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Anales del Sistema Sanitario de Navarra

versión impresa ISSN 1137-6627

Anales Sis San Navarra vol.26 no.3 Pamplona dic. 2003

NOTAS INFORMATIVAS/RESÚMENES DE PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN CONCEDIDOS POR EL DPTO. SALUD

Análisis de la apoptosis miocárdica y sus marcadores en pacientes con hipertensión arterial

M. A. Fortuño, A. González, B. López, J. Díez

Fundamento. La insuficiencia cardíaca es una complicación tardía y grave de la cardiopatía hipertensiva, y su incidencia y prevalencia en la población adulta de los países civilizados aumenta progresivamente debido fundamentalmente al envejecimiento de la población. El origen de la disfunción cardíaca se encuentra en la alteración estructural de la pared del miocardio, sometido crónicamente a una sobrecarga hemodinámica y a numerosas modificaciones neurohumorales que acontecen en la hipertensión arterial. Las alteraciones celulares que caracterizan el remodelado del miocardio son: la hipertrofia de las células contráctiles (cardiomiocitos), la expansión del componente intersticial, el insuficiente desarrollo del lecho vascular, y en los últimos años se ha sugerido que la disminución del número de cardiomiocitos por un aumento de muerte apoptótica podría ser el cuarto componente. Así, trabajos realizados en modelos experimentales de hipertensión arterial indican que la apoptosis de las células del miocardio puede jugar un papel importante en el remodelado patológico del corazón, contribuyendo a la pérdida de la función cardíaca. De hecho, en la insuficiencia cardíaca humana sí se ha demostrado un importante aumento de apoptosis miocárdica, pero no se conoce si el proceso se inicia en fases tempranas de afectación cardíaca hipertensiva. El objetivo del presente trabajo fue valorar la apoptosis miocárdica en pacientes hipertensos con afectación cardíaca sub-clínica, antes y después de recibir dos tratamientos antihipertensivos, y analizar posibles marcadores de fácil acceso asociados a la apoptosis miocárdica.

Material y métodos

Sujetos. Se analizaron biopsias endomiocárdicas obtenidas de un total de 31 pacientes con hipertensión arterial esencial y afectación cardíaca incipiente (hipertrofia ventricular izquierda y/o disfunción diastólica). Los pacientes se distribuyeron de forma aleatoria en dos grupos de tratamiento antihipertensivo: losartán (50 mg/día) y amlodipino (10 mg/día). Tras 12 meses de tratamiento se repitieron todos los estudios. La selección previa, la completa información sobre el estudio, el tratamiento, el seguimiento y la toma de muestras se realizó en la Policlínica Guipúzcoa de San Sebastián. En los estudios tras tratamiento pudieron incluirse 28 pacientes. Como grupo control para los estudios histológicos se emplearon 8 muestras cardíacas seleccionadas de un total de 100 autopsias realizadas en la Clínica Universitaria de Pamplona y que correspondían a sujetos fallecidos de accidente, sin historia clínica de hipertensión y sin signos anatómicos de cardiopatía isquémica. Para los estudios de genotipado se emplearon muestras sanguíneas de 28 donantes voluntarios sanos.

Determinaciones. Los parámetros clínicos, bioquímicos y ecocardiográficos se determinaron por los procedimientos habituales. Los índices apoptóticos miocárdicos se determinaron mediante la técnica del TUNEL analizada en un microscopio de fluorescencia por dos observadores distintos. La detección de proteínas implicadas en la apoptosis se realizó mediante inmunocitoquímica en cortes de tejido y mediante Western Blot en extractos de tejido congelado. Para los estudios de genotipado se pusieron a punto tres métodos de detección de polimorfismos, uno para cada uno de los genes estudiados. Una vez obtenidas las muestras de ADN a partir de células sanguíneas, se realizó en cada una de ellas una PCR con dos pares de cebadores para detectar el polimorfismo I/D de la ECA; un análisis de restricción para el gen del receptor AT1, y una PCR con dos cebadores sentido para el gen del TGF-b.

Resultados

Hallazgos basales

El índice apoptótico se encontraba significativamente aumentado (P<0,001) en los pacientes hipertensos (2.428 ± 346 núcleos apoptóticos/106) comparados con los sujetos normotensos (59 ± 29 núcleos apoptóticos/106). El análisis individual de los datos reveló que un subgrupo de 5 pacientes presentaba unos valores de apoptosis mayores de 5000 núcleos apoptóticos/106, (5237 ± 944 núcleos apoptóticos/106), mientras que los otros 26 no superaban los 4.000 núcleos apoptóticos/106. El análisis de los dos subgrupos de pacientes en términos de características demográficas, clínicas, bioquímicas y de afectación cardíaca no detectó ninguna diferencia significativa entre ambos, debida en parte a la diferencia en los tamaños muestrales. El genotipado de los pacientes demostró que la distribución de haplotipos en la población hipertensa era similar a la del grupo control. Cuando se estudió el índice apoptótico de los pacientes hipertensos agrupados por genotipos no se encontraron diferencias significativas en ninguno de los genes estudiados. Sin embargo, se detectó una tendencia de asociación entre el genotipo homocigoto para el alelo I del gen de la ECA y un mayor índice apoptótico, no alcanzándose significación estadística probablemente por el limitado número de pacientes.

Hallazgos tras tratamiento

La administración de losartán disminuyó significativamente (p<0,01) el índice apoptótico miocárdico, tanto el de cardiomiocitos como el de células intersticiales, que eran mayoritariamente fibroblastos. El tratamiento con amlodipino no modificó el índice apoptótico miocárdico. Los estudios de genotipado revelaron que ninguno de los polimorfismos estudiados se asocia con una mayor o menor susceptibilidad al tratamiento.

