Fração vascular estromal de tecido adiposo: como obter células-tronco e seu rendimiento de acordo com a topografia as áreas doadoras: nota prévia

Almeida, K. A.*, Campa, A.*, Cardoso Alonso-Vale, M. I. **, Bessa Lima, F.**, Dib Daud, E.***, Nogueira Stocchero, I.****

* Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, Brasil
** Departamento de Fisiologia e Biofísica, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, Brasil
*** Departamento de Cirurgia Plástica, Faculdade de Medicina, Universidade do ABC, São Paulo, Brasil
**** Chefe do Departamento de Cirurgia Plástica, Hospital Santa Catarina, São Paulo, Brasil

Resumo

A coleta de tecido adiposo será um novo e promissor mercado de trabalho para os cirurgiões plásticos, já que os bancos de tecidos irão certamente escolher a gordura como o meio mais fácil de se obter uma fonte de células-tronco de alto rendimento, na medida em que este tipo de tecido é capaz de produzir pelo menos cinco vezes mais unidades formadoras de colônia (UFCs) do que extratos de medula óssea. O objetivo deste estudo foi avaliar o que se pode esperar do tecido adiposo como origem de células adultas da fração vascular estromal (FVE), e avaliar as melhores áreas do corpo humano a serem eleitas como doadoras de tecido adiposo, retirado através de lipoaspiração.
Foi descrita a rotina seguida para se obter células da FVE através da digestão de amostras de tecido adiposo humano por colagenase. Na época de coleta, essas células apresentavam uma viabilidade de 92 ± 1%, baseado na exclusão por azul de tripan. As células da FVE foram contadas depois de serem deixadas por 48h em meio de cultura de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), dentro de uma câmara de Neubauer.
O rendimento médio das células da FVE foi de 7,2 ± 1,3 x 103 células por mililitro de tecido lipoaspirado.
Conclusões: as melhores estratégias para a obtenção de células da FVE são um importante desafio atualmente. Este estudo, embora preliminar, mostrou que as células da FVE podem ser facilmente obtidas por meio de lipoaspiração. A comparação entre diferentes áreas doadoras mostrou um rendimento 22% maior para células da FVE quando o tecido adiposo havia sido obtido da região do tronco, quando confrontado com os membros.

PALAVRAS CHAVE: Células-tronco, Gordura, Tecido adiposo, Lipoaspiração, Lipectomia, Fração vascular estromal.

Introdução

A Cirurgia Plástica, em sua busca pela reparação e melhora estética, tem procurado em várias fontes, ao longo dos anos, as melhores soluções, ainda que em fases experimentaiS (1-3). Hoje, a pesquisa envolvendo as chamadas células-tronco adultas mostram um caminho promissor na área da medicina e da cirurgia reparadoras. As células da fração vascular estromal (FVE) humana já foram isoladas de medula óssea, periósteo, osso trabecular, tecido adiposo, sinóvia, músculo esquelético e dentição decídua (4-7). Vários métodos estão disponíveis atualmente para isolar a FVE, baseados em suas características físicas e físico-químicas como, por exemplo, aderência a plástico ou a outros componentes da matriz extracelular. Devido à facilidade de isolamento e extenso potencial de diferenciação, acredita-se que a FVE seja composta de tipos de células-tronco com boas chances de serem introduzidos brevemente na prática clínica. A identificação de várias FVE que mantêm a capacidade de se diferenciar em múltiplos tipos de células tem sido uma etapa crítica no fornecimento de fontes potenciais de células para a engenharia de tecidos.

O tecido adiposo representa uma fonte alternativa de células-tronco e está rotineiramente disponível em enormes quantidades (litros) através da lipoaspiração. Depósitos subcutâneos de tecido adiposo são acessíveis, abundantes e passíveis de reposição, assim oferecendo um reservatório potencial de células-tronco adultas em cada indivíduo. Muitos grupos de pesquisa, trabalhando independentemente, demonstraram que células-tronco derivadas de tecido adiposo conseguem se diferenciar in vitro em múltiplas linhagens, dentre as quais adipócitos, condrócitos, hepatócitos e osteoblastos, além de células endoteliais, epiteliais, hematopoéticas, neuronais e miogênicas (8-12). Muitos termos têm sido usados para identificar as células da FVE, incluindo células precursoras de adipócitos, pré-adipócitos, células-tronco adultas derivadas do subcutâneo, células estromais derivadas de tecido adiposo, células estromais aderentes derivadas de tecido adiposo, células de lipoaspirado processado, e células-tronco derivadas de tecido adiposo. Neste trabalho, usaremos o termo células da FVE.

Embora alguns grupos tenham focado sua atenção exclusivamente na subpopulação expandida aderente a plástico em vários estágios, outros têm trabalhado com a população de células da FVE minimamente processadas. Portanto, muito do conhecimento atual evoluiu de estudos que investigaram as propriedades de sua progênie in vitro. Além disso, grupos dessas células podem ser induzidos a expressar o perfil bioquímico de muitos tipos de células, sob condições apropriadas de cultura in vitro. Depois da expansão in vitro, foi relatado que o número de FVE in vivo aumentou de 105 a 106 vezes sua densidade original em tecido adiposo. Entretanto, os resultados variam significativamente em muitas publicações, provavelmente porque ainda não foi estabelecido nenhum protocolo padrão. Conseqüentemente, está faltando uma estimativa mais precisa do número de FVE.

O objetivo deste estudo foi padronizar um procedimento para o isolamento, manutenção e rendimento de FVE humanas obtidas a partir de tecido adiposo de distintas regiões do subcutâneo, através de cirurgia de lipoaspiração, dado que células-tronco derivadas de tecido adiposo exibem vantagens potenciais para aplicações em engenharia de tecidos.

