Además, en muchos casos el muestreo hace una sustancial o incluso contribución dominante a la incertidumbre combinada de la medida^27-29

,debido a las fuentes de incertidumbre que afectan al muestreo (heterogeneidad, estado físico de la muestra, transporte y conservación, etc.). A pesar de que la incertidumbre del muestreo contribuye a la incertidumbre combinada, la Guía EURACHEM/CITAC "Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement", trata al muestreo como una fuente de incertidumbre y en la estimación de la u_c, asocia los términos incertidumbre de la precisión y sesgo, sin tener en cuenta la incertidumbre del muestreo. Una metodología de muestreo duplicado, por ejemplo, mediante un diseño experimental balanceado, acoplado con estadística robusta RANOVA, se podría utilizar para determinar la incertidumbre expandida relativa global del proceso de muestreo y del método de análisis³⁰. Esta metodología presenta algunos inconvenientes, ya que implica tomar al menos un 10% de la totalidad de las muestras o n > 8³¹. También supone validar un plan de muestreo que confirme que la incertidumbre generada pueda encontrarse con los requerimientos del "fitness for purpose"³².

Preparación de la muestra

El cálculo llevado a cabo para la estimación de la incertidumbre durante la validación, lleva implícito la incertidumbre debida a la preparación física de la muestra³³, que conlleva unas fuentes de incertidumbre significativas (homogeneización/submuestreo, trituración, etc.) y una causa de error importante en el análisis nutricional, incluso superior al muestreo³⁴.

Validación de procedimientos analíticosv

En conservas de raciones de combate y platos cocinados, las posibles matrices pueden ser muy numerosas. Por tanto, se han seleccionado MRC similares a las de las futuras muestras de rutina objeto del análisis³⁵.

En la validación de métodos analíticos cuantitativos, típicamente, se determina la precisión, exactitud/sesgo, linealidad, LD, LC, robustez y selectividad. Como los procedimientos de ensayo se aplican al análisis de componentes mayoritarios, los estudios de los parámetros de la calidad, se han centrado en el estudio de la precisión y el sesgo.

La precisión intermedia o reproducibilidad intralaboratorio se halla a partir de la desviación estándar de los replicados. Otra posibilidad es estimar la varianza dentro de días y la varianza entre días, utilizando una tabla ANOVA; así, la varianza de la precisión intermedia,

En la estimación de la precisión también se han tenido en cuenta las recomendaciones del International Conference of Harmonization (ICH, 1996). Los valores que se obtienen son aceptables, aunque en cenizas para un valor certificado del 0,22%, fuera del rango de determinación en las muestras reales, se alcanza una DER_R del 16,62%, que se considera dentro de los límites del trabajo científico.

El coeficiente de correlación al cuadrado o de regresión lineal (R²) es igual a 0,9942, y es un indicador de correlación, pero no de linealidad. No obstante, se considera un valor dentro de lo esperado, tratándose de muestras fortificadas. Efectivamente, el test F de Mandel, (PG=12,09; F_crítico=2,818; P=0,05) indica que el rango de trabajo no es igual al rango lineal para una masa de grasa recuperada a una concentración baja y alta. En cambio, los resultados son lineales en ensayos con aceite de ricino, obteniéndose recuperaciones entre el 99% y el 100%.

No se evidencian errores sistemáticos durante la ejecución de los procedimientos analíticos y todos los ensayos de aptitud resultan satisfactorios. Se debe de tener presente que la aplicación de tests estadísticos para comprobar que el procedimiento de ensayo es trazable, lleva consigo el riesgo de cometer un "error α" o un "error β". Así, la probabilidad de cometer un "error β" depende de la incertidumbre de los MRC, precisión del método analítico, del valor tipificado verdadero, z_v, y de otros factores.

La ISO "Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement" (1993) recomienda corregir los resultados por el sesgo significativo y no tener en cuenta este sesgo para incrementar la incertidumbre. A pesar de ello, parece razonable no corregir cada resultado individual por el sesgo, y en su lugar incluir el sesgo en la incertidumbre combinada. Se suele adoptar el criterio de corregir los resultados por el sesgo, cuando el error sistemático es estadísticamente significativo, y de abandonar el sesgo y no corregir los futuros resultados cuando el sesgo, δ, no es significativo al compararlo con la incertidumbre combinada, δ <k u(δ)³⁶.