Conclusión. Los resultados de este trabajo confirman que la apoptosis miocárdica está aumentada en pacientes hipertensos con afectación cardíaca incipiente en fase sub-clínica, y que a igualdad de eficacia hemodinámica, el tratamiento con losartán corrige parcialmente esta anomalía mientras que el calcio antagonista amlodipino no ejerce ningún efecto sobre la apoptosis miocárdica. Por lo tanto se confirma la hipótesis sobre la implicación de la muerte apoptótica de cardiomiocitos en la patología cardíaca hipertensiva, y también se demuestra por primera vez que esta anomalía se puede corregir farmacológicamente.

Análisis de polimorfismos genéticos en los genes de la histamina 2,
receptores y transportadores de serotonina en pacientes afectos de
esquizofrenia y su relación con la respuesta al tratamiento
antipsicótico

A. Patiño¹, F. Ortuño², L. Gárate¹, P. Molero²
1. Departamento de Pediatría. Facultad de Medicina. Universidad de Navarra. Pamplona.
2. Departamento de Psiquiatría. Clínica Universitaria de Navarra. Pamplona.

Fundamento. Las hipótesis planteadas en este estudio son dos: la presencia de determinados polimorfismos genéticos son más prevalentes en la esquizofrenia que dichos polimorfismos pueden condicionar la respuesta al tratamiento antipsicótico en pacientes esquizofrénicos.

Los objetivos del paciente son: determinar los polimorfismos genéticos de los genes receptores 2A y 2C de serotonina y transportador de serotonina, en una población de aproximadamente 100 pacientes afectos de esquizofrenia y en 100 individuos sanos; comparar la distribución de los haplotipos y genotipos para estos marcadores con las poblaciones caracterizadas hasta la fecha y contrastar las hipótesis formuladas por otros grupos; correlacionar la presencia de una determinada identidad genética con la respuesta al tratamiento con fármacos antipsicóticos. Es decir, intentar predecir la respuesta al tratamiento en función del genotipo individual y correlacionar los datos genéticos obtenidos con las características clínicas del paciente.

Material y métodos

Pacientes y controles

Se ha obtenido DNA de sangre periférica de pacientes psiquiátricos afectos de esquizofrenia (n=90) según los criterios de investigación de la Clasificación Internacional de Enfermedades (CIE-10) y el Manual Diagnóstico y Estadístico de los Trastornos Mentales (DSM-IV), así como de controles sanos (n=163) del mismo rango de edad y distribución de sexos.

La inclusión en el estudio requirió el previo consentimiento informado de los participantes. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de la Clínica Universitaria de Navarra.

Se llevó a cabo una entrevista estructurada para los trastornos del eje I del DSM-IV (SCID-I). Igualmente en cada caso se efectuó una evaluación de la escala para el síndrome positivo y negativo de la esquizofrenia (PANSS), y de la escala de evaluación de la actividad global (EEAG) del DSM-IV.

Análisis de los polimorfismos en los genes de interés

Se amplifica, mediante Polymerase Chain Reaction (PCR), la región de ADN que contenga el marcador de interés en cada uno de los genes. Tras la amplificación, las muestras se someten a digestión con la endonucleasa de restricción adecuada, siguiendo las indicaciones del proveedor, y las bandas se visualizan después de someterlas a electroforesis en geles de poliacrilamida o de agarosa y a tinción con bromuro de etidio los marcadores analizados y las condiciones de análisis. Se exponen en la tabla 1.

Análisis estadísticos
Se aplican los test estadísticos adecuados mediante la utilización del software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS 10.0).

Resultados

1) Descripción de las variables clínicas de la serie. En nuestra serie la media de edad al diagnóstico era de 36 años (19; 74) y 65% eran varones y 35% mujeres. En cuanto al origen étnico de los pacientes, en 16,7% de los casos pudimos establecer origen vasco (8 apellidos) frente a 83,3% de origen no vasco.

La historia familiar de diagnóstico psiquiátrico o fenomenológico, pudo ser establecida como positiva en el 38,3% de los familiares de primer grado de nuestros pacientes. El cuadro clínico que presentaban dichos familiares era de un espectro clínico muy variado e incluía: cuadros afectivos, depresión, enfermedad de Azheimer, esquizofrenia paranoide o no, suicidio, rastorno depresivo y otros cuadros psicóticos no especificados.

La mayoría de los pacientes (85%) recibieron tratamiento con antipsicóticos atípicos (clozapina, risperidona, olanzapina, quetiapina, ziprasidona) y sólo el 15% recibieron tratamiento exclusivamente mediante antipsicóticos típicos (haloperidol, trifluoperazina, tioridazina) a lo largo del primer año.

2) Estudio de los polimorfismos de los genes VDR, COL Ia 1 y ER. En algunos de los marcadores, la frecuencia de genotipos y alelos no difería entre los pacientes esquizofrénicos y los controles en nuestra serie. Sin embargo, se encontraron asociaciones relevantes entre los polimorfismos del gen transportador de serotonina (5-HTT) y el desarrollo de la patología, así como desequilibrios en la frecuencia de los polimorfismos Ser9Gly (gen DRD3) y Cys23Ser (5-HT2C).

3) Relación entre polimorfismos y respuesta al tratamiento. Actualmente estamos realizando una segunda valoración evolutiva de los pacientes incluidos en el estudio tras dos años de tratamiento continuado, en la que se vuelve a evaluar la respuesta a los tratamientos mediante la PANSS y la escala EEAG.

En ella tratamos de relacionar la presencia de polimorfismos del gen transportador de la serotonina y de los desequilibrios en la frecuencia de polimorfismos y la reducción en las escalas mencionadas.

Conclusiones. En los pacientes con esquizofrenia se han encontrado asociaciones relevantes entre los polimorfismos del gen transportador de serotonina (5-HTT) y el desarrollo de la patología, así como desequilibrios en la frecuencia de los polimorfismos Ser9Gly (gen DRD3) y Cys23Ser (5-HT2C).

