Influencia del rofecoxib en la carcinogénesis cólica perianastomótica inducida en ratas

J. F. Noguera Aguilar, I. Amengual Antich¹, J. M. Morón Canis², A. Plaza Martínez³, J. A. Martínez Córcoles⁴, C. Tortajada Collado⁵
y J. J. Pujol Tugores⁶

IUNICS. Unidad de Cirugía General. Hospital Son Llàtzer. Baleares. ¹Servicio de Anatomía Patológica. Fundación Hospital de Manacor.
Baleares. ²Servicio de Cirugía General. Hospital Son Dureta. Baleares. ³Servicio de Cirugía Vascular. Hospital Dr. Peset. Valencia.
⁴Servicio de Cirugía General. Hospital Son Dureta. Baleares. ⁵Enfermería. Hospital Son Dureta. Baleares. ⁶Unidad de Cirugía General.
Hospital Son Llàtzer. Baleares

 

RESUMEN

Objetivo: investigar el efecto de un inhibidor selectivo de la ciclooxigenasa-2, rofecoxib, en la incidencia de tumores cólicos perianastomóticos en un modelo de carcinogénesis farmacológica en ratas.
Diseño experimental: estudio experimental con 45 ratas Sprague-Dawley macho, asignadas aleatoriamente a uno de los tres grupos: control (n = 15), con anastomosis colo-cólica y carcinogénesis con 1-2 dimetilhidracina; rofecoxib 0,0027% (n = 15), con anastomosis cólica y carcinogénesis farmacológica y adición de rofecoxib en la dieta a dosis de 27 partes por millón, y rofecoxib 0,0058% (n = 15), con anastomosis, carcinogénesis y adición de rofecoxib en la dieta a dosis de 58 ppm. La inducción carcinogénica se realizó con 1-2 DMH a dosis semanal de 25 mg/kg de peso durante 18 semanas y se analizaron los tumores cólicos inducidos en la semana 20 del postoperatorio. El principal parámetro evaluado fue el porcentaje de tejido cólico neoplásico, que relaciona la superficie tumoral con la superficie del colon.
Resultados: el rofecoxib a dosis de 0,0058 ppm redujo significativamente la carcinogénesis cólica inducida en ratas, tanto a nivel perianastomótico como en el resto del colon (p < 0,01). A nivel extraanastomótico, el rofecoxib a dosis de 2,5 mg/kg fue significativamente superior en su efecto inhibidor al rofecoxib a dosis de 1,2 mg/kg o 0,0027 ppm (p < 0,005).
Conclusiones: el rofecoxib produce una disminución en la carcinogénesis cólica farmacológicamente inducida en ratas. Este efecto se mantiene en el área perianastomótica, por lo que puede ser interesante investigar su implicación en el cáncer colorrectal intervenido con riesgo de recidiva locorregional.

Palabras clave: Rofecoxib. Cáncer colorrectal. Rata. Adenocarcinoma. Ciclooxigenasa.

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Este trabajo ha sido financiado parcialmente por Merck-Sharp & Dohme.

 

INTRODUCCIÓN

El cáncer colorrectal (CCR) es el cáncer digestivo más frecuente en Europa Occidental y EE.UU. (1) y la segunda causa de muerte en el mundo occidental (2). Nuestro país presenta una incidencia de 20-30 casos por 100.000 habitantes y año, siendo responsable del 20% de las muertes por procesos malignos (3,4). El CCR presenta una supervivencia global del 60% a los 5 años (5).

Existen fundamentalmente dos estrategias que pueden mejorar la supervivencia de los pacientes con CCR: la detección precoz y la quimioprevención. El tratamiento precoz de las lesiones premalignas o malignas en estadio inicial, disminuye la incidencia y la mortalidad por CCR (6-8). Se han propuesto diversos agentes que podrían actuar como posibles quimiopreventivos del CCR, entre ellos fármacos como los inhibidores de la ciclooxigenasa-2 (COX-2).

La ciclooxigenasa (COX) es la enzima que cataliza los dos primeros pasos de la síntesis de prostaglandinas a partir de ácido araquidónico. Existen dos isoformas de COX, estructuralmente similares pero que actúan en lugares y momentos diferentes: la COX-1 se manifiesta siempre en todos los tejidos; mientras que la COX-2 es inducible por varios estímulos generalmente asociados con la inflamación (aguda y crónica) (9-11).