En este sentido, existen diferentes expresiones³⁷ que se utilizan de forma habitual para la incorporación del sesgo en la estimación de la incertidumbre expandida:

La incertidumbre se estima conjuntamente considerando el proceso analítico como una sola etapa y, previamente, se identifican las fuentes de incertidumbre.

Por ejemplo, la etapa de hidrólisis en la determinación de grasa es una fuente de incertidumbre significativa. Debe tenerse en cuenta que en operaciones tales como hidrólisis, filtración, extracción, no se garantiza la conservación de la masa total de analito. Por otro lado, se entiende que ignorar el sesgo no significativo podría infraestimar la incertidumbre³⁸, especialmente cuando la incertidumbre del sesgo es grande y cuando el sesgo contribuye de forma significativa a la incertidumbre. Por consiguiente, se decide tener en cuenta el sesgo en el cálculo de la incertidumbre. También se recomienda la inclusión del sesgo no significativo en la incertidumbre expandida, cuando la incertidumbre del sesgo u(δ) es mayor que el 30% de la incertidumbre combinada³⁹.

Otro aspecto a considerar en la validación es el número de replicados, que deben ser suficientes para proporcionar una estimación fiable de la desviación estándar. La citada ISO 5725-3 recomienda realizar al menos 15 replicados, aunque el criterio más común es realizar 10 réplicas. En nuestro caso la muestra de referencia se analiza más de 10 veces, a los efectos de disminuir tanto el "error β" como el "error β", y de aumentar la potencia del test (1- β).

Mediante la expresión siguiente adaptada a un laboratorio individual, se puede determinar el número de veces que debe analizarse la muestra para detectar un sesgo mínimo⁴⁰:

La única incógnita es n, ya que debe conocerse la precisión intermedia del método y la incertidumbre del valor de referencia, una vez fijado un sesgo mínimo y la probabilidad α y β. También son útiles otras expresiones que nos permiten determinar el límite de detección del sesgo, Δ_Db, y el valor crítico,

conociendo el número de replicados. El test para el sesgo se hace al nivel de significación α= 0,05, para detectar un diferencia absoluta, Δ_b, entre la media de un mensurando y el valor atribuido al mensurando (β=riesgo de falso negativo), y 1- β= 0,95, potencia del test). Por ejemplo, para proteínas obtenemos a un nivel de concentración bajo (Δ_Db=0,05%; Δ_c=0,02%); a un nivel de concentración medio (Δ_Db=0,17%; Δ_c=0,08%) y a un nivel de concentración alto (Δ_Db=0,62%; Δ_c=0,32%).

No se han hallado resultados discrepantes mediante el test de Grubb´s α= 0,05, en ninguno de los procedimientos analíticos sometidos a validación. Basándonos en el teorema del límite central, nos ha permitido aplicar inferencias de estadística paramétrica a los resultados obtenidos de medidas repetidas.

Los ensayos de aptitud de macronutrientes constituyen una herramienta indispensable en la validación de los métodos analíticos^41-43. El valor HORRAT, definido como la relación entre la desviación estándar de la reproducibilidad y la función de Horwitz (s_R/H), muestra que los valores hallados se encuentran en el intervalo 0,5<Hs_R<2.0⁴⁴, lo que indica que los procedimientos de ensayo tienen una veracidad satisfactoria. Similares resultados se obtienen en el cálculo de HORRAT_r, en condiciones de reproductibilidad intralaboratorio. Es de destacar que para una concentración certificada de humedad de 71,3 g/100g, se obtiene un valor HORRAT_r de 0,15, con una U_rel del 1,67%, y con un valor medio que cae dentro del intervalo certificado. Asimismo, en cenizas a la concentración de 0,19 g/100g, se halla un valor HORRAT_r de 3,3, que en absoluto invalida el método analítico.

Estimación de la incertidumbre

Es posible estimar la U_rel combinando otros términos de incertidumbre estándar, siguiendo la ley de propagación de errores, con las expresiones 1, 2 y 3 que se indican abajo. Por ejemplo, a través de ensayos realizados de forma paralela en la estimación de la incertidumbre de la humedad, con un MRC de concentración 61,8g/100g, se halla con la expresión 1) una desviación (-0,04%), respecto a la U_rel, declarada en la tabla 1.

