TRABAJOS ORIGINALES

 

Polimorfismos de IL-10 y TNF-α en sujetos con síndrome de intestino irritable en México

IL-10 and TNF-α polymorphisms in subjects with irritable bowel syndrome in Mexico

 

 

Max Schmulson¹, Daniela Pulido-London¹, Óscar Rodríguez¹, Norma Morales-Rochlin¹, Rosalinda Martínez-García¹, María Concepción Gutiérrez-Ruiz², Juan Carlos López-Alvarenga³ y Gabriela Gutiérrez-Reyes¹

¹Laboratorio de Hígado, Páncreas y Motilidad (HIPAM). Departamento de Medicina Experimental. Facultad de Medicina. Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Hospital General de México. México.
²Universidad Autónoma Metropolitana (UAM)-Iztapalapa. México.
³Centro de Bioestadística. Departamento de Investigación Clínica. Hospital General de México. México

Estudio financiado por el fondo de investigación PAPIIT, IN-211107 de DGAPA, UNAM. Óscar Rodríguez-Fandiño recibió la beca No. 336205 del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) de México.

Conflicto de interés: En los últimos 2 años, Max Schmulson ha recibido fondos de investigación de Nestlé Ltd. y Nycomed/Takeda México. Ha sido miembro del Consejo Asesor de Alfa Wasserman y ha sido consultante para Almirall, Janssen y Nestlé Ltd. Ha sido ponente para Alfa Wasserman, Janssen y Takeda México. Juan Carlos López-Alvarenga ha servido como Biométrico para Takeda México. Los demás autores no tienen nada que declarar.

Declaraciones: Este estudio fue presentado como trabajo de ingreso a la Academia Nacional de Medicina de México, por el Dr. Max Schmulson en 2012.

Dirección para correspondencia

 

 

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RESUMEN

Antecedentes: evidencias recientes han mostrado una alteración en la regulación inmune en el síndrome de intestino irritable (SII) así como variaciones en los polimorfismos de citocinas.
Objetivos: determinar la frecuencia de polimorfismos IL-10 (-1082G/A) y TNF-α (-308G/A) en sujetos con SII en México.
Métodos: sujetos voluntarios contestaron el Cuestionario de Roma II y fueron clasificados como SII (n = 45) y controles (n = 92). Aquellos con SII fueron a su vez clasificados en SII-D: 22,2 %, SII-E: 28,9 % y SII-A/M: 48,9 %. Se comparó la frecuencia de los polimorfismos entre los grupos.
Resultados: no hubo diferencias entre SII vs. controles en la frecuencia del genotipo alto (8,9 vs. 18,5 %), intermedio (60,0 vs. 57,6 %) y bajo productor (23,9 vs. 38,9 %) de IL-10, p = 0,315. Tampoco en alto (0 vs. 1,1 %), intermedio (55,4 vs. 43,2 %) o bajo productor (43,5 vs. 56,8 %) de TNF-α, p = 0,296. Sin embargo, el bajo productor de IL-10 fue más frecuente en SII-D vs. SII-E vs. SII-A/M (63,6 vs. 7,1 vs. 33,3 %) p = 0,023.
Conclusiones: en este grupo de voluntarios en México la frecuencia de genotipos de IL-10 (-1082G/A) y TNF-α (-308G/A) fue similar en SII y controles, pero aquellos con SII-D presentaron mayor frecuencia del bajo productor de IL-10 sugiriendo una predisposición genética a una regulación inmune anormal dada por un menor componente antiinflamatorio en este subgrupo.

Palabras clave: Síndrome de intestino irritable. Genotipos. Interleucinas. IL-10. TNF-α. Diarrea. Estreñimiento. Inmunorregulación. México.