La actividad COX-2 parece estar en relación con la proliferación neoplásica en criptas aberrantes del colon, inhibiendo la apoptosis y favoreciendo la expansión tumoral mediante la inducción de la angiogénesis en el tumor (12). El hecho de que se haya encontrado sobreexpresión de COX-2 en tumores de colon lleva a pensar que los inhibidores de la COX-2 podrían servir como agentes preventivos. Múltiples estudios han logrado aislar la enzima COX-2 del estroma de los adenomas y del estroma y del epitelio de los CCR (13-15), incluso algunos autores han relacionado su expresión y la supervivencia del CCR (8,16).

Existen tres inhibidores de la COX-2, el celecoxib, el parecoxib y el rofecoxib. El rofecoxib (Vioxx^®, MK-0966), posee un mayor efecto inhibidor de la COX-2 que el celecoxib y su efecto inhibitorio sobre la COX-1 es prácticamente nulo (17), pero ha sido recientemente suspendida su comercialización.

El presente estudio pretende valorar si existe un efecto inhibidor del rofecoxib sobre la carcinogénesis a nivel perianastomótico. Como objetivo secundario se valorará si este efecto es dosis dependiente, valorando dos concentraciones del fármaco en la dieta de los animales.

Se inducirá carcinogénesis farmacológica cólica con 1-2 dimetilhidracina (1-2 DMH), que induce la formación de focos de criptas aberrantes en el epitelio cólico y promociona la carcinogénesis tras su inducción. Este epitelio displásico tiene sobreexpresión de COX-2, y su inhibición puede tener un efecto supresor sobre los tumores inducidos.

La creación de una anastomosis cólica predispone a la promoción y regeneración tisular continuada, siendo un lugar predispuesto a la formación de criptas aberrantes, displasias, adenomas y adenocarcinomas. En el presente estudio se intervendrá a los animales creando una anastomosis cólica, con el fin de dilucidar el efecto protector del rofecoxib en el desarrollo tumoral en el área perianastomótica.

MATERIAL Y MÉTODO

En el estudio se emplearon 45 ratas Sprague-Dawley macho (de Criffa, España), con un peso medio de 240 g (rango 180-300 g), distribuidas en tres grupos: control (n = 15), con creación de una anastomosis colo-cólica y carcinogénesis con 1-2 DMH; rofecoxib 0,0027% (n = 15), con anastomosis y carcinogénesis igual que en el grupo anterior y adición de rofecoxib en la dieta a dosis de 27 ppm, y rofecoxib 0,0058% (n = 15), con anastomosis, carcinogénesis y adición de rofecoxib a dosis de 58 ppm. La inducción carcinogénica se realizó con 1-2 DMH (Sigma-Aldrich, España).

Condiciones dietéticas y ambientales

Las ratas fueron alojadas en jaulas tipo III (Criffa, España). Las condiciones ambientales del estabulario fueron: periodo luz/oscuridad de 12/12 horas (luz de 8,00 a.m.- 8,00 p.m.); temperatura homogénea de 22 ± 2 ºC, y humedad relativa del 60-70%. La dieta suministrada fue dieta de mantenimiento suplementada con el fármaco MK-0966, rofecoxib, a dosis de 0,0027 y 0,0058% (Purina Lab., USA).

Se cumplieron las directrices marcadas por el Real Decreto 223/1998 y por la Directiva de la Unión Europea 86/609/CEE, sobre la protección de animales utilizados para experimentación.

Método anestésico

Se empleó una solución de ketamina, atropina y diazepam (50, 10 y 40% respectivamente), administrado a razón de 4 ml/kg por vía intramuscular.

Método quirúrgico

Se realizó laparotomía media de 3-4 cm de longitud en la parte inferior del abdomen, identificando el lugar de manipulación cólica a 4 cm del ano. Para la creación de la anastomosis colo-cólica, se procedía a la sección cólica completa con posterior sutura con material irreabsorbible de calibre 5/0 (polivinildifluoretileno, PVDF, de Lorca-Marín, España). Se colocaban ocho puntos equidistantes y se comprobaba la estanqueidad intraoperatoria de la anastomosis por vía endoanal.

Inducción carcinogénica y administración de rofecoxib

Se administraron dieciocho inyecciones subcutáneas semanales de 1-2 DMH, a una dosis semanal de 25 mg/kg de peso. El rofecoxib fue administrado por vía oral, mezclado con la dieta oral a las concentraciones mencionadas de 27 y 58 ppm.

