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Medicina Oral, Patología Oral y Cirugía Bucal (Ed. impresa)

Print version ISSN 1698-4447

Med. oral patol. oral cir. bucal (Ed.impr.) vol.10 no.2 Valencia Mar.-Apr. 2005

 

Preparaciones de base líquida vs. citología convencional: 
Adecuación de las muestras y coincidencia de diagnóstico en lesiones orales

Liquid-based preparations versus conventional cytology: 
specimen adequacy and diagnostic agreement in oral lesions

 

Fábia H Hayama (1), Ana CF Motta (2) , Antonio de Padua G Silva (3) , Dante A Migliari (4)

(1) Profesor Asistente, Departamento de Diagnóstico Oral, Escuela de Odontología, 
Universidad Federal de Paraná, Curitiba, PR, Brasil
(2) Investigador Asociado, Departamento de Diagnóstico Oral, Escuela de Odontología, 
Universidad de São Paulo, SP, Brasil
(3) Profesor y Presidente, Departamento de Patología Médica. Escuela de Medicina, 
Universidad Católica de Paraná, Curitiba, PR, Brasil
(4) Profesor Agregado, Departamento de Diagnóstico Oral, Escuela de Odontología, 
Universidad de São Paulo, SP, Brasil

Correspondencia:
Dante A. Migliari 
Universidade de São Paulo 
Faculdade de Odontología, 
Departamento de Estomatologia, Disc. de Semiologia 
Av Prof. Lineu Prestes, 2227, Cidade Universitária 
São Paulo, SP – Brasil 05508-900 
Teléfono y Fax: + (55-11) 3864 1372 
E-mail: damiglia@usp.br

Recibido: 5-09-2003 Aceptado: 22-02-2004

Hayama FH, Motta ACF, Silva APG, Migliari DA. Liquid-based preparations versus conventional cytology: specimen adequacy and diagnostic agreement in oral lesions. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2005;10:115-22.
© Medicina Oral S. L. C.I.F. B 96689336 - ISSN 1698-4447

 

RESUMEN

Objetivo: Comparar la efectividad de la muestra y la coincidencia de diagnóstico entre preparaciones de base líquida y frotis convencionales en lesiones orales, y probar la viabilidad de la prueba inmuno-citoquímica en preparaciones de base líquida de lesiones de carcinoma oral. 
Material y Métodos: Se obtuvieron muestras de 44 pacientes. Primeramente se prepararon frotis convencionales, usando un dispositivo cytobrush. A continuación se sumergió el cepillo que contenía el material residual en un líquido conservante. La muestra en el mismo fue procesada de acuerdo con las indicaciones del fabricante (AutoCyte, Inc. Elon College, North Carolina, USA). Se tiñeron preparaciones de ambas técnicas de acuerdo con el método de Papanicolaou. Para la prueba inmuno-citoquímica se usaron conjuntamente AE1/AE3 (Dako, CA, USA) para las lesiones de carcinoma oral, de acuerdo con el método de la Estreptovidina-biotina-peroxidasa. Se usó la prueba exacta de Fisher; fijándose la probabilidad significativa en p 0.05. 
Resultados: Ambas técnicas coincidieron en el diagnóstico citológico en todos los casos donde se usó una muestra adecuada; en 3 casos el frotis convencional mostró hipocelularidad y, por lo tanto, resultó inadecuado para el análisis. En el análisis de muestras, la citología de base líquida mostró una mejora general estadísticamente significativa), de un 41% en espesura de frotis y de un 66% en la distribución de células (p 0.05), además de una reducción en la superposición de células y la presencia de sangre (p 0.05). La morfología celular se observó mejor en las preparaciones de base líquida. Las reacciones de la prueba inmuno-citoquímica fueron positivas en todos los casos de malignidad, siendo especialmente clara la observación de células inmuno-marcadas. 
Conclusión: Tanto las preparaciones de base líquida como los frotis convencionales son dignos de confianza desde el punto de vista del diagnóstico; el método de base líquida mostró una mejora general en la preservación de muestras, adecuación de ejemplares, observación de morfología celular y reproducibilidad.

Palabras clave: Lesiones orales, diagnóstico citológico, citología convencional, citología de base líquida.