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ABSTRACT

Background: there has been recent evidence of an alteration in irritable bowel syndrome (IBS) immune regulation, as well as variations in cytokine polymorphisms.
Aims: to determine the frequency of the IL-10 (-1082G/A) and TNF-α (-308G/A) polymorphisms in subjects with IBS in Mexico.
Methods: volunteers answered the Rome II Questionnaire and were classified as IBS (n = 45) and controls (n = 92). The IBS subjects were then categorized as IBS-D: 22.2 %, IBS-C: 28.9 %, and IBS-A/M: 48.9 %. The polymorphism frequency among groups was compared.
Results: there were no differences between IBS vs. controls in the frequency of the high (8.9 vs. 18.5 %), intermediate (60.0 vs. 57.6 %), or low (23.9 vs. 38.9 %) producer IL-10 genotypes, p = 0.315. Neither were there differences in the high (0 vs. 1.1 %), intermediate (55.4 vs. 43.2 %), or Low (43.5 vs. 56.8 %) producer TNF-α genotypes, p = 0.296. However the low producer of IL-10 was more frequent in IBS-D vs. IBS-C vs. IBS-A/M (63.6 vs. 7.1 vs. 33,3 %) p = 0.023.
Conclusions: in this group of volunteers in Mexico, the frequency of the IL-10 (-1082G/A) and TNF-α (-308G/A) genotypes was similar in IBS and controls. However, there was a greater frequency of the low producer of IL-10 in those subjects with IBS-D, suggesting a genetic predisposition to abnormal immune regulation due to a lower anti-inflammatory component in this subgroup.

Key words: Irritable bowel syndrome. Genotypes. Interleukins. IL-10. TNF-α. Diarrhea. Constipation. Immunoregulation. Mexico.

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Introducción

La fisiopatología del síndrome de intestino irritable (SII) no se conoce a ciencia cierta. Se han propuesto varios mecanismos como alteraciones en la motilidad intestinal, sensibilidad visceral, alteraciones en la comunicación bidireccional entre el cerebro y el intestino, estrés y factores psicológicos (1-3). Más recientemente se ha descrito que un grupo de pacientes desarrolla SII posterior a una infección gastrointestinal, lo cual se conoce como SII-post infeccioso (SII-PI) (4) pero también se han demostrado diferencias en la microbiota en adultos y niños con SII en comparación con controles sanos (5,6). Por otra parte, en un subgrupo de pacientes con SII se ha reportado la presencia de inflamación de bajo grado en la mucosa colónica, la cual consiste en un aumento en el número de linfocitos intraepiteliales, células cebadas y/o células enterocromafines (7,8). Además, esta inflamación de bajo grado parece estar relacionada principalmente con el SII-PI (9).

Otras alteraciones en la regulación inmune que han sido reportadas en SII incluyen menores niveles de interleucina-10 (IL-10) en suero y mayores niveles de citocinas pro-inflamatorias como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) (10). Por ejemplo, en México, nosotros hemos reportado muy recientemente en voluntarios con SII de acuerdo con los criterios diagnósticos de Roma II (10), que la presencia de menores niveles de IL-10 en suero es un factor predictor de SII, especialmente en mujeres con SII con predominio de diarrea (SII-D). Adicionalmente encontramos mayores niveles séricos de TNF-α en sujetos con SII en comparación con los controles (10). Asimismo, datos recientes han encontrado una asociación entre el SII y genes relacionados con la respuesta inmune (11-13). En este sentido, las citocinas son candidatas óptimas para estudios genéticos en SII ya que su expresión está regulada genéticamente (14). La predisposición para producir niveles altos o bajos de una determinada citocina pudiera estar en relación con la presencia de los polimorfismos que codifican la expresión del gen de cada una de ellas, como se ha sugerido para la citocina inmunorreguladora IL-10 y la pro-inflamatoria TNF-α (15,16). Estos polimorfismos pudieran entonces afectar la susceptibilidad para desarrollar SII así como su expresión fenotípica (SII-D, SII con predominio de estreñimiento: SII-E; alternante/mixto: SII-A/M), al menos en un subgrupo de pacientes en quienes la activación inmune sería un factor putativo. Sin embargo, de acuerdo con una reciente revisión sistemática de la literatura, los datos sobre las variantes genéticas de las citocinas en SII y controles son inconsistentes (17). Por otra parte, hasta el momento no se ha llevado a cabo ningún estudio en Latinoamérica sobre polimorfismos en SII (18).

