TRABAJOS ORIGINALES

 

Estudio comparativo entre dos técnicas histológicas para el diagnóstico de infección por citomegalovirus en biopsias colorrectales de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal crónica idiopática

A comparative study of two histological techniques for the identification of cytomegalovirus infection in colorectal biopsies from patients with chronic inflammatory bowel disease

 

 

M. L. de Castro, A. Tardío¹, V. del Campo², A. Estévez¹, J. R. Pineda, F. Domínguez, J. A. Hermo and J. Clofent

Servicios de Aparato Digestivo, ¹Anatomía Patológica y ²Epidemiología. Hospital Universitario de Vigo -CHUVI

Dirección para correspondencia

 

 

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RESUMEN

Introducción: el papel que el citomegalovirus (CMV) juega en la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es controvertido. El diagnóstico de infección por CMV en estos pacientes reside en su identificación en el tejido colónico mediante hematoxilina-eosina (HE) o inmunohistoquímica (IHC). Nuestro objetivo fue comparar la sensibilidad de ambas técnicas histológicas para establecer este diagnóstico.
Pacientes y métodos: estudio caso-control, identificando en el periodo 1997-2007 aquellos pacientes CMV positivos con HE o IHQ. Sus controles fueron apareados por edad y año de diagnóstico de CMV en los casos. Se realizaron ambas técnicas en las biopsias de casos y controles obtenidas 6 meses antes y tras su inclusión en el estudio. En el análisis estadístico consideramos significativos los valores de p < 0,05.
Resultados: encontramos infección por CMV en 10 pacientes. Estos sujetos presentaban más frecuentemente una EII resistente o dependiente de esteroides (p = 0,03) y un mayor número de biopsias de colon (p = 0,03). De 97 biopsias analizadas, 12 fueron HE-negativas e IHC-positivas y 3 mostraron resultados inversos. La sensibilidad de HE fue 58,6% IC95 (38,9-78,3) y para IHQ 89,7% IC95 (76,8-100). No encontramos una buena concordancia entre ambas técnicas histológicas: kappa 0,55 IC95 (0,36-0,75). La positividad para CMV se asoció al uso de más de un fármaco inmunosupresor, OR 13,5 IC95 (1,2-152,2). El tratamiento antiviral fue útil en la EII refractaria o dependiente de esteroides.
Conclusiones: la IHQ posee una sensibilidad superior a HE (30%) para el diagnóstico de infección por CMV en la EII, no existiendo buena concordancia entre ambas técnicas histológicas.

Palabras clave: Citomegalovirus. Enfermedad inflamatoria intestinal. Colitis ulcerosa. Enfermedad de Crohn. Inmunodepresión. Diagnóstico.

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ABSTRACT

Background: the role that cytomegalovirus (CMV) plays in inflammatory bowel disease (IBD) is controversial. The diagnosis of CMV infection in IBD depends on viral identification with hematoxylin-eosin (HE) or immunohistochemistry (IHC). Our aim was to compare the sensitivity of HE and IHC for this diagnosis in IBD patients.
Patients and methods: a case-control study. Our database was searched for IBD patients with HE- or IHC-based CMV-positivity from 1997 to 2007. Controls were selected among IBD inpatients matched for age and year of diagnosis with CMV. Their clinical characteristics were analyzed. HE and IHC were performed on biopsies from cases and controls at 6 months before and after inclusion in the study. In the statistical analysis, p values below 0.05 were considered significant.
Results: ten IBD patients with CMV infection were identified. IBD-CMV patients were more steroid-resistant or steroid-dependent (p = 0.03), and underwent a higher number of colonic biopsies (p = 0.03). From 97 biopsies analyzed, 12 were HE-negative and IHC-positive, and 3 showed reversed results. The sensitivity of HE was 58.6%, 95% CI (38.9-78.3), and that of IHC was 89.7%, 95% CI (76.8-100). We did not find a good level of agreement between both techniques: kappa value 0.55, 95% CI (0.36-0.75). CMV positivity with IHC was associated with the use of more than one immunosuppressant drug, OR 13.5, 95%CI (1.2-152.2). Antiviral treatment was useful for CMV patients with steroid-dependent and steroid-refractory IBD.
Conclusions: IHC shows a 30% higher sensitivity than HE for the diagnosis of CMV infection in IBD patients. There is no good level of agreement between both histological techniques.