ABSTRACT

Objective: To compare specimen adequacy and diagnostic agreement between liquid-based preparations and conventional smears in oral lesions, and to test the viability of immunocytochemical assay in liquid-based preparations from oral carcinoma lesions. 
Material and Methods: Samples were collected from 44 patients. Conventional smears were prepared first, using a cytobrush device. Then the brush, containing the residual material, was immersed in a preservative fluid. The sample in the preservative fluid was processed according to the manufacturer directions (AutoCyte, Inc. Elon College, North Carolina, USA). Slides of both techniques were stained by Papanicolaou method. For immunocytochemical assay, a cytokeratin pool AE1/AE3 (Dako, CA, USA) was applied in liquid-based preparations from oral carcinoma lesions following the Streptavidin-biotin-peroxidase method. Fisher’s exact test was used; significance was set for p 0.05.
Results: Both techniques agreed on cytologic diagnosis in every case they yielded an adequate specimen; in 3 cases conventional smear resulted in hypocellularity and therefore inadequate for analysis. On specimen analysis, the liquid-based cytology demonstrated a statistically significant, 41% overall improvement in smear thickness and 66% in cell distribution (p 0.05), and a reduction in cell overlapping and presence of blood (p 0.05). The cell morphology was better visualized in the liquid-based preparations. The immunocytochemical assay reactions were positive in all malignant cases, the visualization of the immunostained cells being especially clear.
Conclusion: Both, the liquid-based preparation and conventional smear, are diagnostically reliable; the liquid-based method showed an overall improvement on sample preservation, specimen adequacy, visualization of cell morphology and reproducibility.

Key words: Oral lesions, cytologic diagnosis, conventional cytology, liquid-based cytology

 

INTRODUCCIÓN

La citología exfoliativa es un proceso simple y no invasivo, que permite estudiar las células epiteliales de las superficies mucosas. Ese examen, conocido como frotis citológico convencional, fue originalmente ideado para la detección precoz de células cervicales cancerosas. Su aplicación en la práctica de la medicina oral ha sido restringida, ya que los cambios iniciales de la mucosa oral que indican malignidad se detectan preferentemente con la inspección oral y la biopsia. Además, la gran variación en la calidad técnica de los frotis citológicos aumenta la probabilidad de fallos de diagnóstico en el examen microscópico. No obstante, el frotis citológico se ha usado en el diagnóstico de ciertos tipos de lesiones orales, la mayor parte de ellas provenientes de enfermedades causadas por virus u hongos (1). Actualmente con el progreso de la técnica citológica, que se ha traducido en el desarrollo de preparaciones de base líquida, el uso de esta técnica como herramienta auxiliar en el diagnóstico de lesiones de la mucosa oral ha despertado un renovado interés (2-4).

En las preparaciones de base líquida, la muestra y el dispositivo de recolección se transportan en un recipiente que contiene un líquido conservador. Eso permite la inmediata fijación de las células, con lo cual todo el material removido puede usarse. Esa técnica permite obtener preparaciones con abundancia de células dispersas en una capa fina y homogénea. Sangre, inflamación y mucus quedan reducidos y distribuidos por toda la preparación. El fondo claro que así se obtiene aumenta la sensibilidad y la calidad (5-7). Comparado con los frotis convencionales, el uso de preparaciones de base líquida ha permitido reducir considerablemente el número de preparaciones insatisfactorias o satisfactorias pero limitadas, debido a las características del ejemplar, lo que disminuye el número de resultados falsos negativos (8-10).

El propósito de este estudio es comparar el empleo de las preparaciones de base líquida con el de los frotis convencionales en el diagnóstico oral de rutina. Por otra parte, también se estudió la viabilidad de la prueba inmuno-citoquímica usando preparaciones de base líquida para lesiones cancerosas de células escamosas.

MATERIAL Y MÉTODOS

Pacientes

El grupo de estudio estaba constituido por 44 pacientes examinados en la Clínica de Diagnóstico Oral de la Escuela de Odontología de la Universidad de São Paulo (La Tabla 1 resume las características de esos pacientes). El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de São Paulo. Se informó a los pacientes sobre los objetivos de la investigación, métodos, posibles beneficios y riesgos, y se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes. Fue criterio de exclusión que los pacientes usaran regularmente medicación tópica.

Inmediatamente después de la recolección de material para análisis citológico, se hizo una biopsia de todas las lesiones, excepto de las que eran clínicamente sugestivas de infección por el virus de herpes simplex recurrente VHS, (con presencia de lesiones ulceradas recurrentes en mucosa queratinizada) o infección por Cándida (lesión eritematosa del paladar duro asociada a estomatitis por dentadura o sobreinfección de lesiones preexistentes, tales como liquen plano oral y leucoplasia). Las biopsias fueron sometidas a un examen histológico de rutina y, en casos con sospecha de enfermedades autoinmunes, también analizadas por inmunofluorescencia directa.

Preparación de muestras

Las muestras recogidas provenían de lesiones de: candidiasis (8 casos), liquen plano oral (8 casos), pénfigo vulgar (2 casos), penfigoide membrana mucosa (6 casos), carcinoma de células escamosas (11 casos), nevus esponjoso blanco (3 casos), leucoplasia (2 casos), lesiones de VHS recurrente (3 casos) y paracoccidioidomicosis (1 caso).