Por lo anterior, nuestro objetivo fue explorar la frecuencia de los polimorfismos de IL-10 en un grupo de voluntarios de la ciudad de México con SII y controles. Nuestra hipótesis fue que, en comparación con los controles, los sujetos con SII debían presentar mayor frecuencia del polimorfismo bajo productor de IL-10 y mayor frecuencia del polimorfismo alto productor de TNF-α.

 

Métodos

Sujetos

El presente es un estudio en voluntarios de una universidad del sur-oriente de la Ciudad de México (Universidad Autónoma Metropolitana: UAM-Iztapalapa) que participaron en un estudio epidemiológico y serológico sobre trastornos funcionales gastrointestinales (TFGI) (19). Los voluntarios fueron invitados mediante convocatoria escrita a través de carteles colocados en diferentes lugares de la universidad. El único criterio de inclusión para el estudio epidemiológico era la edad mayor de 18 años, independientemente de su actividad dentro de la universidad, es decir, estudiantes, personal docente o administrativo o personal de servicios generales. No se realizó ningún estudio para excluir enfermedad celiaca o intolerancia a la lactosa, enfermedad inflamatoria intestinal o colitis microscópica, sobre el antecedente de infección gastrointestinal que pudiera desencadenar SII ni sobre ningún otro factor desencadenante del SII. De igual forma, no se investigó sobre el uso de cualquier tratamiento farmacológico incluyendo medicamentos que pudieran afectar la motilidad o antiinflamatorios no esteroideos. El estudio solo se enfocó en determinar la frecuencia de los TFGI.

Cuestionario modular de Roma II en español en México

Todos los sujetos contestaron el Cuestionario Modular de Roma II que ha sido previamente traducido al español en México y validado en ese país (19). Los sujetos que reunieron criterios para SII y los controles negativos para TFGI fueron invitados a participar en el presente estudio de polimorfismos de IL-10 y TNF-α. Además, aquellos con SII fueron a su vez divididos en subtipos de SII de acuerdo con el hábito intestinal predominante en SII-D, SII-E, mientras que los sujetos que no cumplieron criterios para SII-D o SII-E fueron considerados como SII-A/M.

Determinación de polimorfismos

En los sujetos que firmaron consentimiento informado para participar en el estudio de genotipos, se colectó una muestra de sangre venosa. El DNA leucocitario fue extraído mediante la técnica de precipitación por exceso de sales utilizando el kit de aislamiento genómico de BDTract (Maxim Biotech Inc). La genotipificación de las citocinas fue realizada mediante el sistema de amplificación de dos brazos (ARMS). Los polimorfismos de las regiones promotoras de IL-10 en la posición -1082*G y - 1082*A, y de TNF-α en la posición -308*G y -308*A, fueron analizados por la reacción de polimerasa en cadena (PCR) utilizando oligonucleótidos específicos para identificar los alelos alto y bajo productor de cada sitio polimórfico bi-alélico. Los productos amplificados del DNA fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 2 % y revelados con bromuro de etidio. El gel se visualizó bajo transiluminación con luz ultravioleta (UV), con un marcador de peso molecular de 100 pares de bases (bp) y fueron fotografiados. Los genotipos se expresaron como alto o bajo productor para los homocigotos e intermedio productor para los heterocigotos (20). Es de anotar que la genotipificación se realizó de manera ciega sin conocer las características clínicas de los pacientes, es decir, si se trataba de sujetos con SII o controles.

El protocolo fue aprobado por el Comité de Investigación de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Todos los sujetos firmaron un consentimiento informado.

Análisis estadístico

Las variables continuas fueron expresadas en media y las categóricas en porcentajes e IC 95 %. La distribución genotípica entre casos y controles se comparó mediante la Chi cuadrada de Pearson. Además se determinó el equilibrio de Hardy-Weinberg para los casos y controles de acuerdo con el sitio http://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl.