Al término de recolección de datos evolutivos estudiaremos la relación entre los mismos y la respuesta al tratamiento.

Estudio in vivo e in vitro de factores implicados en la coagulación de metaloproteinasas e inhibidores, endostatina, angiogenina y PDGF.
Valoración de la eficacia del tratamiento con antitrombina III en un
modelo del melanoma animal

P. Redondo, A. Bauzá, S. Inogés, P. Lloret, J. M. Aramendía, M. Idoate
Departamento de Dermatología. Clínica Universitaria. Pamplona.

Fundamento. Las metaloproteinasas de matriz (MMPs) constituyen un grupo familiar de enzimas que, de forma soluble o unidas al receptor celular, degradan diversas estructuras proteínicas, jugando un papel importante en el remodelamiento de la matriz extracelular.

En algunos tumores se ha demostrado una mayor invasión y metástasis asociadas, con incrementos de MMP-2 y MMP-9, aunque en el melanoma su papel, todavía no ha sido suficientemente estudiado, permanece controvertido.

Este trabajo pretende clarificar, mediante inmunohistoquímica en melanomas primarios y determinación de niveles plasmáticos en pacientes con melanoma en diferentes estadios, el papel de la MMP-2 y 9 en el diagnóstico y comportamiento clínico del melanoma.

Material y métodos

Estudio mediante inmunohistoquímica de 8 melanomas in situ; 8 melanomas <0,75 mm; 14 melanomas entre 0,75 y 1,5 mm; 13 melanomas entre 1,5 y 3 mm; 13 melanomas >3 mm y 7 metástasis cutáneas de melanoma.

Determinaciones plasmáticas con kits de ELISA en pacientes con melanoma primario previo a la extirpación (estadio I) (n=5); estadio II (n=5); estadio III (n=9); estadio IV (n=10) y pacientes sanos control (n=10).

Cultivo celular in vitro de melanoma humano (metástasis subcutánea), línea de melanoma de ratón B16F10 y melanocitos humanos normales.

Irradiación de B16F10 y melanocitos basales con ultravioleta B.

Resultados. En general la tinción con MMP-2 es negativa en melanomas de Breslow bajo y melanomas de buen pronóstico (Tabla 1). De 39 pacientes con melanoma primario que no desarrollaron metástasis con un seguimiento mínimo de 3 años (teórico buen pronóstico), 29 (70,5%) fueron negativos para MMP-2. De los 17 pacientes con melanoma primario que desarrollaron metástasis antes de los 3 años, 8 (47%) fueron negativos para MMP-2. Curiosamente, en las 7 metástasis de melanoma la tinción para MMP-2 fue negativa.

Prácticamente en todos los melanomas primarios la tinción para MMP-9 fue positiva. Al contrario que con la MMP-2, en todas las metástasis de melanoma la tinción con MMP-9 fue positiva.

En las determinaciones plasmáticas realizadas no encontramos ninguna diferencia significativa en los valores de MMP-9 entre los pacientes con melanoma en diferentes estadios y entre éstos y el grupo control. Sí apreciamos unos valores de MMP-2 aumentados en pacientes en estadio IV (333,6 ng/ml; rango: 220-462) respecto al grupo control (261,3 ng/ml; rango:120-496) (P=0,05) y al del melanoma primario (263,6 ng/ml; rango: 142-492) (Fig. 1). Aunque el tamaño de la muestra es reducido para sacar conclusiones al respecto, sí que parece suficiente para subrayar la ausencia de diferencias en los valores plasmáticos de MMP-9 en pacientes con melanoma en diferentes estadios.

El sobrenadante de la línea celular de melanoma cultivada en laboratorio presentó niveles de MMP-2 de 82 ng/ml y de MMP-9 de 84 ng/ml.

En la línea de melanoma de ratón B16F10 y en los melanocitos humanos, la determinación de MMPs en el sobrenadante mediante ELISA fue negativa, tanto en condiciones basales como tras estímulo con radiación ultravioleta B.

Conclusiones. El melanoma es un tumor altamente invasivo y con gran capacidad metastásica. Las MMPs y sus inhibidores tisulares juegan un rol importante en la degradación de la membrana basal y matriz extracelular, en la migración de células de melanoma y en los procesos de invasión y metastatización. La positividad para MMP-2 en melanoma primario se correlaciona por posteriores metástasis hemáticas. Este dato sugiere que la expresión de MMP-2 podría ser un factor esencial para la progresión del melanoma, algo parecido a lo que ocurre con la expresión de VEGF. Como apreciamos en la tabla 1, la expresión tanto de MMP-2 como de VEGF fue positiva de forma mayoritaria en 9 y 12 de 14 melanomas gruesos respectivamente, que evolutivamente desarrollaron metástasis. En 8 pacientes coincidió una positividad marcada para ambas proteínas. Estos datos, no referidos con anterioridad en la literatura, sugieren una posible asociación de ambos marcadores en el proceso invasivo del melanoma, digna de ser corroborada en series más amplias.

Diversos estudios muestran tinción negativa para MMP-2 en nevus pigmentocelulares normales sin atipia y melanomas in situ, y en cambio valores positivos en melanomas primarios y metastásicos. También la expresión de MMP-2 activada se correlaciona con un aumento de la malignidad en un modelo de xenotrasplante humano de melanoma. En nuestra serie de 39 pacientes con teórico buen pronóstico, el 70,5% de los melanomas fue negativo para MMP-2 frente a sólo el 47% de los 17 melanomas que desarrollaron metástasis antes de los tres años de seguimiento. Aunque con pequeñas divergencias, existe cierto consenso con otras series analizadas respecto al papel de la MMP-2 en la progresión del melanoma. Quizá el dato más curioso de nuestro trabajo es la ausencia de positividad para esta MMP en todas las metástasis cutáneas estudiadas.