Las muestras fueron obtenidas mediante el uso de un dispositivo cytobrush (Adlin, Jaraguá do Sul, Brasil). Primeramente se preparó un frotis convencional pasando el cepillo a lo largo del portaobjetos de vidrio, que fue posteriormente fijado en etanol de 95%. Entonces el cepillo, conteniendo el resto de la muestra, fue sumergido en el medio de transporte, consistente en un conservante de base alcohólica (AutoCyte Inc., Elon College, North Carolina, USA) Tanto el frotis convencional como el frasco con células en suspensión fueron enviados al laboratorio Citopar (Curitiba, Brasil).

En el laboratorio, el frotis convencional fue procesado de acuerdo con la técnica de Papanicolaou. El material celular de base líquida contenido en el frasco fue procesado de acuerdo con las indicaciones del fabricante (AutoCyte, Inc.) El proceso incluía vórtex, centrifugación con reactivo de densidad, decantación y resuspensión de los gránulos de células seguida de sedimentación por gravedad sobre láminas revestidas de poli-l-lisina, y seguidamente por tinción con el colorante de Papanicolaou (8-11). En el caso de lesiones sugestivas de candidiasis, las preparaciones de base líquida fueron hechas por duplicado y una de ellas teñida con PAS (ácido periódico-Schiff). Los frotis convencionales fueron también teñidos con PAS después de ser decolorados con xileno.

Evaluación

Todas las preparaciones fueron examinadas por un citopatólogo que ignoraba el tipo de lesión de donde ellas habían sido extraídas. Para el análisis comparativo de ambas técnicas se usaron cinco parámetros: a) espesura b) distribución celular c) microbiota d) inflamación/leucocitos e) características. Cada uno de ellos fue clasificado en las categorías de satisfactorio, satisfactorio pero limitado e insatisfactorio. Para el análisis estadístico se usó la prueba exacta de Fisher. La significancia fue fijada en p 0.05.

Inmuno-citoquímica

Parte del material de base líquida proveniente de carcinoma de células escamosas también fue probado con respecto a su utilidad en pruebas inmuno-citoquímicas. Siguiendo una técnica estandardizada para preparaciones de base liquida, las muestras de lámina fina así obtenidas fueron dejadas sin teñir y después procesadas por el método del complejo Estreptovidina-biotina-peroxidasa, sin recuperación del epitopo, usando anticuerpos primarios contra citoqueratinas humanas (conjunto de citoqueratinas AE1 / AE3) (12-14). La dilución fue de 1/200 (M3515, Dako, CA, USA). Las muestras fueron primeramente fijadas en alcohol de 95%, y después incubadas con peróxido de hidrógeno 0,3%, con bloqueo de biotina endógena. Los anticuerpos primarios fueron incubados durante 30 minutos, seguidos de Link de 20 minutos (Dako, CA, USA). Las muestras fueron inmuno-marcadas con el reactivo de Estreptovidina-Biotina durante 20 minutos, y el producto de la reacción revelado con diaminobencidina 0,5% (DAB, Dako, CA, USA). Las muestras fueron teñidas con hematoxilina, deshidratadas con alcoholes, lavadas y montadas para evaluación. Los controles negativos se hicieron usando solución salina con fosfato tamponado (PBS), en lugar de anticuerpos primarios. Se definió como reacción positiva la presencia de gránulos rojo-pardos por todo el citoplasma de células epiteliales malignas (2,15-17).

RESULTADOS

En la tabla 2 aparecen los resultados del diagnóstico obtenidos por ambas técnicas. Una y otra llevaron al mismo diagnóstico y a la misma catalogación de clase de Papanicolaou, en todos los casos donde las muestras eran aptas para análisis. En 3 casos (1 de leucoplasia y 2 de nevus esponjoso blanco), el frotis convencional presentó hipocelularidad, lo que hizo imposible el diagnóstico citológico.

En la tabla 3 aparecen los datos de adecuación de las muestras. Entre los resultados satisfactorios, las preparaciones de base líquida mostraron estadísticamente una mejora en cuanto a delgadez (41%) y distribución de células (66%), al compararlas con las provenientes de la citología convencional (p 0.05). En el caso de las muestras “satisfactorias pero limitadas”, las preparaciones de base líquida mostraron reducción en la cantidad de células superpuestas (frotis grueso), distribución irregular de células, y en la presencia de sangre (p > 0.05). No se halló diferencia estadística en lo referente a inflamación por leucocitos, microbiota, artefactos y en los resultados insatisfactorios (p > 0.05).