El presente estudio fue exploratorio y por lo tanto no se determinó a priori un tamaño muestral ya que no se conocía la frecuencia de los alelos ni genotipos estudiados en población mexicana o latinoamericana. Por otra parte, la prevalencia de alelos en una población es una variable cuya esperanza matemática se debe calcular como de tipo aleatorio. En el presente estudio esta variable se utilizó para clasificar a los grupos de sujetos, por lo que se realizó un análisis de tipo pseudo-experimental. Considerando que la diferencia entre alelos para un fenotipo en particular varía, entonces el poder estadístico post hoc también varía de acuerdo con las diferencias fenotípicas encontradas. Con base en lo anterior, los valores para una prueba Z de dos colas para obtener diferencias de proporciones corresponden a los siguientes valores de poder estadístico: diferencias de 0,15, 0,20, 0,25, 0,30 corresponden a un poder estadístico post hoc de 60, 83, 95, 99 %, respectivamente. Considerando diferencias mayores del 20 % en las frecuencias fenotípicas entre los sujetos con SII y controles en nuestro estudio (por ejemplo: frecuencia del dolor o malestar abdominal o características del hábito intestinal), el presente estudio tiene un poder estadístico post hoc mayor del 83 %.

 

Resultados

Ciento treinta y siete voluntarios participaron en el estudio. De ellos, 45 cumplieron criterios para SII y 92 se consideraron como controles. En la tabla I se muestra las características epidemiológicas y clínicas de los grupos. No hubo diferencias en la edad, género e índice de masa corporal (IMC) entre los sujetos con SII y controles. En cuanto a los sujetos con SII, estos fueron a su vez clasificados como SII-D: 22,2 %, SII-E: 28,9 % y SII-A/M: 48,9 %. Tampoco se encontraron diferencias en la edad, distribución por género e IMC entre los sujetos de acuerdo con los subgrupos de SII. Por otra parte, en cuanto a los síntomas intestinales investigados en el Cuestionario Modular de Roma II, como era de esperarse, el dolor y malestar abdominal fueron más frecuentes en los sujetos con SII en comparación con los controles. Asimismo, la presencia de evacuaciones sueltas, esfuerzo excesivo para evacuar, sensación de evacuación incompleta, moco en las evacuaciones y la sensación de llenura, inflamación o hinchazón abdominal también fueron más frecuentes en los sujetos con SII. En cuanto a los subtipos del SII, no hubo diferencia en la frecuencia del dolor o malestar abdominal, sin embargo, aquellos con SII-D presentaron con mayor frecuencia más de 3 evacuaciones al día, evacuaciones sueltas o líquidas y urgencia para evacuar, mientras que aquellos con SII-E presentaron con mayor frecuencia evacuaciones duras y esfuerzo excesivo para evacuar (Tabla I).

 

La frecuencia de los genotipos de IL-10 (-1082G/A) se encontró en equilibrio de Hardy Weinberg tanto para los casos como para los controles (Tabla II), sin embargo la frecuencia de los genotipos de TNF-α (-308G/A) se encontró en desequilibrio (Tabla III).

 

La mayoría de los sujetos con SII y los controles presentaron predominantemente polimorfismo intermedio productor de IL-10 seguido del bajo productor y no se encontraron diferencias en la frecuencia genotípica ni alélica entre los grupos (Tabla II). En cuanto al TNF-α, prácticamente no se encontró genotipo alto productor en toda la población de estudio, solo un sujeto control presentó esta variante y tampoco se encontraron diferencias entre SII y controles (Tabla III).

Al comparar la frecuencia de los genotipos de IL-10 entre los subgrupos SII-D vs. SII-E vs. SII A/M, se encontraron diferencias significativas. En SII-D predominó el genotipo bajo productor mientras que en SII-E y SII-A/M predominó el genotipo intermedio productor (p = 0,023) (Fig. 1). En contraste, no se encontraron diferencias en la frecuencia de genotipos de TNF-α entre los subgrupos de SII (p = 0,146). Ninguno de los sujetos con SII presentó el genotipo alto productor de TNF-α (Fig. 1).

 

 

Discusión

En el presente estudio en voluntarios en México, no encontramos diferencias en la frecuencia de genotipos ni de los alelos de los polimorfismos de IL-10 (-1082G/A) y TNF-α (-308G/A) entre los sujetos que llenaron criterios de Roma II para SII en comparación con los controles sin criterios para este trastorno funcional gastrointestinal. Además, el polimorfismo alto productor de TNF-α (AA) se encontró prácticamente ausente en esta población. Al analizar dichos polimorfismos entre los subgrupos de SII, el bajo productor de IL-10 (AA) fue significativamente más frecuente en aquellos con SII-D mientras que el intermedio productor fue significativamente más frecuente en los sujetos con SII-E. No hubo diferencias en los genotipos de TNF-α entre los subgrupos de SII de nuestra población de voluntarios.