De donde, x es el valor medio; x_MRC el valor certificado; S_I la precisión intermedia; u_ref, la incertidumbre estándar del MRC.

El ensayo de homogeneidad de Bartlett demuestra que las varianzas de la repetibilidad de humedad, en las matrices ensayadas (melocotón en almíbar, paté a la pimienta y atún en aceite) son homocedásticas (α=0,05; n=5)>M_cal. Se ha utilizado este test por considerarlo como el más adecuado dada la normalidad de las series.

El término,

; siendo x_D, el valor medio de los duplicados, y, S_r, la desviación estándar calculada en condiciones de repetibilidad, según la expresión:

Y el término,

De dónde, DER, es la desviación estándar relativa de los replicados en condiciones de repetibilidad y, n, el número de replicados.

La U_rel, que afecta a la matriz, en las condiciones del ensayo de humedad, se considera despreciable. Igualmente, se demuestra en ensayos con diversas matrices de conservas de raciones de combate (paté a la pimienta, calamares [Loligo vulgaris Lamarck, 1798] en su tinta, ensalada campera, caballa [Scomber scombrus Linnaeus, 1758] en aceite, carne de vacuno con guisantes, etc.) que la incertidumbre de la matriz resulta también despreciable en el caso de la proteína y cenizas.

Tal y como se puede apreciar en las expresiones 2) y 3), tienen en cuenta la variabilidad de las muestras reales. Según se ha demostrado en matrices similares a las utilizadas en ensayos de repetibilidad para la estimación de la u_matriz en raciones de combate, la variabilidad natural podría sobreestimar la U_rel. Por consiguiente, se decide no incluir el término u_muestra/u_duplicados de las muestras reales o de rutina en la estimación de la U_rel.

Contenido en macronutrientes

Los resultados medios de macronutrientes hallados en las muestras de purés, son similares a los que figuran en las tablas de composición de alimentos para marcas comerciales⁴⁵. Por ejemplo, puré de pollo con verduras (humedad, 77%; proteína, 5,6%; grasa, 4,1%), crema de espárragos (humedad, 83%; proteína, 1,76%; grasa, 3,52%), puré de ternera a la jardinera (humedad, 76%; proteína, 5%; grasa, 3,9%). Y a los datos obtenidos en nuestro laboratorio a partir del análisis de marcas comerciales: puré de pollo con verduras (humedad, 76,39%, grasa, 2,65 %, proteínas, 5,48%; puré de merluza con bechamel (humedad, 78,48%; grasa, 2,54 %; proteínas, 4,87%. Es de destacar que en las 51 muestras analizadas, los resultados ofrecen una notable variabilidad, lo que depende de los ingredientes de la receta (pollo, verduras, ternera, pescado, legumbres, vegetales, etc.) y del porcentaje de agua.

Conclusiones

Los parámetros de la calidad estudiados durante la validación y los resultados de los ensayos interlaboratorio, demuestran que los procedimientos analíticos son útiles para la finalidad perseguida.

Los resultados analíticos de los purés, permiten conocer la composición exacta en los macronutrientes ensayados, lo que puede resultar de utilidad para valorar la ingesta en este grupo de población.

La composición nutricional de los purés depende, en gran medida, del contenido de agua, y algunos son pobres en los macronutrientes estudiados. El rango de valores máximo y mínimo, proporcionalmente el más elevado, corresponde a las proteínas. El alcance de la acreditación concedida por (ENAC, España) afecta a humedad (40-95%); proteína (0,5-46%), grasa (3,5-50%) y cenizas (0,4-4%).

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Dirección para correspondencia:
Roberto Pérez Grana.
Servicio de Bromatología y Seguridad Alimentaria.
Centro Militar de Veterinaria de la Defensa.
C/ Darío Gazapo, 3.
28024. Madrid. Tfno. 915122515.
rpergra@oc.mde.es;
rperezgrana@hotmail.com

Recibido: 19 de febrero de 2015
Aceptado: 9 de abril de 2015