Seguimiento y sacrificio

Los animales eran examinados semanalmente, para detectar alteraciones al tránsito digestivo y aparición de rectorragias. Todos los animales serían sacrificados en la semana 20 postoperatoria con sobredosis anestésica y el colon examinado en busca de tumores cólicos. En el sacrificio se realizó laparotomía media y el colon fue extirpado en su totalidad, desde el ano hasta el ciego incluyendo además 1 cm de intestino delgado terminal. Las piezas fueron fijadas en solución de formol al 10% para su examen histológico.

Estudio de los tumores cólicos

Se examinó el colon de cada animal determinando tres parámetros: número de tumores, superficie tumoral y porcentaje tumoral. Se separó el área perianastomótica que incluía un centímetro a cada lado de la línea anastomótica. El porcentaje tumoral se determinó relacionando la superficie global del colon y la del colon ocupado por tumor. En el estudio histológico de las piezas cólicas se determinaron el tipo histológico de cada tumoración, el grado histológico, la invasión tumoral y la afectación ganglionar.

Análisis estadístico

Los datos se analizaron con los programas SPSS y G-Stat, y el análisis estadístico se realizó con modelos Anova unifactorial (LSD y test de Bonferroni o Scheffé) y Chi cuadrado.

RESULTADOS

Mortalidad

La mortalidad global del estudio fue de 4,44% (2 animales de 45). Existió una muerte postoperatoria en el grupo control que se reemplazó por otro animal, al ser un deceso precoz, y otra en el grupo con rofecoxib 0,0058%, que no se reemplazó al ser un deceso en mitad del estudio, quedando este grupo con 14 animales evaluables.

Alteraciones al tránsito cólico

En la inspección semanal no aparecieron alteraciones al tránsito digestivo; tras el estudio histológico del colon no se halló ninguna neoplasia que fuera total o parcialmente estenosante.

Número de tumores

Se hallaron un total de 56 tumores cólicos en los 44 animales estudiados, con una media de 1,27 tumores cólicos por animal. De ellos, 49 fueron adenocarcinomas y 7 adenomas. La media de adenomas por animal fue de 0,16, mientras que la de adenocarcinomas fue de 1,11. La distribución de estos tumores se describe en la tabla I. Las diferencias entre los grupos en relación a la incidencia de tumores malignos o benignos no fueron significativas.

En cuanto a la localización de los adenocarcinomas, la mayoría asentaron en el área perianastomótica (57,14%) (Tabla II). Si relacionamos la cantidad de tumores en cada área con la superficie del colon a dicho nivel, encontramos que en el área perianastomótica asentaron 0,34 tumores /cm², mientras que en el resto del colon se hallaron 0,048 tumores/cm².

Superficie tumoral microscópica

En el conjunto de los animales se obtuvieron 22,78 cm² de superficie cólica tumoral. De estos, 0,8 cm² corresponden a tumores benignos y el resto, 21,98 cm², a adenocarcinomas. La media de la superficie tumoral fue similar en los grupos estudiados con un valor de 0,56 ± 0,52 cm² en el grupo control, 0,48 ± 0,42 en el grupo con rofecoxib a dosis baja, y 0,44 ± 0,52 cm² en el de rofecoxib a dosis alta. Considerando sólo los tumores anastomóticos la superficie fue la mitad en los grupos con rofecoxib (0,26 ± 0,23 en dosis altas y 0,22 ± 0,19 en dosis bajas) que en el grupo control (0,46 ± 0,35), si bien las diferencias no fueron significativas. En cuanto a los tumores no anastomóticos las diferencias fueron sutiles, sin diferencias significativas entre los grupos.

Porcentaje tumoral microscópico

Este parámetro es el más fiel indicador de la carcinogénesis inducida pues valora la formación de tejido glandular con adenocarcinoma ajustado al tamaño del colon de cada animal. Existían diferencias en el peso de los animales, y por tanto en el tamaño del colon, por lo que la relación entre la superficie del tumor y la del colon global es el parámetro más fiable. Así, en el grupo control la media de peso a la entrada en el estudio es de 249,6 g (rango 210-320), mientras que en el grupo con rofecoxib 0,0027% fue de 225,6 g (170-265) y en el grupo con rofecoxib 0,0058% fue de 298,7 g (250-350). Los resultados del porcentaje para los adenomas son prácticamente despreciables, pues suponen globalmente un 0,15% de la superficie cólica.

