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Revista Española de Enfermedades Digestivas

versión impresa ISSN 1130-0108

Rev. esp. enferm. dig. vol.104 no.3 Madrid mar. 2012

http://dx.doi.org/10.4321/S1130-01082012000300002 

TRABAJOS ORIGINALES

 

Metilación de p16 en pacientes intervenidos de cáncer colorrectal tras un largo periodo de seguimiento

p16 gene methylation in colorectal cancer patients with long-term follow-up

 

 

Silvia Veganzones de Castro1, Sara Rafael Fernández1, Marta Vidaurreta Lázaro1, Virginia de la Orden1, Beatriz Mediero Valeros1, Cristina Fernández2 y María Luisa Maestro de las Casas1

1Unidad de Genómica, Análisis Clínicos. 2Unidad de Investigación. Hospital Clínico San Carlos. Madrid

Dirección para correspondencia

 

 


RESUMEN

Introducción: el gen p16 está implicado en la regulación del ciclo celular y se considera un importante gen supresor de tumores.
Objetivos: se han descrito diferentes mecanismos de inactivación génica, en este estudio nos hemos centrado en la metilación del promotor del gen p16. En el cáncer colorrectal la metilación de p16 es una alteración frecuente.
Material y métodos: se incluyeron 326 pacientes con cáncer colorrectal esporádico. El ADN se extrajo de muestras tumorales obtenidas durante la cirugía. La metilación del promotor se analizó mediante un proceso de modificación con bisulfito y posterior PCR cuantitativa especifica para metilación. Se analizó la frecuencia de la metilación de p16 y se comparó con las variables clinicopatológicas.
Resultados: la metilación del gen p16 se detectó en el 24,8% de los pacientes. La metilación de p16 se relacionó con el grado de diferenciación y con la localización tumoral: la metilación fue mas frecuente en los tumores pobremente diferenciados y tuvo una baja frecuencia en el colon distal. La metilación del promotor de p16 discrimina un subgrupo de pacientes con mejor pronóstico en los tumores pobremente diferenciados.
Conclusiones: la metilación de p16 es un evento frecuente en nuestra población y es capaz de inducir diferencias en la supervivencia global de los pacientes con tumores moderadamente diferenciados.

Palabras clave: Gen p16. Mutilación. Cáncer colorrectal. Pronóstico.


ABSTRACT

Introduction: p16 gene plays an important role in the cell cycle regulation and is considered an important tumor suppressor gene. Several mechanisms of gene inactivation have been described; in this study we have focused on p16 gene promoter methylation. In colorectal cancer p16 gene methylation is a frequent event.
Methods: 326 patients with sporadic colorectal cancer were included. DNA was extracted from tumor tissue samples obtained during the surgical procedure. Promoter methylation was analyzed using bisulfite modification and was detected by quantitative methylation-specific PCR. Frequency of p16 methylation was analyzed and compared with other clinicopathological variables.
Results: p16 gene methylation was detected in 24,8% of patients. Methylation was associated with differentiation grade and with tumor location: methylation was frequent in poorly differentiated tumors and had low frequency in distal colon. The p16 promoter methylation discriminated a subgroup of patients with better prognosis in poorly differentiated tumors.
Conclusions: p16 methylation was a frequent event in our population and was able to induce differences in the overall survival of patients with poorly differentiated tumors.

Key words: p16 gene. Methylation. Colorectal cancer. Prognosis.


 

Introducción

Se han realizado grandes esfuerzos para intentar predecir el pronóstico de los pacientes con cáncer colorrectal (1-3). Las investigaciones se han dirigido hacia el conocimiento de los mecanismos genéticos implicados en el desarrollo de la tumorogénesis del cáncer colorrectal. El gen p16INK4a actúa como un gen supresor asociado a la tumorogénesis cuando se produce su inactivación (4). La inactivación de este gen ocurre con mucha frecuencia por metilación de la región promotora. Aún no esta claro el papel de la metilación de p16 en el pronóstico de los pacientes con cáncer colorrectal.

El gen p16 es también conocido como CDKN2, MTS1, INK4a y CDK4I. p16 y está implicado en el control del ciclo celular, actuando como un gen supresor de tumores (4). Este gen está localizado en la región 9p21, comprende 3 exones y codifica para una proteína de 16 kDa. p16 inhibe el complejo ciclina quinasa D1-CDK4/6, responsable de la fosforilación de la proteína Rb, causando la parada del ciclo celular en la fase G1 (5).

