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Introducción
El mecanismo por el cual se produce daño tisular tras la reperfusión de un tejido previamente sometido a isquemia ha sido objeto de diversos estudios en distintas especialidades. La minimización de este daño, secundario a la necesaria reperfusión de un tejido isquémico, ha sido el motor de toda investigación en este campo.
Las principales áreas de estudio del daño por isquemia / reperfusión (I/R) han sido la Cardiología, la Neurología y las especialidades quirúrgicas relacionadas con el desarrollo y el avance de la cirugía de trasplante de órganos. En este sentido, en la Cirugía Plástica el daño por I/R tiene una importancia capital en 3 procesos:
Reimplante de extremidades: el tiempo de margen en el cual podemos realizar el reimplante de un miembro con seguridad, viene marcado por el daño por reperfusión que sufrirá el tejido tras la cirugía.
Reconstrucción con colgajos libres: la reconstrucción de defectos tisulares complejos, de etiología traumática, oncológica o congénita, requiere en muchas ocasiones la utilización de colgajos libres. Es decir, utilizar el propio tejido del paciente para reconstruir un defecto a distancia. Durante la cirugía, el colgajo es sometido a un tiempo de isquemia hasta que es posible la reperfusión una vez anastomosado el pedículo vascular a los vasos receptores. Un elevado tiempo de isquemia, en caso de complicación, puede suponer el fracaso de la intervención
Trasplante tisular compuesto: en caso de amputación de ambos miembros superiores o de defectos faciales complejos en los que otras técnicas de reconstrucción no logran conseguir resultados satisfactorios, está indicado el trasplante tisular compuesto. En este sentido, el éxito de la realización de un trasplante facial o de miembros superiores depende del tiempo de isquemia al que ha sido sometido el injerto antes de ser trasplantado.
En todos estos procedimientos, el daño por I/R juega un papel determinante. Dentro del daño por I/R, el edema tisular es una pieza fundamental que puede conducir al fracaso de las intervenciones antes señaladas. Dicho edema puede llegar a impedir por si mismo la correcta perfusión tisular al afectar a la microvascularización y conducir al fracaso de la intervención.
Daño por isquemia / reperfusión
El daño por isquemia / reperfusión es inevitable durante procedimientos como el reimplante o trasplante de una extremidad, el uso de colgajos libres o cirugías de larga duración en extremidades. El tiempo que puede aguantar cada uno de los injertos o colgajos en isquemia hasta su reperfusión, depende de la composición tisular en cada caso.(1) En particular, el músculo es particularmente susceptible a la isquemia.(2) La consecuente disfunción muscular en las extremidades o en el colgajo muscular es relevante ya que su integridad fisiológica es clave para su funcionalidad. Además, el proceso de edema del tejido muscular puede conllevar un síndrome compartimental en la extremidad al imposibilitarse su expansión por los compartimentos fasciales.(3) Este síndrome compartimental puede poner en riesgo no solo la integridad de la extremidad, sino también la vida del paciente, incapaz de procesar las sustancias de desecho vertidas al torrente sanguíneo por la necrosis tisular.
A nivel celular, la isquemia prolongada reduce la producción de adenosin trifosfato (ATP) e inhibe la sodio-potasio adenosin trifosfatasa, provocando un incremento del sodio y el calcio intracelulares. La elevada glucólisis durante la isquemia causa acumulación de ácido láctico asociado a la reducción del pH, produciendo finalmente la muerte celular.(4) La reperfusión es la única opción capaz de evitar la necrosis isquémica. Sin embargo, conlleva la rápida producción de radicales libres de oxígeno en la mitocondria e inicia un proceso de daño tisular que va más allá del producido por la isquemia.(5)
La disfunción endotelial es una de las características del daño por I/R. El endotelio lesionado produce agentes como la endotelina o el tromboxano y suprime la expresión de óxido nítrico, conduciendo a un incremento del tono vascular.(6)
El daño por I/R se ha identificado como uno de los principales factores asociados al rechazo en modelos de trasplante tisular compuesto. Pradka y col.(7) reportaron tasas de rechazo significativamente superiores en colgajos miocutáneos expuestos a 3 horas de isquemia antes de ser trasplantados entre ratas, frente a aquellos sometidos tan solo a 1 hora de isquemia. Esto se evidencia por un infiltrado difuso linfocitario mucho más agresivo, con disrupción de la arquitectura tisular.