En el análisis microscópico las preparaciones de base líquida mostraron mayor resolución de las muestras. En pénfigo vulgar, carcinomas de células escamosas, lesiones VHS e infecciones fúngicas, las preparaciones de base líquida presentaron una mejor morfología citológica (Figs. 1 y 2). En el caso de las lesiones por VHS, en particular, la observación de características histopatológicas indicadoras de infecciones por virus (binucleación, células polinucleadas) mejoró mucho con el uso de la técnica de base líquida (Fig. 3).

La prueba inmuno-citoquímica para células malignas, usando una preparación de base líquida, mostró una reacción positiva con citoqueratina AE1/AE3 en los 11 casos experimentados, tiñéndose las células con un patrón rojo pardo (Fig. 4).

 

DISCUSIÓN

Desde que la citología en base líquida fue introducida, en la década de 1990, diversos estudios comparativos mostraron que ella puede ofrecer ventajas significativas sobre la citología exfoliativa convencional. Los resultados obtenidos en exámenes de cuello uterino, por ejemplo, han mostrado que las preparaciones de base líquida reducen los problemas de errores de muestreo, transferencia y fijación deficientes de la muestra de células (8-11,18). En la investigación de cáncer uterino, las preparaciones con base líquida han mostrado también una reducción significativa en la proporción de resultados falsos-negativos, al compararlos con los frotis originales (7-10). Debido probablemente a la escasez de estudios sobre citología de base líquida para el examen de la mucosa oral, el método convencional es todavía el más usado. El propósito de este estudio fue comparar ambas técnicas en términos de adecuación de la muestra y coincidencia de diagnósticos en el caso de diversos tipos de lesiones orales.

La coincidencia de diagnóstico entre ambas técnicas, en el examen de 44 lesiones, fue muy elevada porque ellas coincidieron en todos los casos donde ambas permitieron obtener un preparado adecuado; en 3 casos el frotis convencional acusó hipocelularidad y, por lo tanto, inadecuación para análisis. Con respecto a la adecuación de la muestra, las láminas procesadas por preparaciones de base líquida presentaron ventajas, tales como una distribución delgada y uniforme del material celular, aparte de un fondo claro, debido tanto a la reducción de la superposición de células como a la de la presencia de sangre.

Debido a esos perfeccionamientos, las preparaciones de base líquida proporcionaron ejemplares donde se veía mejor la morfología celular. Por ejemplo, detalles de los efectos citopáticos provenientes de infección por VHS (hipercromatismo nuclear, binucleación, células polinucleadas) mejoraron en las preparaciones de base líquida (19). En el caso de enfermedades autoinmunes, tales como pénfigo vulgar, aunque ambas técnicas fueron eficientes para hacer el diagnóstico, la percepción de láminas de células mostrando pérdida del cemento intercelular (acantólisis) fue mejor caracterizada en las preparaciones de base líquida. En el examen de lesiones producidas por carcinoma oral, ellas también presentaron ventajas sobre los frotis convencionales porque permitieron una mejor observación de las anomalías citológicas y de los cambios en la relación nuclear-citoplasmática.

Otro propósito de este estudio fue experimentar la prueba inmuno-citoquímica en frotis de células escamosas de carcinoma oral procesados como preparaciones de base líquida. La reacción de los anticuerpos frente a un conjunto de citoqueratina humana (AE1/AE3) fue positiva en todos los casos de malignidad, y la visualización de las células inmuno-marcadas fue fácilmente realizada debido al fondo claro de las láminas. La prueba inmuno-citoquímica mostró también importantes ventajas, tales como la cantidad relativamente pequeña de anticuerpos requerida y su costo reducido. Además, la prueba inmuno-citoquímica puede ser útil para resolver casos de diagnóstico problemático, al mostrar expresiones fenotípicas peculiares en células epiteliales.

Resulta claro que, aunque la citología convencional es todavía el principal método usado para los exámenes rutinarios de frotis, este estudio demostró que, entre otras ventajas, la citología de base líquida logra una mejor calidad en la resolución de la morfología celular. Su desventaja reside en que exige tanto un laboratorio con equipo más sofisticado como personal mejor entrenado para manejar debidamente el proceso y analizar las muestras.

Como todos los métodos de citología de base líquida permiten la obtención de más de una preparación por cada muestra recogida, siempre habrá material suficiente para aplicar otras técnicas, tales como PAS y Plata Metamina, además de la tinción de Papanicolaou. Finalmente, el material preservado en la solución de fijación líquida es de larga vida útil y, por lo tanto, está disponible para los exámenes adicionales que sean necesarios.

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