Aplicaciones de la citología exfoliativa en el diagnóstico del cáncer oral

Márcio Diniz Freitas ⁽¹⁾, Abel García García ⁽²⁾, Antonio Crespo Abelleira ⁽³⁾, José Luis Martins Carneiro ⁽¹⁾, 
José Manuel Gándara Rey ⁽⁴⁾

(1) Odontólogo. Máster en Medicina Oral, Cirugía Oral e Implantología, Facultad de Odontología, Universidad de Santiago de Compostela
(2) Profesor Titular de Cirugía Oral, Facultad de Odontología, Universidad de Santiago de Compostela Jefe de Sección del Servicio de Cirugía Maxilofacial, Hospital Clínico Universitario de Santiago
(3) Profesor Titular de Anatomía Humana, Departamento de Ciencias Morfológicas, Facultad de Medicina y Odontología, Universidad de Santiago de Compostela
(4) Catedrático de Medicina Oral y Maxilofacial, Facultad de Odontología, Universidad de Santiago de Compostela. España

Correspondencia:
Dr. José Manuel Gándara Rey
Facultad de Odontología 
Calle Entrerríos S/N 15706- Santiago de Compostela - España.
Tlfo: 981 56 31 00 Ext: 12357
E-mail: cigandar@usc.es

Recibido: 4-05-2003 Aceptado: 31-01-2004

Diniz-Freitas M, García-García A, Crespo-Abelleira A, Martins- Carneiro JL, Gándara-Rey JM. Aplicaciones de la citología exfoliativa en el diagnóstico del cáncer oral. Med Oral 2004;9:355-61.  © Medicina Oral S. L. C.I.F. B 96689336 - ISSN 1137 - 2834

RESUMEN

La citología exfoliativa es una técnica sencilla, no agresiva y bien aceptada por los pacientes, por lo que podría ser útil en el diagnóstico precoz del cáncer oral. Sin embargo, su utilización como método diagnóstico de atipias epiteliales y especialmente del carcinoma oral de células escamosas ha perdido importancia, sobre todo debido a su baja sensibilidad representada por el elevado número de resultados falsos negativos. Se atribuye esta baja sensibilidad a diversos factores, entre ellos: toma inadecuada de la muestra, error en la técnica e interpretación subjetiva de los hallazgos citológicos. Afortunadamente, en los últimos tiempos, el desarrollo del análisis cuantitativo, la citomorfología, el análisis del ADN, la detección de marcadores tumorales y el análisis molecular ha contribuido al resurgir de esta técnica.

El objetivo de este trabajo es hacer una breve revisión sobre las aplicaciones de la citología exfoliativa en el diagnóstico del cáncer oral.

Palabras clave: Cáncer oral, citología exfoliativa, citomorfología, análisis del ADN, marcadores tumorales, análisis molecular.

INTRODUCCIÓN

-Cáncer Oral

El carcinoma de células escamosas (CCE) representa más del 90% de los cánceres que afectan a la cavidad oral (1). En España, la incidencia del cáncer oral es de 12 a 15 casos/100.000 habitantes/año en varones y de 2 a 4 casos/100.000 habitantes/año en mujeres, y representa entre el 2 y el 3% de todas las muertes por cáncer en nuestro país (2). La tasa de supervivencia a los 5 años es de 80% en estadios iniciales, 40% en neoplasias con afectación regional y menos de 20% para pacientes con metástasis a distancia (3). La detección precoz en estadios asintomáticos garantiza no sólo un aumento en las tasas de supervivencia sino también una mejora en la calidad de vida en consecuencia a tratamientos menos agresivos y mutilantes (4). Sin embargo, en el momento del diagnóstico del cáncer oral, el 36% de los pacientes presentan enfermedad localizada, un 43% presentan enfermedad con afectación regional, un 9% presentan metástasis a distancia, y para el 12% restante el estadio de la enfermedad no se puede identificar (5). Estos resultados deben considerarse malos si se tiene en cuenta que los carcinomas de células escamosas se forman en el epitelio superficial de la cavidad oral, por lo que producen cambios visibles precoces.