Respecto al valor pronóstico en los valores plasmáticos de MMPs en procesos oncológicos, existe una amplia discordancia. Nadie duda de la escasa sensibilidad y baja especificidad diagnósticas, ya que estas enzimas pueden estar aumentadas en multitud de procesos fisiológicos, y por tanto no ser específicas de procesos tumorales. En concreto, en melanoma sólo hay dos trabajos que miden niveles plasmáticos de MMP-2. Uno de ellos, sobre 50 pacientes con melanoma metastásico sometidos a quimioterapia, demuestra que la MMP-2 no es marcador pronóstico en este grupo de enfermos. En otro trabajo que incluye a 166 pacientes con melanoma, se observa un aumento de la MMP-2 en aquéllos con enfermedad avanzada. En nuestro estudio, no encontramos ninguna diferencia entre los valores de MMP-9 en los diferentes grupos. En cambio, sí que apreciamos unos niveles aumentados de MMP-2 en pacientes con enfermedad metastásica respecto al grupo control y a los pacientes con melanoma primario. Debido a la falta de sensibilidad y especificidad, las determinaciones circulantes MMP-2 y MMP-9 no pueden considerarse marcadores tumorales en el manejo de pacientes con melanoma.

Caracterización molecular de Listeria monocytogenes aislada de
alimentos. Implicaciones sanitarias y pautas de prevención de riesgos

I. García-Jalón, V. Aguado, I. Dorronsoro, A.I. Vitas, B. Sesma
Departamento Microbiología. Universidad de Navarra.
Servicio de Microbiología. Hospital de Navarra.

Fundamento. Listeria monocytogenes es una bacteria patógena para humanos y animales transmitida principalmente por vía alimentaria. Aunque la población sana, en general, es poco susceptible a contraer la enfermedad, existen grupos de riesgo (inmunodeprimidos, embarazadas y neonatos, ancianos) en los que la tasa de mortalidad se eleva al 25-30%. Su frecuente presencia en alimentos se debe a la gran ubicuidad del microorganismo y a su capacidad de sobrevivir y crecer en líneas de procesado y a bajas temperaturas. Estudios realizados en el laboratorio acerca de la incidencia del patógeno en muestras de alimentos obtenidos en el mercado navarro, arrojaron valores del 0,9 al 36,1% en función del tipo de producto estudiado. La valoración sanitaria de esta realidad necesita ser considerada junto a diversos factores como son: si el alimento está listo para consumir o por el contrario requiere un proceso térmico antes de consumo; características del alimento como sustrato para el crecimiento de L. monocytogenes; condiciones de conservación y tiempo de caducidad; y por último el nivel de contaminación. Es significativo el hecho de que los brotes con mayor trascendencia se hayan producido en países con alto nivel sanitario en materia de alimentos y en productos que podrían considerarse seguros para consumo, como quesos, patés y cárnicos cocidos. En Navarra, hasta el momento no se ha declarado oficialmente ningún brote de listeriosis, aunque sí se ha aislado el agente a partir de muestras clínicas pertenecientes a casos esporádicos, hecho que contrasta con la elevada incidencia de L. monocytogenes en alimentos procedentes del mercado navarro.

Esta realidad sugiere la conveniencia de caracterizar las cepas aisladas con el fin de detectar clones idénticos y las posibles vías de transmisión. En el presente trabajo se han caracterizado cepas de L. monocytogenes aisladas de alimentos y de casos clínicos mediante las técnicas moleculares de REA y RAPD.

Material y métodos. Se han subtipado 405 cepas de L. monocytogenes aisladas de muestras de alimentos, ambientales y de pacientes afectados de listeriosis en Navarra y en regiones colindantes mediante: serotipado; análisis de restricción enzimática (REA) y amplificación del DNA, empleando cebadores al azar (RAPD).

Para la realización del serotipado se utilizaron antisueros específicos comerciales (Denka Seiken CO., LTD., Tokyo, Japón) anti-O y anti-H, siguiendo las instrucciones del fabricante.

En el REA se empleó Cfo I como enzima de restricción. Los fragmentos de DNA, separados por electroforesis, se estudiaron comparando las bandas comprendidas entre las 23,1 y 3,1 Kb. Una única diferencia en el patrón de restricción bastaba para considerar diferentes los subtipos.

En el RAPD se emplearon tres cebadores en otras tantas reacciones de amplificación: HLWL74 (5-ACGTATCTGC-3) y HLWL85 (5-ACAACTGCTC-3) que habían mostrado una gran capacidad de discriminación en estudios previos. La amplificación se llevó a cabo en un termociclador Perkin Elmer, separándose los fragmentos amplificados por electroforesis en gel de agarosa. Los subtipos de RAPD se determinaron a partir de los patrones combinados, resultantes del análisis de cada cepa con los tres cebadores.

La relación de similitud entre patrones se obtuvo aplicando el coeficiente de Dice para la obtención de una matriz de similitud y el método de agrupamiento UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Averages), mediante el programa Gel Compar (Applied Maths, Kortrijk, Belgium).

Resultados. Las cepas analizadas pertenecían a 7 serotipos. En los aislamientos de muestras clínicas predominó el serotipo 4b (69,4%), seguido del 1/2 b (16,6%) y del 1/2 a (11,1%), mientras que en los que procedían de alimentos el serotipo mayoritario fue el 1/2 a (42%), correspondiendo a otros serotipos los valores siguientes: 4b (21,5%); 1/2 c (20,5%) y 1/2 b (14,8%). Al serotipo 3b pertenecían dos cepas aisladas de una muestra clínica y de otra alimentaria.