Key words: Cytomegalovirus infection. Inflammatory bowel disease. Ulcerative colitis. Crohn's disease. Immunohistochemistry. Diagnosis.

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Introducción

El papel que el citomegalovirus (CMV) desempeña en la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es controvertido (1). Este agente infeccioso ha sido relacionado con episodios de exacerbación de la EII, así como al desarrollo de corticorrefractariedad. No obstante, su presencia puede ser debida simplemente a una colonización previa que ha sido desenmascarada en una situación de inmunodepresión, careciendo así de trascendencia para la evolución y el pronóstico de la EII.

El diagnóstico de infección por CMV en estos pacientes reside en el empleo de la tinción convencional de hematoxilina-eosina (HE) para la identificación en el tejido colónico, de los cambios celulares típicos inducidos por el agente infeccioso, o bien mediante la técnica de inmunohistoquímica (IHQ) específica para CMV. Sin embargo, no disponemos de estudios comparativos sobre la eficacia entre estas dos técnicas. Recientemente, se ha descrito una mayor sensibilidad de la IHQ frente a HE en pacientes con brotes graves de EII (2).

Nuestro objetivo ha sido comparar la sensibilidad entre ambas técnicas histológicas para establecer el diagnostico de infección por CMV en una población de pacientes con EII, mediante un estudio caso-control.

 

Métodos

Estudio clínico

La revisión de los archivos del Servicio de Anatomía Patológica en el periodo 1997-2007, permitió identificar a aquellos pacientes con EII e infección por CMV de nuestro medio sanitario (hospital de 400 camas, que atiende a una población adulta de 150.000 habitantes). El diagnostico de EII se basó en hallazgos clínicos, endoscópicos e histológicos (3,4). La positividad histológica mediante HE o IHQ en las biopsias de colon estableció el diagnóstico de infección por CMV. Dado que no disponíamos de datos serológicos, antigenemia o cultivos de CMV de los pacientes incluidos en este estudio, estos datos no fueron analizados.

Los controles fueron seleccionados entre los pacientes que precisaron un ingreso hospitalario para el control de su EII en el mismo año en que se realizó el diagnóstico de infección por CMV en los casos, y cuyas edades diferían en menos de 5 años de estos.

Las historias clínicas de los casos y los controles fueron revisadas, identificando el tipo y la extensión de la EII, el tiempo transcurrido desde su diagnóstico y la medicación inmunosupresora recibida durante el mes previo a su ingreso y en la hospitalización. La catalogación como EII corticorrefractaria se realizó ante la ausencia de una respuesta clínica favorable tras 10 días de tratamiento esteroideo intravenoso con dosis de 1 mg/kg de peso, mientras que la corticodependencia fue establecida ante la reaparición de síntomas tras el descenso o supresión del tratamiento esteroideo.

Estudio histológico

En los pacientes con infección por CMV y en sus controles correspondientes, se revisaron las biopsias de colon realizadas durante los 6 meses previos y posteriores a la fecha de inclusión en el estudio. En todas estas muestras se realizaron ambas técnicas histológicas (HE e IHQ) sobre los cortes obtenidos de bloques parafinados, siendo examinadas por un mismo patólogo (AT).