Las alteraciones en la región 9p21 son frecuentes en diferentes tumores en humanos (6). Se han descrito diferentes mecanismos de inactivación del gen p16: deleción, metilación del promotor y mutaciones puntuales, pero estas alteraciones dependen del tipo de tumor (7). Las mutaciones en p16 son una alteración poco frecuente en los tumores humanos y una de las causas más frecuentes de inactivación del gen es la pérdida de heterocigosidad en 9p21 (8).

Las regiones de dinucleótidos CG localizadas en la región promotora son llamadas islas CpG. Estas regiones son zonas específicas de metilación y constituyen un importante mecanismo de regulación de la transcripción (9,10). La metilación de la región promotora juega un importante papel en el silenciamiento de los genes supresores de tumores y otros genes implicados en la tumorogénesis. La metilación de novo en la región promotora CpG de los genes p16, CDH1, MGMT y APC ha sido descrita en aproximadamente un 30% de tumores colorrectales (11-14).

El objetivo de nuestro estudio fue determinar la prevalencia y analizar la relevancia en el pronóstico de la metilación del promotor del gen p16 usando una PCR cuantitativa específica de metilación (qMSP) en una amplia cohorte de pacientes operados de cáncer colorrectal (CCR) con un largo seguimiento.

 

Pacientes y métodos

Obtención de las muestras y extracción del ADN

Nuestra cohorte de pacientes se compuso de 326 pacientes operados consecutivamente en el Hospital Clínico San Carlos de Madrid entre 1995 y 2000. Se trata de un estudio de cohortes prospectivo. Todos los pacientes fueron intervenidos por el mismo cirujano, que realizó una cirugía radical oncológica en función de la localización del tumor. La cirugía se definió como curativa cuando no se observó tumor macroscópico residual después de la resección. De acuerdo con este criterio, en 269 pacientes (82,5%) se realizó cirugía curativa y en 57 pacientes (17,5%) la cirugía fue paliativa. Fueron excluidos de este estudio los pacientes con tumores metacrónicos, poliposis familiar, enfermedad inflamatoria intestinal y aquellos que cumplían los criterios de poliposis familiar no hereditaria. Ninguno de los pacientes incluidos habían recibido terapia neoadyuvante. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética e Investigación Clínica del hospital y todos los pacientes firmaron consentimiento informado previo a su inclusión. El seguimiento clínico de los pacientes fue realizado de acuerdo con el protocolo diseñado en nuestro hospital (15). El estadiaje de los tumores se realizó de acuerdo con la clasificación de Dukes. Se definieron como proximales los tumores localizados entre el ciego y el colon transverso y como distales los localizados entre la flexura esplénica el inicio del recto. Los pacientes con tumores en estadios B y C recibieron tratamiento adyuvante con 5-Fluoracilo y leucovorin (75% de los pacientes fueron incluidos). Los pacientes en estadios D fueron tratados de acuerdo con distintos protocolos en función de los criterios del Servicio de Oncología.

La muestras tumorales y no tumorales fueron obtenidas durante la cirugía y fueron sumergidas inmediatamente en Nitrógeno líquido para su posterior almacenaje a -80 oC. Todas las muestras fueron analizadas de forma independiente por dos patólogos para verificar la presencia de más del 80% de células tumorales.

El ADN para los análisis posteriores, fue extraído de la muestras de tejido empleando el kit DNeasy® Blood & Tissue (Qiagen, Hilden, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante.