Las técnicas moleculares discriminaron mediante REA y RAPD 100 y 73 subtipos respectivamente. No todos los perfiles obtenidos eran igualmente numerosos; así, mientras unos estaban integrados por una sola cepa otros agruparon hasta 35. El hecho de encontrar tan alta diversidad de clones de L. monocytogenes, que ya había sido considerada por otros autores, y dado que la mayoría de las muestras analizadas provinieran de productos tomados en el punto de venta, no ha sido posible establecer correlaciones entre una determinada cepa y su procedencia. Esto es debido a que las cepas aisladas podrían proceder tanto del alimento en el primer estadío de la producción, como de contaminaciones ocurridas a lo largo de la cadena alimentaria.

No obstante, el estudio del origen de cepas pertenecientes a determinados subtipos ha permitido establecer relaciones epidemiológicas. En este sentido el subtipado de tres cepas clínicas, ha hecho posible demostrar la conexión entre tres casos que afectaron a una mujer y a su hijo recién nacido, además de a otro niño ingresado en la misma fecha en la unidad de neonatos. La comprobación de que las 3 cepas tenían el mismo perfil molecular de REA y RAPD sugiere una infección nosocomial.

Así mismo, en los análisis de muestras de salmón ahumado de 6 marcas comerciales se aislaron 23 cepas (Tabla 1), de las que 20 pertenecían al mismo subtipo de RAPD y a tres subtipos de REA de alta similitud (>85%) y proximidad genética (Fig. 1). El hecho de que los aislamientos procedieran de marcas diferentes, procesadas en intervalos de tiempo alejados, señala a los criaderos de salmones como el origen de estos clones.

La caracterización molecular ha servido por último para detectar la existencia de contaminaciones cruzadas durante el loncheado de productos de charcutería cocida en puntos de venta, al haberse encontrado el mismo subtipo en cepas de L. monocytogenes aisladas de productos cárnicos cocidos diversos (jamón york, mortadela, etc.) adquiridos el mismo día y loncheados en el momento de la compra.

Conclusión. Las técnicas moleculares RAPD y REA han mejorado el poder de discriminación de técnicas tradicionales, como el serotipado, en la caracterización de cepas de Listeria monocytogenes. Dada la ubicuidad del microorganismo y la elevada incidencia encontrada en determinados productos de consumo directo del mercado navarro, estas técnicas constituyen buenas herramientas para el control y seguimiento de su diseminación, permitiendo establecer pautas de prevención de riesgos. Por otro lado, esta metodología molecular haría posible realizar un buen seguimiento epidemiológico ante la aparición de brotes de listeriosis en Navarra.

Optimización posológica del 5-fluorouracilo

J. Giráldez, A. Aldaz, L. Zufía, C. Castellanos, A. Ortega, E. Calvo, J. C. Garzón, J. García
Departamento de Farmacia. Clínica Universitaria. Facultad de Medicina. Pamplona.

Fundamento. El 5-fluorouracilo (5FU) es un fármaco clásico en el tratamiento del cáncer colorrectal incluyendo su fase avanzada. Existen indicios suficientes en la literatura científica que permiten argumentar la posibilidad de optimizar los resultados terapéuticos mediante la individualización posología basada en métodos farmacocinéticos.

La introducción en los últimos años de fármacos altamente eficaces en esta enfermedad, tales como el irinotecan y el oxaliplatino han contribuido al desarrollo de nuevos protocolos terapéuticos que establecen incógnitas sobre la posibilidad de interacciones farmacocinéticas-farmacodinámicas que modifiquen el rango terapéutico previamente bosquejado para el 5-fluorouracilo.

Pacientes y métodos. Se han analizado 49 ciclos de quimioterapia correspondientes a 31 pacientes diagnosticados de cáncer colorrectal avanzado que recibieron tratamiento combinado con 5-fluorouracilo (2.600 mg/m2 IV en infusión de 24 h días 1 y 14), oxaliplatino (120 mg/m2 infusión de 2 h, día 1) irinotecan 250 mg/m2) infusión de 90 min., día 1). El tratamiento se repitió cada 28 días. En 10 pacientes se extrajeron entre 9-11 muestras plasmáticas destinadas a valorar el modelo farmacocinético de ajuste de los datos concentración-tiempo así como a estimar los tiempos d-óptimos que permitieran aplicar al resto de los pacientes una estrategia de muestreo limitado. Para ello, se utilizaron respectivamente el paquete de programas farmacocinéticos de la Universidad del Sur de California (USCPack. v. 11.2) y el módulo Sample del programa ADAPT II v. 1997 de DArgenio.

Los datos de toxicidad y eficacia se recogieron en un formulario destinado al efecto de acuerdo con los criterios del National Cancer Institute (NCI) de los Estados Unidos. El análisis de las relaciones farmacocinéticas-farmacodinámicas se llevó a cabo con el programa Statistica v. 5.0 de StatSoft.

Las muestras plasmáticas se analizaron por cromatografía líquida de alta resolución de acuerdo al método desarrollado por la Unidad de Farmacocinética del Servicio de Farmacia de la Clínica Universitaria de Navarra.

Resultados. El modelo farmacocinético idóneo para ajustar los pares concentración-tiempo resultó ser el monocompartimental lineal abierto de acuerdo a los criterios de entropía, máxima información asociada, coeficiente de determinación de la recta valores observados/predichos y las medidas de sesgo y precisión (error medio de predicción y error cuadrático medio de predicción). Los parámetros farmacocinéticos estimados en la población estudiada se muestran en la tabla 1, y en la recta de valores observados frente a predichos, que muestra la capacidad predictiva interna de estos parámetros (Fig. 1).