La positividad para CMV en HE se estableció ante la presencia de cambios celulares típicos: presencia de citomegalia con evidencia de las características inclusiones intranucleares basófilas. Para determinar la existencia de CMV mediante IHQ se empleó un anticuerpo biclonal (CCH2 y DDG9; DAKO 1:25). Los cortes del tejido previamente desparafinado fueron rehidratados, tras lo que se procedió a la recuperación del antígeno con tampón citrato pH6 mediante calor y proteinasa K. A la incubación con el anticuerpo biclonal de ratón CCH2 DDG9 se le añadió posteriormente el sistema de visualización EnVision-DAKO. Como control positivo se ha utilizado tejido pulmonar con infección por CMV y como control negativo se han realizado todos los pasos descritos en el protocolo previo salvo la incubación con el anticuerpo biclonal. En todas las biopsias analizadas se valoró la existencia o no de reactividad con dicho anticuerpo.

Análisis estadístico

Los resultados se expresan empleando la media y su desviación estándar, entre paréntesis, en el caso de variables cuantitativas, o mediante su porcentaje si se trata de variables cualitativas. Para analizar las variables cuantitativas se utiliza la U de Mann Whitney, y en las cualitativas el test exacto de Fisher. El índice kappa valora la concordancia entre ambas técnicas diagnósticas. Se han considerado significativos en todos los casos aquellos valores de p < 0,05, expresando los intervalos de confianza 95% (IC95) de aquellas variables clínicamente significativas.

 

Resultados

Durante el periodo 1997-2007, 10 pacientes fueron diagnosticados de EII e infección por CMV. Se trataba de 6 varones y 4 mujeres con una edad media de 45,2 (15) años, cuyas características clínicas se recogen en la tabla I. Siete de estos pacientes presentaban una colitis ulcerosa (CU) y 3 una enfermedad de Crohn (EC), existiendo una afectación limitada al colon izquierdo en 4 sujetos y pancolónica en 6. Tres de los pacientes fueron catalogados clínicamente como corticorresistentes, 2 eran corticodependientes y en 5 casos (50%) el CMV fue hallado en las biopsias de colon realizadas durante un brote moderado de EII. En dos pacientes el diagnóstico de CMV se rea-lizó en el primer brote de EII, mientras que en los 8 restantes el tiempo medio de evolución fue de 2,1 (2) años. Dos de estos casos presentaron positividad para CMV asociado a brotes activos de EII en más de una ocasión durante el periodo de estudio (casos 2 y 3).

En el momento del diagnóstico de infección por CMV todos los pacientes estaban recibiendo corticoides por vía parenteral, en 5 casos se asociaba azatioprina y en 3 también ciclosporina A. Durante el mes previo al ingreso, el 60% de los casos habían recibido corticoides y azatioprina y un 20% infliximab (Tabla I).

No existieron diferencias entre los casos y sus controles respecto al sexo, la edad, el tipo o la extensión de la EII. No obstante, los pacientes con infección por CMV presentaban en mayor porcentaje una EII refractaria o dependiente de esteroides (p < 0,03). El tiempo medio de evolución de la EII en el grupo control era de 5 (8) años, siendo el primer brote para un 40% de estos pacientes (Tabla II). El consumo de 5-ASA oral fue mencionado por un 70% de los sujetos en cada grupo. No encontramos diferencias significativas entre ambos grupos respecto al consumo de esteroides en el mes previo a su ingreso ni al tratamiento inmunosupresor empleado en el brote agudo de EII. Sin embargo, el número de pacientes que habían recibido más de un fármaco inmunosupresor, considerando ambos periodos de tiempo, era superior en los pacientes con CMV (90%) respecto a los sujetos control (40%) p = 0,005, OR 13,5 e IC95 (1,2-152,2).

En total fueron analizadas 97 biopsias de colon mediante HE e IHQ, 64 de las cuales pertenecían a los casos y 33 a los controles. La práctica totalidad de estas muestras procedían del colon izquierdo, reflejando aquellas áreas que presentaban una mayor afectación endoscópica durante el brote activo de EII. El número medio de biopsias realizadas en los pacientes con infección por CMV era de 6,3 (3), siendo superior al que presentaban los sujetos control de 3,1 (2), p < 0,003.