Patrón temporal del edema muscular tras el daño por I/R y su valoración mediante resonancia magnética
De forma secundaria al daño por I/R, se produce una intensa reacción edematosa debido a la anormal acumulación de líquido en el intersticio muscular. Su importancia clínica ha llevado a diversos grupos de trabajo al estudio de la fisiopatología del proceso y a la valoración de distintas terapias que pudieran disminuir la lesión producida. Sin embargo, la necesidad de aplicar técnicas invasivas para la valoración histológica dificulta la evaluación cronológica del proceso, dando por hecho que el edema formado persiste de forma estable durante una semana.(8)
Recientemente se ha demostrado que el edema formado en el miocardio secundario a un proceso de I/R sigue un patrón bimodal.(9) La primera onda de edema aparece de forma aguda tras la reperfusión y se disipa a las 24 horas. La segunda onda, en cambio, es mayor al séptimo día, siendo principalmente debida al proceso de regeneración del tejido e infiltrado infamatorio.
Uno de los métodos diagnósticos más útiles para la valoración no invasiva del daño por I/R en cardiología ha sido la resonancia magnética, produciendo un auge en su aplicación clínica y experimental. Sin embargo, el uso de la resonancia magnética en investigaciones relacionadas con el edema tras el daño por I/R en tejido no cardiaco aún no ha sido estudiado. La evolución de la tecnología permite obtener imágenes de forma más rápida y precisa, en especial usando la técnica gradiente-spin-eco para el mapeo de secuencias T2, lo que facilita su uso en protocolos de investigación de I/R.(10)
La hipótesis de trabajo del presente plan de investigación es que el edema muscular secundario al daño por I/R no es constante en el tiempo y sigue un patrón bimodal.
De acuerdo a ella, los objetivos a alcanzar se desglosan en:
Validar un modelo experimental porcino de edema muscular tras I/R de un colgajo miocutáneo de recto abdominal basado en vasos epigástricos superiores profundos.
Analizar la utilidad de la resonancia magnética como método de estudio no invasivo del edema muscular en dicho modelo.
Cuantificar el edema muscular antes del daño por I/R, inmediatamente tras la reperfusión, a las 24 horas y a los 7 días, mediante resonancia magnética y mediante el método clásico de desecación.
Material y método
Todos los procedimientos que se detallan a continuación contaron con la pertinente autorización de los comités de ética de experimentación animal según la legislación vigente en España.
Animales de experimentación
Utilizamos cerdos Large White de entre 35 y 45 kg de peso proporcionados por la empresa Charles River Laboratories International, Inc. [código 052, 571 (Oakwood)]. A su llegada al centro fueron estabulados y cuidados en el Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), donde recibieron seguimiento veterinario previo y posterior a la intervención quirúrgica.
Resonancia magnética (RM)
Los estudios de RM se realizaron en un imán de 3T (Achieva, Philips Healthcare, Best, Países Bajos) usando marcadores posicionales con píldoras de vitamina A masiva (Auxina) adheridas a la piel adyacente de la zona intervenida, marcando las zonas de interés.
Modelo porcino de edema muscular en colgajo miocutáneo de recto abdominal
Las intervenciones quirúrgicas a realizar en los animales de experimentación siguieron el siguiente protocolo.
La anestesia en el animal se indujo con 20 mg/kg de ketamina, 2 mg/kg de xilacina y 0.5 mg/kg de midazolam mediante inyección intramuscular en su propia jaula. Se procedió entonces a la intubación del animal y al mantenimiento durante la intervención mediante inhalación con Isofuorano y via venosa periférica (vena marginal de la oreja con catéter de 20-22G).
Durante el procedimiento el animal fue colocado en decúbito supino y debidamente monitorizado mediante pulsioximetría, manguito de presión arterial y control electrocardiográfico.
Marcamos con rotulador dérmico las incisiones para el levantamiento de los colgajos siguiendo las líneas anatómicas establecidas en diseños experimentales consultados, de aproximadamente 5 cm de ancho por 13 cm de largo, dejando 2 cm de distancia entre las incisiones mediales de ambos colgajos. En cada cerdo levantamos los dos rectos abdominales con su correspondiente isla cutánea que sirvió como testigo del proceso de I/R. El colgajo que sufrió el daño por I/R fue aleatorizado en cada animal, sirviendo el colgajo contralateral como control.
Realizamos todas las técnicas quirúrgicas bajo estrictas condiciones de asepsia, utilizado material estéril y preparación del campo quirúrgico mediante administración tópica de solución antiséptica de povidona yodada. Utilizamos proflaxis antibiótica perioperatoria con ciprofloxacino, procediendo entonces con la intervención. Una vez disecado el tejido manteniendo únicamente los vasos epigástricos superiores profundos, procedimos al clampado arterial y al cierre por planos, manteniendo únicamente la apertura correspondiente al clamp vascular. Durante el periodo de isquemia realizamos la disección del colgajo contralateral, sin clampar en este caso el pedículo vascular.
Tras 6 horas de isquemia administramos un bolo intravenoso de heparina no fraccionada (300 mg/kg) y retiramos el clamp, comprobando la correcta reperfusión tisular y suturando la zona que permanecía abierta para acceder al pedículo vascular, terminando así la intervención (Fig. 1).