Materiais e metodos

Um total de 12 amostras de tecido adiposo humano (ginecomastia bilateral n=1, abdome n=3, culotes n=3, flancos n=2, face interna das coxas n=1, e braços n=2), obtido a partir de 21 áreas tratadas em sete pacientes sadios (um homem e seis mulheres) submetidos a cirurgia eletiva, foi analisado (Tabela I). A idade média [média ± desvio-padrão (DP)] foi de 45 ± 13 anos, e variou entre 38 e 68 anos. O índice de massa corpórea (IMC) médio foi de 24 ± 3, e variou entre 22 e 29. Nenhum paciente apresentava sepse, malignidades ou distúrbios endócrinos. Este estudo foi aprovado e respeitou as orientações do Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, Brasil. Todos os pacientes foram informados dos objetivos e procedimentos da investigação, e nos forneceram seu consentimento por escrito.

Preparação dos tecidos e isolamento das células

Utilizamos cânulas com diâmetro interno de 3 a 5mm, conectadas a seringa de 60mL (Fig. 1), para os procedimentos de lipoaspiração. O isolamento dos adipócitos foi feito de acordo com Rodbell (13).

Amostras de tecido adiposo (20mL) foram picadas com tesoura fina e adicionadas a frascos (4g/frasco), cada um contendo 20mL de DMEM estéril, 5mM de glicose, 1% de albumina sérica bovina (ASB) fração V, antibióticos (100μM/mL de penicilina e 100μg/mL de estreptomicina) e 1mg/mL de colagenase tipo II, em pH 7,4. A mistura foi incubada em um agitador orbital a 150 rpm durante 30 minutos a 37ºC. O material digerido foi filtrado através de uma malha plástica grossa e, em seguida, uma malha plástica fina, sendo então transferido para um tubo plástico cônico de 50mL. O filtrado resultante foi centrifugado a 300G por 5 minutos. Depois da centrifugação, três camadas distintas eram reconhecíveis: uma camada branca flutuante composta pelos adipócitos; o meio de digestão; e um pellet contendo as células da FVE mais eritrócitos (Fig. 2).

O pellet de FVE ao fundo da centrífuga foi ressuspendido em 6mL de tampão; então, alíquotas de 3mL da última mistura foram colocadas em uma placa de cultura de seis poços. As células foram nutridas com meio estromal composto de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de solução antibiótica (100μU/mL de penicilina e 100μg/mL de estreptomicina) e mantidas por 48h em uma incubadora de CO2. Após este período, o meio de incubação foi removido e a placa foi lavada quatro vezes, cada lavagem sendo feita com 3mL de solução salina estéril tamponada com fosfato, a fim de remover quaisquer células não-aderentes. As células aderentes (Fig. 3) foram tripsinizadas, recoletadas, centrifugadas a 300G e ressuspendidas em 1mL de DMEM com 10% de SFB.

As células foram contadas em uma câmara de Neubauer. Na época da coleta, essas células apresentavam uma viabilidade de 92 ± 1%, baseado em exclusão por azul de tripan. As células foram replaqueadas e incubadas por um período adicional de 21 a 28 dias, até a confluência ser atingida (Fig. 4).

Resultados

Lipoaspirados de tecido adiposo subcutâneo obtidos de 21 áreas doadoras (em um total de 7 pacientes submetidos a cirurgia eletiva de lipoaspiração) foram divididos em 12 amostras e processados através de digestão por colagenase e centrifugação diferencial.

O rendimento médio das células da FVE foi de 7,2 ± 1,3 x 103 células por mililitro de tecido lipoaspirado (Tabela I). Na época da coleta, essas células apresentavam uma viabilidade de 92 ± 1%, baseado em exclusão por azul de tripan.

Discussão

É comumente aceito que células-tronco e células precursoras estão envolvidas na manutenção contínua e reparo da maioria dos tipos de tecidos. Levando em consideração que as células-tronco têm capacidade de auto-renovação e de diferenciação em múltiplas linhagens, esta classe de células é de primordial importância para um organismo, não apenas durante o desenvolvimento, mas também durante a maturidade, em relação à homeostase celular.

O melhor meio de se obter essas células da FVE é um importante desafio atualmente. Após este estudo preliminar, podemos concluir que o rendimento das células obtidas a partir do tronco humano (ginecomastia - 8,0; abdome - 7,75; e flancos - 7,5) apresentou uma média final de 7,75 x 103/mL de gordura lipoaspirada, enquanto que, no caso dos membros humanos (culotes - 7,5; face interna das coxas - 6,0; e braços - 5,5), o rendimento médio final foi de 6,3 x 103/mL de gordura lipoaspirada.

Conclusões

De acordo com este estudo, as áreas doadoras preferidas para se obter um rendimento 22% maior de células da FVE estão localizadas no tronco, que se mostrou uma fonte melhor de células-tronco do que os membros.

Tais dados, ainda que preliminares, já têm influído em opções de áreas doadoras preferenciais para lipoenxertias, corroborando os achados apurados. Os estudos com marcadores celulares para comprovarem a descendência das células-tronco transferidas, o seu rendimento a partir de diversos grupos de portadores de lipodistrofias, bem como o uso de variadas metodologias, continuam a serem feitos, sendo objeto de apresentação futura.

AGRADECIMENTOS

Os autores gostariam de agradecer à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), por seu apoio financeiro. E também a Guilherme Flosi Stocchero, estudante do quarto ano da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, por seu auxílio na execução e redação deste artigo.

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