Se observó un aclaramiento (CL) en L/min. significativamente superior en hombres que en mujeres (p=0,03) pero no así respecto a la edad mayor o inferior a 60 años. Sin embargo, al estudiar el efecto de la edad sobre el área bajo la curva concentración plasmática-tiempo (AUC) se observó que los enfermos de más de 60 años presentaban AUC significativamente inferiores a los pacientes más jóvenes (p=0,007). La explicación reside en la relación existente entre el AUC y el CL (AUC=Dosis/CL) ya que entre los criterios de reducción de dosis arbitraria figuran la edad avanzada y pruebas de función hepática alterada y en la población analizada coincidieron ambas circunstancias en algunos pacientes, reduciéndose la dosis en los mismos sin encontrarse posteriormente justificación para ello desde el punto de vista de la farmacocinética.

Tampoco se encontró correlación significativa entre el CL y la superficie corporal (SC) (rho=0,28 p=0,06) lo que viene a confirmar la corriente actual que va en contra de la dosificación de los citostáticos en base a la superficie corporal, fundamentalmente en aquellos fármacos que sufren metabolismo hepático como es el caso del 5-FU.

No se observó asociación significativa entre el índice de Karnofsky y el AUC de 5-FU (rho=0,22, p=0,12), ni entre las enzimas hepáticas y el CL de 5-FU pero este último dato hay que analizarlo dentro del rango de funcionalidad hepática de los pacientes estudiados (GOT 7-152; GPT=4-154) BIL T=0,21-6,55; FA=93-1944; LDH=101-5.022). Posiblemente con mayor porcentaje de pacientes con valores de bilirrubina total o transaminasas más elevados los resultados podrían haber sido diferentes.

La toxicidad no hematológica fue leve o moderada (grado 1 y 2). La toxicidad limitante de dosis más frecuente fue la diarrea (69%) seguida de mucositis (45% y el síndrome mano-pie (28%). Tres pacientes tuvieron diarrea grado 3 y otros 3 grado 4. Un paciente mostró mucositis grado 3 y otro síndrome mano-pie grado 3. No se evidenció asociación significativa entre el AUC y los distintos tipos de toxicidad no hematológica debido probablemente a la buena tolerancia de los pacientes al régimen de infusión empleado para la administración del 5-FU, además se cuidó mucho el tiempo de inicio de la infusión con objeto de paliar al máximo la incidencia del ritmo circadiano sobre la toxicidad no hematológica. Por otra parte el valor medio de AUC en los pacientes fue de 22 mg h/L, inferior a los 30 que se considera el límite por encima del cual se ha descrito un incremento en la aparición de mucositis y diarrea y se situaba dentro del rango de 16-24 mg h/L definido para controlar la aparición del síndrome mano-pie.

Se observó toxicidad hematológica grado 3-4 en un 15% de los pacientes. En el análisis de regresión logística multivariante se definieron como covariables predictoras independientes de la neutropenia (grado 2-3 ó 4) al AUC de 5-FU (p=0,001) y la edad mayor de 60 años (p=0,015) y la curva de rendimiento diagnóstico realizada posteriormente demostró que un valor de 25,15 mg h/L predecía con significación estadística la aparición de la neutropenia (p=0,02).

En cuanto a la eficacia global del tratamiento en términos de intervalo libre de progresión, no se encontró una influencia significativa de la exposición a 5-FU y ello puede explicarse estudiando el protocolo quimioterápico aplicado ya que tanto el irinotecan como el oxaliplatino han demostrado ser eficaces en pacientes afectos de neoplasía colorrectal avanzada tratados previamente con 5-FU, por tanto el beneficio que este fármaco aporta a la eficacia terapéutica en cuanto a intervalo libre de progresión podría haber quedado solapado por la mayor influencia del irinotecan y/o del oxaliplatino.

Conclusiones. Se ha demostrado que la farmacocinética clínica es un potente herramienta para comprender los resultados obtenidos con la terapia de 5-FU y que su empleo es básico para evitar la reducción de dosis arbitraria que se aplica tradicionalmente en pacientes considerados de riesgo.

El núcleo subtalámico en la enfermedad de Parkinson: papel
etiopatogénico y perspectivas terapéuticas

J. Obeso
Departamento de Neurología. Clínica Universitaria. Facultad de Medicina. Universidad de Navarra.

Fundamento. El núcleo subtalámico (NST) ejerce una acción excitadora sobre los núcleos de salida de los ganglios basales. En el estado parkinsoniano el NST se encuentra hiperactivo.

Material y métodos. En la rata se han realizado inyecciones con trazadores anterógrados y retrógrados para marcar las principales aferencias directas e indirectas al NST. Así mismo se administró la neurotoxina 6-hidroxidopamina para realizar una lesión unilateral de la proyección nigro-estriada y analizar secuencialmente los cambios metabólicos relacionados con el inicio del estado parkinsoniano. Para ello, se aplicó la técnica de hibridación in situ para medir el mRNA de la enzima citocromo oxidasa 1 como índice de actividad neuronal.

En monos con parkinsonismo experimental por la neurotoxina MPTP se indujeron disquinesias por levodopa y se estudió el efecto de la lesión del núcleo centromediano sobre las mismas.

En pacientes con enfermedad de Parkinson tratados crónicamente (4-5 años) mediante estimulación cerebral profunda del NST se analizó, mediante valoración doble ciega, el efecto de este tratamiento.

Resultados. El NST recibe conexiones excitadoras directas desde el núcleo centromediano del tálamo e indirectas de las mismas neuronas, pero a través del estriado. El aumento de la actividad funcional del NST se produce al unísono que otros núcleos glutamatérgicos subcorticales y antes de que se produzca una deplección dopaminérgica estriatal significativa.

En pacientes tratados con estimulación cerebral profunda durante 5 años, el tratamiento continúa controlando adecuadamente los síntomas y signos cardinales de la enfermedad.

Conclusiones. El NST se encuentra en una posición anátomo-fisiológica de máxima importancia para controlar la actividad eferente de los ganglios basales. El estado de hiperactividad neuronal que caracteriza a la enfermedad de Parkinson no depende solamente del aumento de la actividad en el NST.