Debido a que la producción de citocinas está determinada genéticamente, sus respectivos polimorfismos pueden ser diferentes entre sujetos con SII y controles sin criterios para este trastorno (14), pero los resultados al respecto no han sido conclusivos. Un estudio previo llevado a cabo en Turquía reportó menor frecuencia del genotipo alto productor de IL-10 en la posición -1082 en pacientes con SII en comparación con los controles (15). Estos hallazgos sugerían una predisposición genética a una alteración en la regulación inmune en aquellos con SII. En contraste, no se encontraron diferencias en estos polimorfismos entre SII y controles en estudios de Holanda (16), Corea del Sur (21), China (22), y la India (23).

Por otra parte, en Holanda, el intermedio productor del polimorfismo TNF-α en la posición -308 fue más frecuente en SII (16), mientras que no se encontraron diferencias en los polimorfismos de TNF-α en SII vs. controles en los estudios de Corea del Sur (21), y la India (23).

En nuestro estudio en voluntarios de la ciudad de México, no observamos diferencias en la prevalencia de los genotipos de IL-10 (-1082G/A) y TNF-α (-308G/A) entre SII y controles, similar a lo reportado en los estudios previos de países asiáticos. Esta falta de diferencias se puede deber a variaciones poblacionales propiamente dichas o al tamaño de nuestra muestra que no permite llegar a una conclusión cierta. Sin embargo, con respecto a este último factor consideramos que nuestra muestra de estudio es representativa de dicha población universitaria, ya que la frecuencia de SII del 34,7 % es similar al 35,5 % previamente encontrada en esa comunidad (19). A pesar de no haber encontrado diferencias en los polimorfismos estudiados entre los sujetos con SII y controles, interesantemente sí observamos diferencias significativas en SII-D en comparación con los otros subgrupos de SII, con una mayor frecuencia en el polimorfismo bajo productor de IL-10 en ese subgrupo. Estos hallazgos, que son sugestivos de una predisposición genética a una alteración en la regulación inmune en los sujetos con SII-D, son acordes con otros datos de la literatura. Por ejemplo, recientemente nosotros hemos encontrado en la misma población en México que la presencia de bajos niveles séricos de IL-10 es un factor predictivo independiente del SII (10). Más aún, las mujeres con SII-D presentaron los niveles más bajos de IL-10 en comparación con aquellas con SII-E y SII-A/M. Otros datos en la literatura también sugieren alteraciones en la regulación inmune especialmente en SII-D. Por ejemplo, se han reportado mayores niveles de IL-10 derivada de células mononucleares de sangre periférica en SII-D en comparación con controles, si bien no se reportaron diferencias al compararlos con los otros subgrupos, es decir SII-E o SII-A/M (24). También se han encontrado otros factores tales como un aumento en las proteasas de serina en heces fecales en SII-D en comparación con SII-E y SII-A/M (25). Estas proteasas pueden desencadenar un aumento en la permeabilidad celular, la cual también se ha encontrado en asociación con un aumento en la frecuencia de las evacuaciones (26) así como con el mismo SII-D (27). Si bien nuestros hallazgos son compatibles con una predisposición genética para producir menores niveles de la citocina antiinflamatoria IL-10 en sujetos con SII-D, el diseño de nuestro estudio no permite determinar si la mayor frecuencia del genotipo bajo productor de IL-10 se traduciría en menores niveles de esta citocina en suero, menor expresión en la mucosa colónica o en una predisposición a la inflamación de bajo grado en la mucosa colónica como ha sido descrita en pacientes con SII. En el primer estudio realizado en Estados Unidos en este aspecto, Chang y cols. evaluaron tanto citocinas séricas como su expresión a nivel de la mucosa colónica, encontrando solo una menor expresión del mRNA de IL-10 en la mucosa sin diferencias en la celularidad de la misma, ni en los niveles séricos de las citocinas (28). Por lo anterior, la relación de las alteraciones en la regulación inmune dadas por las citocinas séricas y la inflamación de bajo grado en la mucosa colónica está aún por determinarse (8).