Existieron resultados concordantes entre ambas técnicas histológicas en 82 de las 97 biopsias, presentando 14 muestras positividad en ambas técnicas y 68 una doble negatividad. Sin embargo, 12 biopsias de colon pertenecientes a los pacientes con CMV (19%) fueron negativas con HE y positivas para IHQ (Tabla III). Cuatro de estas muestras (19%) pertenecían al grupo de 20 biopsias realizadas durante el periodo previo al diagnóstico de infección por CMV en los casos. Posteriormente una de ellas fue reevaluada como positiva para HE al presentar inclusiones atípicas. Tres biopsias mostraron positividad en HE con negatividad para IHQ. Las 33 biopsias pertenecientes a los pacientes control mostraron negatividad para CMV mediante ambas técnicas.

Los valores de sensibilidad de ambas técnicas histológicas obtenidos respecto al total de biopsias fueron del 58,6% IC95 (38,9-78,3) para HE y de 89,7% IC95 (76,8-100) para IHQ. Por tanto, la IHQ posee una sensibilidad superior en un 30% a la de HE para establecer el diagnóstico de infección por CMV, siendo esta diferencia estadísticamente significativa (p = 0,01). La concordancia encontrada entre los resultados de ambas técnicas histológicas en el total de muestras analizadas obtuvo un valor kappa de 0,55 (IC 0,36-0,75) con p = 0,0001.

Los pacientes positivos para CMV recibieron tratamiento antiviral, en 7 casos con ganciclovir intravenoso (5 mg x kg/12 horas) y en 3 con valganciclovir oral (900 mg/12 horas). Consideramos que existió un beneficio clínico en 2 sujetos corticorresistentes (66,6%) y 2 corticodependientes (100%), al lograr la recuperación clínica y la supresión del tratamiento esteroideo respectivamente. Un paciente corticorresistente fue proctocolectomizado ante el fracaso del tratamiento. En los pacientes con brote moderado de EII, el tratamiento antiviral no varió su evolución.

 

Discusión

La infección por CMV es muy prevalente, afectando a un 40-100% de la población adulta mundial (1). Una vez adquirido, el virus permanece latente y puede reactivarse en situaciones de inmunodepresión celular (5). La relación existente entre CMV y EII no está totalmente aclarada. La gran afinidad que este virus posee por los tejidos orgánicos con inflamación activa junto a su alta seroprevalencia en pacientes con CU llevaron inicialmente a considerarlo como un mero colonizador (6-8). Sin embargo, CMV ha demostrado ser un agente patógeno en el 20-30% de los brotes graves de EII refractarios al tratamiento esteroideo (9-14). En estos pacientes, el tratamiento antiviral evita en un alto porcentaje la cirugía y disminuye la mortalidad, estando justificada la búsqueda activa de este agente infeccioso (2,15).

Actualmente, el diagnóstico de infección por CMV en los pacientes con EII reside en las técnicas histológicas, dado que otros métodos como la serología, la antigenemia, la viremia, el aislamiento viral o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en sangre o tejido intestinal no han demostrado su utilidad, al no permitir diferenciar entre una colonización latente o una infección activa donde el CMV tiene un efecto patógeno (1,5,16).

La demostración en las biopsias de colon de cambios celulares típicos mediante HE era clásicamente considerado como "gold standard" para establecer el diagnostico de infección por CMV en estos pacientes. Esta técnica posee una alta especificidad, pero su sensibilidad varía ampliamente (10-87%) dependiendo del número de biopsias analizadas y del grado de experiencia del patólogo (5,1). Así, la HE es negativa en un 20% de pacientes con colitis ulcerosa corticorresistente e infección por CMV y en el 37% de pacientes VIH con lesiones del tracto gastrointestinal causadas por este virus (2,17).

