bowman, y formando opacidades que provocan aumento de la fotofobia dificultando así la visón. Como resultado de lo anterior, se fomenta un estado incapacitante para el paciente debido a que tardan en reabsorberse hasta un período que puede durar meses e incluso años (7,8,14). Nuestros resultados corroboran lo descrito anteriormente ya que pudo observarse en tres de nuestros casos la formación de pseudomembrana y que la afección a nivel corneal manifestada como queratitis punteada superficial e infiltrados subepiteliales fue una característica más acentuada en los afectados por Ad8 a diferencia del resto de los pacientes afectados por Ad1, Ad2 y Ad3. Un hallazgo poco frecuente asociado a este tipo de Adenovirus es la faringitis que se presentó en dos de nuestros casos. Resulta interesante subrayar, que un hallazgo poco descrito pero importante, fue la descamación de la piel periorbitaria observada en dos de nuestros casos (tabla I, fig. 3D).

En una de las muestras estudiadas se identifico una coinfección con Ad1 y Ad2, situación no común ya que existen pocos estudios que aportan datos sobre la posibilidad de una coinfección con diferentes serotipos. En 1965 se identificó en muestras de humanos y de simios, un virus «contaminante» de la familia de los parvovirus. Este tenía la incapacidad de replicarse en ausencia de adenovirus y se le llamó virus asociado a adenovirus (AAV) (15). Recientemente Echavarria M (16) y colaboradores demostraron la coinfección de serotipos del subgénero C con adenovirus entéricos, la importancia de estos hallazgos no se conoce pero es claro que requieren de mayor atención.

En México es escasa la información sobre la identificación de Adenovirus (17-20). Nosotros publicamos en el 2006 la identificación, por métodos moleculares, de adenovirus del subgénero C asociados con conjuntivitis en pacientes mexicanos (21). En el presente trabajo se muestra el primer estudio epidemiológico de serotipos que afectan al ojo incluyendo un brote epidémico por Ad8.

En este estudio se identificaron los serotipos Ad1, Ad2, Ad3 y Ad8 en pacientes con diagnostico clínico de conjuntivitis folicular y queratoconjuntivitis epidémica en el período comprendido de enero de 2005 a diciembre de 2006. Desde el punto de vista epidemiológico, ningún serotipo encontrado parece tener estacionalidad preferente.

El número de casos en un mayor tiempo de estudio permitirá la mejor apreciación de la dinámica epidemiológica de los adenovirus de importancia en la oftalmología en nuestro país.

 

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Dirección para correspondencia:
Chimalpopoca, 14 Col. Obrera
Del. Cuauhtemoc. CP 06800
México, D.F.
E-mail: linchm10@yahoo.com

Recibido: 16/3/07.
Aceptado: 12/2/08.