Considerando todos los adenocarcinomas cólicos inducidos, el mayor porcentaje se obtiene en el grupo control, 4,83% (4,83 ± 3,8), mientras que disminuye en el grupo con rofecoxib a dosis de 0,0027% hasta 3,53% (3,53 ± 2,6), siendo prácticamente despreciable en el grupo con rofecoxib a dosis de 0,0058%, con un valor de 0,033% (0,03 ± 0,01). Estas diferencias fueron relevantes al comparar el último grupo con los anteriores (p < 0,01 y p < 0,0001, Anova unifactorial, test LSD y Scheffé) (Fig. 1).

Si consideramos los tumores perianastomóticos, se mantienen las diferencias halladas previamente, pero sólo se consigue una reducción significativa con el rofecoxib a dosis de 0,0058% (p = 0,0056, Anova unifactorial, LSD y Scheffé). Las diferencias entre el rofecoxib a dosis de 0,0027% y 0,0058% fueron similares a las halladas en el colon global, pero no fueron significativas (p = 0,054) (Fig. 2).

Al valorar los tumores del área extraanastomótica, nos encontramos resultados similares a los hallados en el colon global. Las diferencias del grupo con rofecoxib 0,0058% son relevantes respecto al grupo control y respecto al rofecoxib 0,0027%, con porcentajes tumorales casi despreciables para el rofecoxib a dosis altas, 0,029% (0,029 ± 0,01), frente a porcentajes de 3,59 (3,59 ± 2,6) en el grupo con rofecoxib a dosis menores y de 2,68 (2,68 ± 1,5) en el grupo control. (p = 0,0043, Anova unifactorial, LSD y Scheffé) (Fig. 3).

Estudio histológico

Los adenomas (n = 7) representaron el 12,5% de los tumores inducidos, siendo el resto adenocarcinomas (87,5%). Los adenocarcinomas fueron bien diferenciados en el 26,53% de los casos, moderadamente diferenciados en 44,89% y pobremente diferenciados en el 28,58%. En cuanto al nivel de invasión en los adenocarcinomas, la mayoría alcanzaban la submucosa (57,14%), siendo invasores más allá de la submucosa en el 42,85%. Se aislaron un total de 179 ganglios epicólicos (4,06 por animal), albergando micrometástasis por adenocarcioma 14 de ellos (7,8%). Ninguna de las diferencias entre los grupos en relación a estos parámetros fue relevante.

DISCUSIÓN

La primera evidencia de la relación entre los AINE y el cáncer de colon se deriva de un estudio epidemiológico realizado por Kune en 1988 (18), observando la menor incidencia de CCR en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal consumidores crónicos de sulfasalazina.

Existen más de 100 estudios publicados que evalúan a los AINE en la quimioprevención del CCR farmacológicamente inducido en modelos animales y más del 85% de ellos demuestran que los AINE reducen la incidencia y la multiplicidad de estos tumores (19,20).

En cuanto a los inhibidores selectivos de la COX-2, la primera evidencia de su eficacia en animales se debe a estudios realizados sobre ratones Min (multiple intestinal neoplasia), con una mutación dominante del gen APC, que se caracteriza por el desarrollo de múltiples adenomas intestinales a edades tempranas (21). Sobre estos animales, la administración de celecoxib frente a piroxicam produce una disminución mayor del número de adenomas. Del mismo modo, la administración de rofecoxib produce efectos similares en estos ratones (21-23). También se han estudiado los efectos de los inhibidores selectivos de la COX-2 en ratas expuestas al azoximetano, un potente carcinógeno cólico. En estos modelos de carcinogénesis inducida farmacológicamente se redujeron los focos aberrantes de las criptas del colon en un 40-49% si se administraba celecoxib. Estudios posteriores han confirmado importantes reducciones en la incidencia de CCR y en su multiplicidad en los animales expuestos al carcinógeno y tratados con celecoxib (24,25). En la actualidad se han descrito mecanismos proapoptosis para los coxibs que son COX-independientes, por lo que la quimioprevención podría seguir dos vías, con y sin dependencia de la ciclooxigenasa.