El retraso en el diagnóstico se debe tanto al paciente, que puede no buscar atención ante una situación oral inusual, como a los profesionales del área de la salud, que pueden no explorar las lesiones adecuadamente.

-Citología Exfoliativa Oral

La citología exfoliativa oral se define como el estudio e interpretación de los caracteres de las células que se descaman, natural o artificialmente, de la mucosa oral. Consiste en observar al microscopio la morfología de las células epiteliales superficiales después de su toma, fijación y tinción (6). Es una técnica sencilla, no agresiva, relativamente indolora y bien aceptada por los pacientes, por lo que podría ser útil en el diagnóstico precoz del cáncer oral. Sin embargo, el uso de la citología exfoliativa oral para el diagnóstico de atipias epiteliales y especialmente del carcinoma oral de células escamosas ha perdido importancia, sobre todo debido a su baja sensibilidad representada por el elevado número de resultados falsos negativos (7). Se atribuye esta baja sensibilidad a diversos factores, entre ellos: toma inadecuada de la muestra, error en la técnica e interpretación subjetiva de los hallazgos citológicos (8).

En relación a la toma de la muestra el uso del cytobrush (Fig 1.) parece aumentar el número de células recogidas por muestra, y permite una mejor distribución de las mismas en el porta-objetos, lo que podría aumentar la sensibilidad de la técnica (9). Además, en los últimos tiempos, el desarrollo del análisis cuantitativo, la citomorfología, el análisis del ADN, la detección de marcadores tumorales y los métodos de diagnóstico molecular han contribuido al resurgir de esta técnica.

-Citomorfometría

Ogden et al. (10) sugieren que las técnicas cuantitativas, basadas en la valoración de parámetros como las variaciones del tamaño del núcleo y del citoplasma y en alteraciones en la relación núcleo/citoplasma, pueden aumentar la sensibilidad diagnóstica de la citología exfoliativa en el diagnóstico precoz del cáncer oral por ser técnicas objetivas, precisas y reproducibles (Fig 2).

Cowpe et al. (11) han demostrado que la citología exfoliativa es capaz de detectar cambios malignos, basándose en la determinación del área del núcleo y citoplasma en frotis teñidos con Papanicolau. En este estudio, publicado en 1985, se basaron en el cálculo del área del núcleo (AN), área del citoplasma (AC) y relación núcleo/citoplasma (AN/AC) de células de la cavidad oral, usando el método del planímetro, y concluyen que 50 células son suficientes para proporcionar una valoración coherente en varias localizaciones de la cavidad oral. Desde entonces, muchos estudios han sido realizados utilizando la técnica descrita por estos autores para valorar la influencia de diversos factores sistémicos y externos en los parámetros a ser medidos. El planímetro fue sustituido por métodos de análisis semiautomático de imágenes una vez que éstos mostraron ser métodos más apropiados debido a que aumentan la velocidad, exactitud y reproducibilidad de los resultados (12,13).

Cowpe et al.(14) encontraron que la disminución del área del citoplasma (AC) precede a un aumento del área del núcleo (AN) en los tejidos que sufren transformación maligna. Además, sugieren que debido a la ausencia de una base de valores citométricos normales, la mucosa sana del mismo paciente proporciona un control satisfactorio. Ramaesh T et al.(15) aplican técnicas citométricas para determinar los diámetros del núcleo y del citoplasma de células de la mucosa oral normal, de lesiones displásicas y de carcinoma de células escamosas. Encuentran que el diámetro del citoplasma se reduce a partir de las células de la mucosa normal hacia las lesiones con mayor grado de displasia, hasta adquirir su menor tamaño en las lesiones de carcinoma de células escamosas. En relación al diámetro del núcleo, encuentran que éste va aumentando a partir de las células normales hacia las células de lesiones con mayor grado de displasia adquiriendo su mayor diámetro en las células de las lesiones de carcinoma oral.

Estos estudios demuestran el valor de la citología exfoliativa en el seguimiento de lesiones clínicamente sospechosas, proporcionando un excelente test diagnóstico adicional para detectar lesiones malignas iniciales, y que la reducción del núcleo y el aumento del citoplasma pueden ser indicaciones precoces del cambio maligno.