Hoy en día, la IHQ constituye la técnica diagnóstica de referencia dado que su sensibilidad en los pacientes con brotes graves de EII se ha mostrado superior a la obtenida con HE (1,2,18). Sin embargo, su valor puede disminuir si la técnica se realiza sobre biopsias de colon frente a piezas quirúrgicas (13), su superioridad sobre la HE no ha sido fehacientemente establecida en los pacientes con EII activa (13,19) y no existen estudios comparativos sobre la rentabilidad diagnóstica de ambas técnicas. Por otra parte estas se efectúan sobre distintos cortes de una misma biopsia, haciendo posible la visualización de citomegalia con inclusión en un corte y la negatividad con IHQ en el inmediatamente posterior.

Los datos aquí expuestos confirman la mayor sensibilidad de la IHQ, pudiendo esperar un 30% de resultados falsamente negativos si en la práctica clínica empleamos HE como única técnica para el diagnóstico de infección por CMV en pacientes con EII. Así mismo el porcentaje de falsos negativos se mantiene en el análisis de las biopsias previas de los pacientes con infección por CMV, lo que puede traducirse en retrasos diagnósticos. Por otra parte, los valores del índice kappa obtenidos demuestran que no existe una buena concordancia entre los resultados de ambas técnicas histológicas realizadas sobre biopsias de colon para establecer el diagnóstico de infección por CMV en pacientes con EII, al no alcanzarse cifras superiores a 0,8, lo que desaconseja la realización de una única técnica para la búsqueda de esta infección activa.

Sin embargo, la detección sistemática de CMV en los brotes activos de EII no está justificada dada su baja prevalencia (18) y el dudoso beneficio del tratamiento antivírico que se obtiene en estos casos (19-21). Nuestros resultados confirman esta idea, dado que sólo en los pacientes con EII refractaria o dependiente de esteroides se obtuvo un beneficio tras el empleo de este tratamiento.

Recientemente han sido caracterizados genotipos no patogénicos de CMV, los cuales se reactivarían frecuentemente en la EII activa y desaparecerían sin un tratamiento antivírico específico (1,20,21). Este novedoso concepto permite explicar la consideración inicial de CMV como un mero colonizador (7,8) y señala la multiplicidad de papeles que este agente puede jugar en la EII.

La infección por CMV en los pacientes con EII suele tratarse de la reactivación de un virus latente y no de una verdadera primoinfección. Estos pacientes generalmente tienen una larga evolución de la enfermedad y han sido sometidos a múltiples tratamientos inmunosupresores que favorecen la reactivación de una colonización viral anterior (5, 12,15,22). Se ha descrito una asociación entre la detección histológica de CMV y el tratamiento esteroideo previo (11,17) o recibido durante el brote activo de EII (13). Sin embargo existen evidencias en contra (10,20) y la heterogeneidad de los estudios no permite extraer conclusiones definitivas. En este trabajo hemos encontrado una asociación entre la infección por CMV en el tejido colónico detectada mediante IHQ y el empleo de más de un fármaco inmunosupresor. Consideramos que el uso en la EII de inmunosupresores más potentes y combinados puede tener resultados directos en la reactivación de virus latentes, aunque esta afirmación necesita ser confirmada mediante estudios prospectivos (23).

En resumen, la IHQ posee una mayor sensibilidad respecto a la HE para establecer el diagnóstico de infección por CMV en los pacientes con EII activa, no existiendo una buena concordancia entre ambas técnicas histológicas. El empleo de una inmunosupresión combinada se relaciona con una elevada detección por IHQ de este virus. CMV sigue jugando un papel controvertido en los pacientes con EII, ya que la repercusión de esta infección no es la misma en distintas situaciones clínicas.

 

 

Dirección para correspondencia:
María Luisa de Castro Parga.
C/ República Argentina, 10, 8º D.
36201 Vigo. Pontevedra, Spain.
e-mail: luisadecastroparga@mundo-r.com

Recibido: 17-01-09.
Aceptado: 05-06-09.

 

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