El rofecoxib tiene una absorción oral rápida y los incrementos de dosis por encima de 5 mg/kg no se traducen en un aumento del nivel plasmático del fármaco en la rata (26). Tiene excreción biliar primaria y sus metabolitos no son activos en cuanto a la inhibición de las ciclooxigenasas 1 ó 2 (27). La dosis que se ha usado en este estudio, 0,0027 ppm y 0,0058 ppm, correspondería con dosis de 1,2 mg/kg y 2,5 mg/kg de peso. Estas concentraciones del fármaco son elevadas si las relacionamos con las dosis habituales usadas en artritis y en dolor agudo, pero según estudios clínicos de farmacocinética, la inhibición de la COX-2 es mayor a dosis más altas y la tolerancia es correcta (28). A pesar de estos ensayos clínicos, en octubre de 2004, el laboratorio MSD retiró el rofecoxib del mercado farmacéutico dada la existencia de una tasa de eventos cardiovasculares mayor a la esperada, según resultados de seguridad derivados del estudio clínico APPROVe sobre prevención de adenomas cólicos. Esta retirada es completa de momento, pero la investigación en el campo del CCR debería seguir con la inhibición de la COX-2.

Recientemente Becerra y cols. (29) han publicado un estudio en pacientes con cáncer colorrectal metastático, encontrado una falta de eficacia de la adición de rofecoxib al tratamiento quimioterápico convencional. Las dosis usadas por Becerra y cols. son de 50 mg/día, dosis que están muy lejos de las que se han demostrado eficaces en nuestro estudio experimental.

La mayoría de estudios sólo hacen referencia al número de tumores cólicos dejando de lado parámetros tan importantes como la superficie y porcentaje tumoral. Cuando no hablamos de criptas aberrantes o de focos displásicos, sino de tumores cólicos inducidos, creemos que se debe evaluar el porcentaje tumoral microscópico, dado que es el único parámetro que relaciona la cantidad de tejido tumoral con la magnitud del colon estudiado. El régimen farmacológico empleado de 25 mg/kg de 1-2 DMH durante 18 semanas con sacrificio en la semana 20, se ha mostrado más eficaz que otros regímenes inductores con el mismo fármaco (30,31), consiguiendo además acortar el tiempo de estudio.

En este estudio hemos encontrado que el rofecoxib a dosis de 2,5 mg/kg o 0,0058 ppm, reduce significativamente el porcentaje tumoral de los tumores cólicos malignos, adenocarcinomas farnacológicamente inducidos, respecto al grupo control y respecto al rofecoxib a dosis de 1,2 mg/kg o 0,0027 ppm. Este resultado coincide con los recientes estudios publicados por Oshima et al. y por Evans et al. en los que el rofecoxib inhibe la poliposis en ratones APCdelta716, que desarrollan poliposis cólica y carcinomas secundarios (23,32).

Si se consideran los tumores perianastomóticos y extraanastomóticos por separado, encontramos que el rofecoxib a dosis de 2,5 mg/kg reduce el porcentaje tumoral cólico frente al control tanto a nivel anastomótico como en el resto del colon, con diferencias estadísticamente relevantes. Las diferencias entre la inhibición de carcinogénesis inducida con rofecoxib a dosis de 1,2 mk/kg y 2,5 mg/kg son relevantes al considerar todos los adenocarcinomas de manera global y al considerar los adenocarcinomas extraanastomóticos. A nivel anastomótico la dosis mayor de rofecoxib no se mostró significativamente mejor que la dosis menor de 1,2 mg/kg (p = 0,054).

Podemos concluir que el rofecoxib a dosis de 2,5 mg/kg o 0,0058 ppm reduce significativamente la carcinogénesis cólica farmacológicamente inducida en ratas, tanto a nivel perianastomótico como en el resto del colon. A nivel extraanastomótico, el rofecoxib a dosis de 2,5 mg/kg es significativamente superior en su efecto inhibidor al rofecoxib a dosis de 1,2 mg/kg o 0,0027 ppm.

Dado que el rofecoxib produce una inhibición en la carcinogénesis cólica farmacológicamente inducida en ratas, creemos que la inhibición de la COX-2 debe ser considerada en futuros estudios relacionados con el cáncer colorrectal. Este efecto mantenido en el área perianastomótica puede tener importante implicación en el cáncer colorrectal intervenido con riesgo de recidiva locorregional. Como opinan Taxonera y cols., puede que el futuro del tratamiento y la quimioprevención del CCR resida en la asociación de fármacos, entre los que estarían los coxibs, que ejerzan de manera sinérgica un efecto antitumoral a distintos niveles (33).

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