-Contenido de ADN nuclear

La citometría estática permite la cuantificación del contenido de ADN en células obtenidas por citología exfoliativa, sin embargo, para el análisis del contenido de ADN, la tinción de rutina con Hematoxilina- Eosina es inadecuada, por lo que se necesitan tinciones especiales para asegurarse que la cantidad de ADN es proporcional a la cantidad de tinción. La Reacción de Feulgen completa estos criterios, ya que es un procedimiento de tinción con carácter estequiométrico (es decir, cada molécula fijada de reactivo de Schiff se corresponde con una porción constante y equivalente de molécula de ADN), lo que permite conocer la cantidad de ADN que contienen las diferentes células que componen la muestra. La gran ventaja del procedimiento es que sobre él puede realizarse la objetivación de esta información mediante espectrofotometría o técnicas de análisis digital de imágenes por densitometría de ADN (16).

Cowpe et al.(11) han demostrado que la mucosa clínicamente normal en pacientes sanos muestra un perfil de ADN diploide, mientras un perfil anormal de ADN se asocia con enfermedades malignas (17). Sin embargo, aunque la mayoría de las lesiones malignas orales presentan unos perfiles anormales de ADN, algunas pueden ser diploides (18,19).

La combinación de la cuantificación del contenido de ADN con la morfometría celular y nuclear, parece ser más discriminatoria a la hora de distinguir lesiones premalignas y malignas. Remmerbach et al., (20) en un estudio prospectivo sobre el valor diagnóstico de la citología exfoliativa en el diagnóstico precoz del cáncer oral, analizaron la citometría celular y del ADN en lesiones sospechosas de cáncer. Encontraron una sensibilidad de 98,2%, y una especificidad de 100% al combinar ambas técnicas. Concluyen que la citometría del ADN es una herramienta sensible, específica y objetiva para la identificación precoz de células neoplásicas en el frotis oral.

Ogden et al. (21) demuestran también su aplicación en el seguimiento de lesiones malignas después del tratamiento definitivo y en la detección de recurrencias tumorales.

Recientemente, Sudbo et al. (22) demostraron, en cortes histológicos, que el contenido de ADN tiene valor pronóstico en leucoplasias de la cavidad oral. La tasa de malignización para las lesiones diploides, tetraploides y aneuploides fue de 3%, 60% y 84%, respectivamente. Doseva et al.(23) encontraron, en el frotis de leucoplasias y líquenes que posteriormente sufrieron degeneración maligna, una distribución hipodiploide o hipertetraploide en vez de un patrón de ADN diploide.

Schimming et al. (24) valoraron la correlación entre la distribución de ADN y las características clínico-patológicas del carcinoma de células escamosas de la cavidad oral. Encontraron un estadio (N) significativamente más alto, una mayor frecuencia de metástasis y una menor tasa de supervivencia en los tumores no-diploides.

Así, la cuantificación del ADN nuclear podría ser útil para predecir el comportamiento de lesiones potencialmente malignas, establecer un pronóstico en lesiones malignas y detectar recurrencias post-tratamiento.

-Identificación de marcadores tumorales mediante inmunohisto-química

La identificación de la expresión de marcadores tumorales en células exfoliadas de la cavidad oral ha recibido un especial interés. Entre ellos la expresión de citoqueratinas ha sido motivo de diversos estudios. El patrón de expresión de las citoqueratinas proporciona información útil con respecto al estado de diferenciación celular (25), pero su potencial diagnóstico en la detección precoz del cáncer oral es limitado una vez que no hay un marcador de queratina presente en todas las lesiones malignas y que no esté presente en la mucosa oral normal (26).

Sin embargo, la identificación de algunas citoqueratinas, ej. K8 y K19 (27), puede representar un importante indicador de una lesión maligna, particularmente si está asociada con otros marcadores, como por ejemplo el perfil de ADN (28).