qMSP

Un µg de AND genómico fue sometido a modificación con bisulfito empleando el kit Epitect Bisulfito (Qiagen, Hilden, Alemania). El ADN tratado con bisulfito fue amplificando utilizando la técnica qMSP, que se realizó en un termociclador a tiempo real (Smart Cycler, CEPHEID). La calidad de las muestras de ADN y la eficiencia de la reacción fueron comprobadas empleando como referencia interna el gen de diferenciación miogénica 1(MYOD). También se seleccionó una región de islas CpG sin metilación como control de la reacción amplificación, independiente del estado de metilación. La relación entre el valor de Ct del gen objeto del estudio y el valor del gen control interno, MYOD, fue utilizado para medir el nivel de metilación relativa (RML = Ct p16/Ct MYOD), como había sido descrito anteriormente (16-18). La reacción de amplificación se realizó en un volumen final de 25 µl usando el kit QuantiTect Probe PCR (Qiagen, Hilden, Alemania). Se utilizó 1 µl de AND modificado con bisulfito, 10 pmol de cada cebador y 5 pmol de cada sonda específica. Los cebadores usados para esta reacción fueron: 5'-TGGAGTTTTCGGTTGATTGGTT-3' (p16 sentido), 5'-TCCTCCACGCCCGCAACAA-3' (p16 antisentido), 5'-CGCCAAGCCCCAGCCCA-3'(sonda p16), 5'-GGATTTATATTTATGTGGTGGGTGG-3'(MYOD sentido), 5'-TATCTCTCCCCTAAACCTCAACC-3'(MYOD antisentido) y 5'-TAGGGGATAGAGGGAGGTGTTTAGGTTG-3'(sonda MYOD). Los cebadores y las sondas elegidas para la amplificación de p16 incluyen 7 islas CpG y 9 puntos para la detección de la modificación con bisulfito (9 citosinas no incluidas en islas CpG). Las islas CpG discriminan el estado de metilación del gen. En cada reacción de amplificación se incluyeron un control negativo para metilación (leucocitos de hombres sanos) y un control positivo (CpGenomeTM Universal Methylated DNA [Chemicon]) (Fig. 1). El punto de corte RML en este estudio se fijó en 1.0 para la metilación de p16. Se analizaron muestras no tumorales pertenecientes a 30 pacientes con metilación en la muestra tumoral y en ningún caso se encontró metilación para p16.

 

Análisis estadístico

Las variables cualitativas se presentan con su distribución de frecuencias. Las variables cuantitativas se resumen en su media, desviación estándar (DE) y rango. Se evaluó la asociación entre variables cualitativas con el test de χ2 y, en el caso de que más de un 25% de los esperados fuera menor de 5, por la prueba exacta de Fisher.

Se estimaron las funciones de supervivencia global (SG) y de la supervivencia libre de enfermedad (SLE) por el método de Kaplan-Meier, y se compararon las funciones de supervivencia de los distintos grupos mediante el test exacto de Breslow. Se incluye como definición del evento en la SG aquellos fallecimientos producidos como consecuencia del tumor y quedando censurados los pacientes vivos y fallecidos por otra causa. La SG fue calculada como el tiempo transcurrido entre la fecha de la cirugía y la del éxitus o última revisión. En la SLE se define el evento como el diagnóstico de una recidiva locorregional o a distancia en pacientes previamente libres de enfermedad, es decir, en solo en aquellos en los que se realizó cirugía curativa. La SLE fue calculada como el tiempo transcurrido entre la fecha de la cirugía y la del diagnóstico de la primera recidiva. Se ajustó un modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox. En todos los contrastes de hipótesis se rechazó la hipótesis nula con un error de tipo I menor a 0,05. El paquete informático utilizado para el análisis fue SSPS para Windows versión 11.5.

 

Resultados

De los 326 pacientes incluidos en el estudio, el 53,4% fueron hombres y el 46,6% mujeres y la media de edad fue de 71 ± 10,83 años (35-95 años). La edad se estratificó en función de la mediana. La tabla I muestra las frecuencias de las variables clinicopatológicas de la población. El 62,9% de los tumores se localizaron en el colon y el 37,1% en el recto. El 8,6% de los tumores fueron adenocarcinomas mucoides. En 34 pacientes no pudo determinarse el grado de diferenciación.

En 8 pacientes no pudo analizarse el estado de la metilación de p16. La metilación fue positiva en el 24,8% de las muestras (79/318). En el análisis de p16 y las variables clinicopatológicas (Tabla I), se encontró relación estadísticamente significativa entre la metilación de p16 y el grado de diferenciación (p = 0,04). En los tumores pobremente diferenciados la frecuencia de la metilación de p16 fue mayor que en los moderadamente diferenciados y que en los bien diferenciados (24,6 y 21,7% respectivamente). También se encontró relación entre la metilación de p16 y la localización tumoral (p = 0,02). La frecuencia de la metilación fue menor en los tumores localizados en colon distal (16%) que en los localizados en colon proximal o recto (32,4 y 25,9%, respectivamente). No se observó relación significativa con el resto de las variables.