Resonancia magnética: protocolos
Los animales fueron estudiados mediante resonancia magnética (RM) antes de la intervención (grupo basal), inmediatamente después de la reperfusión (grupo agudo), a las 24 horas y a los 7 días de esta. Para la realización de dichos estudios, los animales de los grupos basal, 24 horas y 7 días fueron anestesiados con el mismo protocolo de inducción antes mencionado, en su propia jaula.
Realizamos la prueba con el animal colocado en decúbito prono para minimizar el movimiento abdominal respiratorio, con respiración espontánea y perfusión de ketamina, xilazina y midazolam a dosis bajas para la anestesia. Empleamos un imán de 3T (Achieva, Philips Healthcare, Best, Países Bajos) usando marcadores posicionales con píldoras de vitamina A masiva (Auxina) adheridas a la piel adyacente de la zona intervenida, obteniendo imágenes para evaluar el edema del músculo recto abdominal intervenido con secuencias potenciadas en T2 (Fig. 2).
Análisis de datos de la resonancia magnética
Cuantificamos la extensión del tejido muscular edematoso en cada imagen usando el software MR Extended Work Space 2,6 (Philips Healthcare) por parte de 2 observadores expertos. Los contornos del músculo recto abdominal fueron trazados en los cortes axiales obtenidos entre los marcadores de vitamina A cuantificando la intensidad de señal y su desviación estándar en cada caso. Las regiones de interés dibujadas fueron de un área similar entre ambos músculos. Los observadores en ningún caso conocían cuál de los colgajos fue sometido a I/R durante la intervención.
Determinaciones en tejido
Para comprobar una adecuada correlación entre la intensidad de señal en secuencias T2 con el edema muscular realizamos determinaciones histológicas.
A final de seguimiento procedimos a la eutanasia del animal con dosis altas de pentobarbital sódico intravenoso (aproximadamente 0.5 mg/Kg PV, previa inducción anestésica). Una vez comprobada la falta de signos vitales realizamos las necropsias para la obtención y evaluación de muestras.
Obtuvimos 3 muestras de tejido muscular de cada colgajo para estudio histológico y cuantificación de porcentaje de agua. El estudio histológico incluye tinción de hematoxilina-eosina y una determinación colorimétrica semicuantitativa de la actividad mieloperoxidasa (MPO).
La valoración del edema mediante porcentaje de agua se realiza tras pesado de las muestras antes y después de ser sometidas a desecación en horno a 100 °C durante 48 horas.
Análisis estadístico
Las variables continuas analizadas en este trabajo se expresan como media y desviación estándar (X ± DS). Empleamos el coeficiente de Pearson para analizar la correlación de variables cuantitativas. Analizamos los límites de concordancia entre la intensidad de señal obtenida por RM y la histología por el método de Bland Altman.
Realizamos todos los análisis estadísticos con el paquete informático SPSS Versión 11.0-15.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA).
Resultados
Obtuvimos las secuencias completas para el mapeo en 30 minutos. La medición histológica de contenido en agua fue significativamente mayor en el colgajo que sufrió el daño por isquemia / reperfusión como esperábamos. Las mediciones de los tiempos de relajación en las secuencias de T2 GraSE demostraron una intensidad de señal mayor en dichos colgajos (Fig. 3).
Las secuencias en T2 y el contenido en agua mostraron una correlación significativa (Fig. 4).
Discusión
El daño tisular a consecuencia del proceso de isquemia / reperfusión conlleva un edema tanto a nivel celular como intersticial que pone en riesgo la funcionalidad del órgano.(1,2) Tanto en cirugía de trasplantes como en procesos médicos que conllevan la reperfusión de un tejido vital en riesgo por isquemia (infarto de miocardio, ictus, embolia pulmonar), estudiar la manera de disminuir el daño tisular secundario supone uno de los ejes centrales de investigación para dichas especialidades. En nuestro campo, el daño por isquemia / reperfusión es uno de los enemigos más importantes a los que nos enfrentamos.(7) Para mejorar nuestras armas es fundamental el conocimiento exhaustivo del proceso y disponer de las herramientas necesarias para su apropiado diagnóstico y evaluación. Mediante la RM somos capaces de evaluar, en un entorno de investigación, la evolución temporal del edema causado por ese daño tisular.(9) Caracterizando dicho patrón temporal podremos evaluar de una manera objetiva diferentes tratamientos de condicionamiento tisular que puedan disminuir o llegar a evitar el daño por isquemia / reperfusión secundario a tantos de nuestros procedimientos quirúrgicos.(10)
Conclusiones
Nuestros datos demuestran una buena correlación entre el contenido en agua y las secuencias de T2. La introducción de la RM en la investigación del daño I/R nos aporta una herramienta útil para caracterizar el patrón de edema muscular tras el insulto isquémico y evaluar posibles terapias de condicionamiento.