La mutación del gen supresor de tumor p53 es uno de los cambios genómicos más frecuentes en el cáncer humano (29). De acuerdo con la mayoría de los estudios la p53 no es detectada en la mucosa oral normal (30-33), pero puede ser demostrada a través de técnicas inmunohistoquímicas en el carcinoma de células escamosas y lesiones potencialmente malignas de la mucosa oral (34). De la misma forma ha sido identificada en células de tumores malignos, obtenidas por citología exfoliativa, pero no en mucosa normal (35).

Sin embargo, la demostración inmunohistoquímica de la proteína p53 no se puede asumir como un marcador absoluto de mutaciones del gen p53, puesto que ésta puede ser resultado de la estabilización de la proteína p53 salvaje (no mutada) (36). Además, la mutación del p53 está presente sólo en aproximadamente el 50% de los carcinomas de células escamosas de la cavidad oral, lo que añadiendo al hecho de que la expresión de p53 en tumores orales se ve en etapas avanzadas de la carcinogénesis (37) la citología exfoliativa no es capaz de promover la detección precoz basándose en la detección de la p53, dado que esta técnica es inapropiada para obtener muestras de células basales a partir del epitelio intacto (38).

La gran dificultad permanece en que no hay un único marcador presente en todas las lesiones malignas y que no esté presente en lesiones benignas y en la mucosa oral normal (10).

-Análisis molecular

En la última década hemos experimentado un cambio en los métodos de diagnóstico de un nivel histopatológico a un nivel molecular (39), y la citología exfoliativa ha ganado importancia como un método rápido y fácil de conseguir muestras de ADN. La pérdida de la heterocigocidad (LOH) y otros cambios moleculares que participan en la carcinogénesis oral pueden ser identificados en células exfoliadas (40- 42).

Huang et al. (43) utilizaron la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para amplificar el ADN de células, obtenidas mediante citología exfoliativa, para el análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) en carcinomas orales. Encontraron que un 66% de los casos estudiados presentaban pérdida de la heterocigocidad en el gen p53 en un punto, y un 50% presentó pérdida de la heterocigocidad en otro punto (43).

La PCR y la RFLP también fueron utilizadas para el análisis de marcadores de microsatélite, que son pequeñas secuencias repetidas de ADN. Las mutaciones genéticas, LOH o desequilibrio en los microsatélites (MI), son características de los carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello, por lo que pueden ser utilizadas como marcadores moleculares de malignidad. Nunes et al. (44), utilizando el análisis de microsatélite en células exfoliadas de la cavidad oral por citología exfoliativa y enjuagues bucales, identificaron pérdida de heterocigocidad en 84% de los casos estudiados, aunque la identificación de esas alteraciones fue independiente del estadio del tumor. Sugieren que esta técnica puede ser útil en el diagnóstico precoz y en el seguimiento de los pacientes con cáncer oral.

Spafford et al. (45), en un estudio similar, identificaron alteraciones genéticas (LOH o MI) en todas las lesiones malignas de la cavidad oral estudiadas. El hecho de que ningún paciente sano ha mostrado alteraciones indica la gran especificidad de la técnica.

Probablemente, el análisis molecular se convierta en una técnica esencial en el diagnóstico y manejo del cáncer oral (46). El uso de estos marcadores moleculares permitirá el diagnóstico precoz, identificando cambios antes de que éstos sean clínicamente visibles, así como la valoración de la progresión de éstos y su respuesta a distintos tratamientos. De igual manera podría ser útil en la realización de programas preventivos.

CONCLUSIONES

La utilización de la citología exfoliativa para obtener muestras para la aplicación de técnicas sofisticadas de diagnóstico, citomorfometría, análisis del contenido de ADN, y análisis molecular, parece ganar espacio como un método de diagnóstico fiable del cáncer oral en sus estadios más precoces. Las principales ventajas clínicas de la citología exfoliativa se deben a que es una técnica rápida, no agresiva y relativamente indolora, muy bien aceptada por los pacientes, lo que permite que sea practicada repetidamente en programas preventivos de screening, en lesiones sospechosas ya identificadas o en el seguimiento de lesiones malignas postratamiento.

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