 

 

Evolución postoperatoria. Supervivencia global

La mediana de seguimiento fue de 92 meses, con un rango intercuartilico de 75 a 111 meses. La tasa de SG en nuestra población de estudio en ese periodo de tiempo fue del 63%. Todos los análisis de supervivencia fueron referidos a la mediana de seguimiento. Durante el seguimiento murieron 142 pacientes, de los cuales 106 fueron a consecuencia del tumor y en un paciente no se pudo realizar el seguimiento. Los resultados del análisis univariable de la SG se muestran en la tabla II.

No se observaron diferencias en la SG en relación con el estado de metilación de p16, la supervivencia a las 92 meses en los pacientes que mostraron metilación de p16 fue del 62,6% y en los pacientes sin esta alteración fue del 64% (Hazard ratio (HR) = 0,91; intervalo de confianza (IC 95% = 0,58-1,42). En el análisis estratificado de la SG, en función de los factores pronóstico clásicos, el sexo mostró diferencias significativas (Tabla III). Los hombres con metilación en p16 tuvieron una menor SG que las mujeres (50,2 vs. 63,6%; p = 0,04). En el mismo análisis, se encontró una tendencia con efecto negativo en la SG en relación con el grado de diferenciación. En los pacientes con tumores en grado II, la SG fue del 43,8% para aquellos con metilación en p16 y del 59,2% para los pacientes sin metilación en el gen (p = 0,06) (Fig. 2). En el análisis multivariable no se encontraron resultados estadísticamente significativos par ala metilación de p16, el estadio de Dukes fue el único factor pronóstico independiente. Se realizó un análisis exploratorio y el HR ajustado para la ausencia de metilación de p16 fue 0,88 (IC 95% = 0,56-1,39).

 

Evolución postoperatoria. Supervivencia libre de enfermedad

La tasa de SLE en la población estudiada fue del 71,6%. Durante el seguimiento se detectó recurrencia del tumor 69 pacientes. La recurrencia fue locoregional en 14 pacientes (20%) y a distancia en 49 pacientes (80%). Los resultados del análisis univariable de la SLE se muestran en la tabla II.

En los pacientes con p16 metilado la SLE fue del 78,2 y del 70,3% en aquellos que no la tenían (p = 0,3). El análisis estratificado de la SLE se realizó en función de los factores pronóstico clásicos para la predicción de recurrencia de pacientes con cáncer colorrectal (Tabla III). Solo se observó un efecto significativo en el grado de diferenciación. Los tumores pobremente diferenciados mostraron un 0% de recurrencia cuando tenían metilación de p16, mientras que en ausencia de metilación la recurrencia fue del 100% (p = 0,005) (Fig. 3). En el análisis multivariable para la SLE el efecto de la metilación de p16 no actúa como factor pronostico independiente.

Discusión

El CCR es la segunda causa de muerte asociada a cáncer en EE. UU. y Europa (19). Es una de las neoplasias en las que están mejor caracterizados los mecanismos genéticos implicados en la tumorogénesis, uno de los más frecuentes es la metilación del ADN (20). La metilación del promotor provoca el silenciamiento de genes supresores de tumores en un elevado número de tumores (21,22). p16 actúa como regulador negativo del ciclo celular, actuando como supresor de tumores (23).

Los estudios previos realizados en p16 no mostraron un tamaño poblacional amplio con un periodo de seguimiento tan largo y en una cohorte homogénea y sin tratamiento previo (24-29). Los únicos estudios que presentaron poblaciones mayores que la nuestra con análisis del pronóstico; bien presentaron menor mediana de tiempo de seguimiento (23); bien se trataron de estudios multicéntricos que presentan mayor variabilidad debido a las diferencias en el análisis en diferentes laboratorios y en el manejo clínico de los pacientes y también debido a la inclusión de pacientes con antecedentes familiares (25). En este trabajo se analizó la frecuencia de metilación en el promotor de p16 en una cohorte de 326 pacientes con CCR esporádico. Las frecuencias de metilación descritas en CCR mostraron mucha variabilidad con un rango entre 18 y 61% (30-36) Esta variabilidad podría ser explicada por el uso de diferentes métodos para la detección de la metilación. Nuestro grupo determinó previamente la metilación de p16 empleando PCR convencional, con un 18,3% de resultados positivos (33). Sin embargo, con la tecnología empleada en este estudio (qMSP), se aumentó el porcentaje de resultados positivos hasta el 24,8%. El empleo de qMSP permite obtener resultados cuantitativos y una mayor sensibilidad, incluso en muestras con cantidades reducidas de ADN, esta técnica es capaz de detectar la metilación presente en el 0,1% de los alelos en una región conocida de islas CpG (37).