La técnica de estimulación cerebral proporciona un adecuado control terapéutico tras 5 años de tratamiento.

Expresión de metaloproteinasas y sus moléculas reguladoras en el
carcinoma renal. Valoración de su valor pronóstico en pacientes
tratados mediante cirugía radical.

J. Arocena, A. Panizo, J. Rodríguez, D. Rosell, F.J. Pardo, E. de Alava
Departamentos de Anatomía Patológica y Urología. Clínica Universitaria de Navarra. Pamplona.

Fundamento. El carcinoma renal supone la novena causa de muerte por cáncer en el varón y la decimotercera en la mujer, con una incidencia de 4-6 casos/100.000 habitantes/año. Existen varios subtipos anatomopatológicos (células claras, papilar, cromófobo, de conductos colectores) muy diferentes no sólo en su morfología sino también en su patogenia molecular. Su etiología es incierta; en el carcinoma de células claras existe una inactivación del gen supresor tumoral VHL. En general tienen gran tendencia a invadir los vasos intratumorales y extenderse al sistema cava, y también a rodearse de una cápsula, que en el 20% de los casos está invadida por el tumor. Los factores pronósticos más relevantes son el grado nuclear y el estadio patológico.

Entre el 10-30% de los casos el tumor progresa. Como en casi todos los tipos tumorales la metástasis es la primera causa de muerte en los pacientes con carcinomas renales. La metástasis es un proceso complejo con varias fases, que implica que la célula tumoral tiene que romper la unión con el tejido en el que se origina, atravesar la matriz extracelular y romper las membranas basales, incorporarse al torrente circulatorio o linfático, y por último anidar en un nuevo tejido y procurarse una nutrición propia mediante la formación de neovasos. Los componentes principales de la membrana basal y de la matriz extracelular son el colágeno, la laminina y la fibronectina. La proteolisis de estas moléculas es un paso esencial para la invasión tumoral y requiere proteasas específicas.

De entre dichas proteasas, las más estudiadas son las metaloproteinasas de la matriz (MMP). Existen 20 tipos, agrupables en 4 grupos principales: colagenasas (3 tipos), estromelisinas (3 tipos), gelatinasas (2 tipos), y MMP de membrana (MT-MMP) (5 tipos). Los inhibidores fisiológicos de las MMP se denominan inhibidores tisulares de las metaloproteinasas, o TIMPs. Existen 4 tipos de TIMPs. Se ha visto que el concepto originario de que las MMPs son pro-metastásicas, y los TIMPs son anti-metastásicos era demasiado simplista. Por ejemplo las MMPs tienen además un papel importante en el crecimiento tanto de los tumores primarios como de sus metástasis, lo que subraya su papel central en el proceso metastásico.

Existen algunos artículos recientes sobre expresión de MMPs y TIMPs en carcinomas renales. Sin embargo, ninguno aborda su distribución espacial; es decir no se ha tenido en cuenta la heterogeneidad tumoral, comparando, dentro de un mismo tumor, las células que infiltran los vasos con las alejadas, o las que infiltran la cápsula con las que no lo hacen. Tampoco se han realizado estudios con grandes series de pacientes con seguimiento prolongado para evaluar correctamente el valor pronóstico de la expresión de estas moléculas, o también correlacionar la expresión de estas moléculas con subtipos específicos de carcinoma renal.

Material y métodos. La serie incluye 109 pacientes con carcinoma renal diagnosticados en la Clínica Universitaria de Navarra, con seguimiento clínico, de los que se disponga de material en parafina y congelado. Hemos estudiado mediante inmunohistoquímica la expresión de las metaloproteinasas 2, 7, 9, 11 de sus inhibidores TIMP-1 y TIMP-2 en carcinomas renales. La evaluación del estudio la han realizado 3 observadores independientes. Han valorado especialmente:

1- La expresión en las áreas del tumor que rodean o que hayan invadido los vasos.

2- La expresión en las áreas del tumor que invaden la cápsula renal y se extienden localmente.

3- Las diferencias de expresión entre los diversos subtipos (células claras, cromófobo, papilar).

4- El valor pronóstico de dicha expresión.

Resultados y conclusiones. Las características de la serie (datos demográficos, proporción de subtipos anatomopatológicos, estadio y grado tumorales) eran similares a los de otras series. La mediana de seguimiento de la serie fue de 3 años. Los resultados observados mostraron, en resumen que:

1- Existe un aumento en la expresión de MMP-2 en los tumores de alto grado, y dentro de éstos, especialmente en las áreas tumorales que rodean o invaden los vasos, y en las áreas de invasión capsular. En los carcinomas cromófobos, sin embargo, la expresión era más difusa y no existían estas diferencias.

2- Además se observa un claro aumento de expresión de TIMP-1 en los carcinomas renales. Esto es en principio sorprendente dado que TIMP-1 es en primer lugar una molécula inhibidora de la actividad de las metaloproteinasas. Sin embargo, se ha visto recientemente que TIMP-1 puede tener una acción agonista parcial de dichas enzimas, y su expresión puede estar aumentada en tumores malignos, particularmente de mama.

3- Los factores clínicos y patológicos con influencia en el pronóstico de nuestros pacientes con carcinoma renal y sometidos a nefrectomía son, en el estudio univariado, el grado nuclear, el estadio tanto clínico como patológico, el tipo de tumor, la existencia de adenopatías clínicas o patológicas y la existencia de metástasis.

4- La expresión elevada de metaloproteinasa 7 es un factor de buen pronóstico en pacientes con tumor renal en el estudio univariado realizado, siendo estadísticamente menor la tasa de recidivas y mayor el tiempo libre de recidivas. Además en el estudio realizado sólo se asocia estadísticamente a la recidiva y no al resto de variables pronósticas encontradas.