En cuanto al polimorfismo TNF-α (-308G/A), más de la mitad de los sujetos de nuestra población presentó el genotipo intermedio productor, lo cual constituye una frecuencia mayor que lo encontrado en caucásicos y en asiáticos (16,18,29). En contraste, encontramos una muy baja frecuencia del polimorfismo alto productor de TNF-α tanto en SII como en controles y no encontramos diferencias en la frecuencia de los alelos A y G, similar a lo reportado por Barkhordari en Irán (29). La baja frecuencia del alto productor de TNF-α (-308A) también ha sido descrita en estudios en población general (30). Además, la presencia del alelo alto productor en la posición -308A se ha relacionado con una mayor producción de TNF-α inducida por lipopolisacáridos bacterianos (LPS) en células mononucleares periféricas de sujetos con enfermedad inflamatoria intestinal (31), y parece estar relacionado con una menor respuesta al tratamiento con agentes anti-TNF en enfermedades reumatológicas (32). Sin embargo, a diferencia de las anteriores enfermedades, el SII no representa una verdadera enfermedad inflamatoria y es probable que ello explique nuestra baja frecuencia del alto productor tanto en SII como en controles. Finalmente, debemos mencionar la desviación del equilibrio de Hardy Weinberg encontrada para los genotipos de TNF-α tanto en nuestros voluntarios con SII como en los controles. Este hallazgo puede estar en relación con el cruce genético que ocurre en poblaciones mestizas y que constituyen la mayoría en México (33,34).

Nuestro estudio tiene ciertas limitaciones. En primer lugar, el pequeño tamaño de la muestra puede ser la causa de no haber encontrado diferencias en los polimorfismos de IL-10 y TNF-α entre sujetos con SII y controles, sin embargo esto no resultó en una restricción para las diferencias observadas entre los subgrupos con SII que fueron aún menores. Además obtuvimos un buen poder estadístico post hoc. En todo caso, se requiere de estudios poblacionales de gran tamaño en nuestro país para confirmar nuestros hallazgos. En segundo lugar, tampoco determinamos diferencias entre sujetos con SII-PI y sin antecedentes de infecciones gastrointestinales como factor desencadenante del SII, sin embargo es de anotar que la frecuencia de SII-PI es muy baja en México (35). Tampoco descartamos la presencia de enfermedad celíaca ni de enfermedad inflamatoria intestinal en estos sujetos, lo cual pudo haber modificado la frecuencia de los polimorfismos estudiados, pero nuestro estudio tiene la fortaleza de haber sido realizado en sujetos de la comunidad y no en pacientes y de ser el primer estudio genético en población latinoamericana. Finalmente, no correlacionamos nuestros hallazgos de los polimorfismos con los niveles séricos de las citocinas respectivas, ni con la expresión de las mismas en la mucosa colónica para determinar el papel de los polimorfismos estudiados sobre estas citocinas y sobre la regulación inmune a nivel colónico, órgano blanco del SII.

En conclusión, en este grupo de voluntarios en México no se encontraron diferencias en la frecuencia de genotipos de IL-10 (-1082G/A) y TNF-α (-308G/A). Sin embargo, los sujetos con SII-D presentaron mayor frecuencia del genotipo bajo productor de IL-10, sugiriendo una predisposición genética a una regulación inmune anormal dada por un menor componente antiinflamatorio en este subgrupo. Se requiere de estudios poblacionales a gran escala para confirmar nuestros hallazgos.

 

 

Dirección para correspondencia:
Max Schmulson.
Laboratorio de Hígado,
Páncreas y Motilidad (HIPAM).
Departamento de Medicina Experimental.
Facultad de Medicina.
Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM).
Hospital General de México.
Dr. Balmis #148. Col. Doctores.
C.P. 06726 México D.F. México
e-mail: maxjulio@prodigy.net.mx

Recibido: 05-03-2013
Aceptado: 19-08-2013

 

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