La metilación del promotor de p16 es un evento frecuente en pacientes con CCR. En la literatura previa existen discrepancias en cuanto a la relación de la metilación de p16 con las variables clinicopatológicas. Aunque algunos autores no encontraron ninguna asociación de p16 con ninguna de las variables (28-38), otros sí encontraron algunas relaciones significativas: con estadio de Dukes e invasión linfáticas (35); y con edad, sexo, localización del tumor, grado de diferenciación y tipo histológico (36). La metilación del promotor de p16 en nuestra cohorte se relacionó con los tumores pobremente diferenciados y con localización proximal. Shima y cols. también detectaron mayor frecuencia de metilación de p16 en tumores pobremente diferenciados y en los tumores proximales (25). Previamente, algunos autores habían descrito un aumento de metilación en tumores con alta inestabilidad de microsatélites (MSI-H), que se localizan con elevada frecuencia en tumores proximales (39). El estado de MSI no se incluyó en nuestro estudio, pero podría estar implicado en las diferencias en la frecuencia de metilación en función de la localización. La pérdida de función de p16, frecuentemente asociada a la metilación del promotor, está relacionada con la pobre diferenciación en otras patologías (40-41). Esta ausencia de expresión provoca la desregulación del ciclo celular y favorece el proceso de desdiferenciación.

El perfil de metilación de la célula y la metilación específica del gen p16 han sido asociados con la edad, pero en nuestra cohorte, esta relación aparece solo como tendencia (25-42). Otros autores no detectaron asociación de p16 con la edad, lo que concuerda con la ausencia de metilación detectada en la muestras de mucosa normal analizadas (43).

Algunos estudios muestran el análisis de la metilación de p16 con la supervivencia de los pacientes con CCR (25,26,28,29). En los estudios que analizan pronóstico es importante trabajar con poblaciones homogéneas y con seguimiento prolongado para aumentar el valor de la información obtenida (la mediana de seguimiento en nuestro estudio fue de 92 meses). Aunque la metilación de p16 no se relacionó con pronóstico en algunos trabajos, otros autores sí asociaron la presencia de mutilación de p16 con la reducción en la SG (25,28). En este trabajo no se detectó un efecto significativo de p16 en el pronóstico. Sin embargo, cuando se realizó el análisis multivariable, se observó un efecto negativo en la SG que no pudo ser demostrado debido al tamaño poblacional. Shima y cols. demostraron en su análisis multivariable la asociación de la presencia de metilación en p16 con una disminución de la SG (25).

No se encontraron diferencias en la SLE en función del estado de metilación de p16. Algunos han observado menor SLE asociada a metilación (29). Sin embargo, en el grupo de tumores pobremente diferenciados (grado III), la presencia de p16 mostró efecto protector en la SLE: ninguno de los pacientes de este grupo con metilación tuvo recidiva. La influencia de p16 en este subgrupo de pacientes no ha sido analizada por otros autores. El efecto protector de p16 en el pronóstico había sido descrito previamente en tumores gástricos (29).

En conclusión, la metilación de p16 es un evento frecuente en nuestra cohorte e induce diferencias en la SLE de los pacientes con tumores pobremente diferenciados. Sin embargo, son necesarios estudios adicionales, con un tamaño de población mayor, para verificar su efecto en nuestra población.

 

 

Dirección para correspondencia:
M.a Luisa Maestro de las Casas.
Departamento de Análisis Clínicos.
Hospital Clínico San Carlos.
C/ Martín Lagos, s/n.
28040 Madrid.
e-mail: mmaestro.hcsc@salud.madrid.org

Recibido: 31-05-2011.
Aceptado: 21-10-2011.

 

 

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