5- La expresión elevada de metaloproteinasa 11 es un factor de buen pronóstico en pacientes con tumor renal en el estudio univariado realizado, siendo estadísticamente menor la tasa de recidivas y mayor el tiempo libre de recidivas. Además en el estudio realizado sólo se asocia estadísticamente a la recidiva y no al resto de variables pronósticas encontradas.

6- Al estudiar conjuntamente el papel pronóstico de la MMP-7 y MMP-11 con el resto de variables clínicas y patológicas mediante un análisis multivariado de los factores pronósticos, la expresión elevada de metaloproteinasa 11 junto con la existencia de metástasis a distancia y la afectación ganglionar, son los únicos factores pronósticos independientes en pacientes con tumor renal, no así la expresión de MMP-7. Tanto la afectación metastásica y la afectación ganglionar son factores pronósticos negativos y la alta expresión de MMP-11, por el contrario, es factor de buen pronóstico.

7- Al realizar el análisis multivariado de los factores con influencia pronóstica sin incluir la MMP-11, la expresión de MMP-7 es un factor independiente de buen pronóstico, por lo que pensamos que la acción de la MMP-7 tiene que depender de algún modo de la acción de la MMP-11.

Aplicación clínica de las escalas de calidad de vida de la EORTC a
diferentes tumores y creación y validación de nuevas escalas de
calidad de vida dentro de la EORTC

J. I. Arrarás.
Servicio de Oncología. Hospital de Navarra. Pamplona.

Fundamento. Existe dentro de la oncología un interés por evaluar y mejorar dimensiones en el paciente oncológico: el impacto físico, psicológico y social; es decir, su calidad de vida. Se busca medir la calidad de vida del paciente oncológico tanto en los ensayos clínicos de tratamientos, como en la práctica clínica diaria.

En 1986 la Organización Europea para la Investigación y el Tratamiento del Cáncer (EORTC), creó un grupo estable de trabajo sobre calidad de vida. El Servicio de Oncología del Hospital de Navarra lleva colaborando en este grupo desde 1992.

Este grupo creó un cuestionario general, común a todo tipo de cáncer, el QLQ C30. De este cuestionario se han hecho tres versiones, QLQ C-30 (1, 2 y 3) las cuales han sido validadas para España en nuestro hospital. Este cuestionario general se complementa con módulos específicos para diferentes tipos de cáncer. Algunos de estos módulos para mama, pulmón, cabeza y cuello, y recto habían sido validados para su uso en España en nuestro centro antes del inicio de este trabajo. Los módulos de esófago, estómago, ovario se estaban validando en un estudio internacional de la EORTC. Estábamos involucrados además, dentro del Grupo de la EORTC, en la creación y validación de otros módulos. La calidad de vida se estaba midiendo en varios tumores tratados en el Servicio de Oncología, en diferentes estadios de la enfermedad.

Material y métodos. En el presente trabajo se han llevado a cabo diferentes estudios. Los podemos organizar en:

1- Estudios clínicos en los que se ha evaluado la calidad de vida. Se ha estudiado la calidad de vida en tumores de mama en estadios iniciales y tras un seguimiento largo, próstata en estadios iniciales, colon y recto en estadios avanzados, y recto en estadios no metastáticos.

2- Estudios de la EORTC, dirigidos a la creación y validación de cuestionarios de calidad de vida. Los pasos en la creación de un instrumento son: revisión de literatura, entrevistas a expertos y pacientes, creación de ítems, estudio piloto, traducción de los ítems, y estudio de campo de validación. Hemos colaborado en los cuestionarios de ovario, esófago, estómago, satisfacción, toma de decisiones, y en una versión breve del cuestionario general QLQ-C30. Estamos coordinando además la creación de una escala de información.

3- Estudios psicométricos propios en los que se han validado escalas de la EORTC para su uso en nuestro país. Se ha trabajado en la validación de la escala de próstata y en la evaluación de la versión 3.0 del cuestionario general.

Resultados

Los estudios clínicos sobre calidad de vida a largo plazo de las pacientes con cáncer de mama tratadas en el Servicio de Oncología presentan unos niveles satisfactorios.

La calidad de vida de los pacientes con cáncer de próstata en estadios iniciales resulta adecuada. Se producen afectaciones leves en áreas específicas relacionadas con los tratamientos, que mejoran en el seguimiento.

La calidad de vida de los pacientes con cáncer de colon y recto en estadios avanzados presenta limitaciones en áreas relacionadas con la enfermedad y el tratamiento. Los niveles de calidad de vida de los sujetos que reciben los protocolos completos son adecuados.

La calidad de vida de los pacientes con cáncer de recto no metastático tratados con protocolos de quimio y radioterapia presenta unos niveles adecuados. Se ven afectadas áreas específicas relacionadas con los tratamientos.

Hemos finalizado los estudios internacionales de creación y de validación de los cuestionarios de la EORTC para ovario, esófago y estómago. Estamos trabajando en la validación del de satisfacción, y en la creación de escalas de toma de decisiones, y en una versión breve del cuestionario general QLQ-C30. Hemos coordinando la creación de una versión provisional de una escala de información.

Hemos validado para su uso en nuestro país el módulo de próstata y hemos comprobado el funcionamiento estadístico de la versión 3.0 del cuestionario general con distintos tumores.

Conclusiones. Los niveles de calidad de vida de los pacientes con tumores de mama en estadios iniciales tras un seguimiento largo, colon y recto en estadio avanzado, próstata y recto en estadios iniciales evaluados, resultan adecuados.

En los casos de enfermedad avanzada los pacientes tratados mantienen niveles satisfactorios de calidad de vida.
Los cuestionarios de calidad de vida de la EORTC para cáncer de esófago, de estómago, de ovario, tienen un funcionamiento estadístico adecuado.

Los estudios de validación para nuestro país de la escala de próstata ofrecen resultados satisfactorios.