INTRODUCCIÓN

El muermo (glanders, en inglés) es una enfermedad contagiosa re-emergente causada por Burkholderia mallei, bacilo Gram negativo de la familia Burkholderiaceae. Se trata de una infección que afecta a especies de équidos (caballos, asnos y mulas), aunque también puede afectar a otras especies de mamíferos como ovejas, cabras, perros y gatos, así como camellos, osos y lobos¹.

La enfermedad es endémica en países de África, Sudamérica y parte de Asia¹. Se pueden observar casos en personas que trabajan con el agente causal en laboratorios bajo condiciones de bioseguridad, como el ocurrido en el año 2000 en EEUU. El muermo es una enfermedad de la lista de enfermedades de declaración obligatoria a la Organización Mundial de Sanidad Animal.

B. mallei es también considerada una grave amenaza bioterrorista (categoría B, CDC) debido a la relativa facilidad con la que se puede obtener y transmitir, la dificultad de diagnóstico de la enfermedad y el que no exista protección mediante vacunación. Se utilizó como arma biológica contra caballos del ejército, otros animales y humanos, durante la Primera y la Segunda Guerra Mundial. En la enfermedad aguda sin tratar puede producirse un 95% de mortalidad en tres semanas¹.

Se recomienda utilizar una combinación de métodos de identificación del agente con la misma muestra clínica. La identificación mediante cultivo in vitro se ve dificultada por la baja cantidad de bacterias presentes en los tejidos infectados y excreciones y a que es un proceso que consume mucho tiempo (48 horas). Las pruebas serológicas más exactas y fiables son las de fijación de complemento y ELISA; sin embargo, las pruebas serológicas no pueden distinguir las reacciones a B. mallei de las reacciones a B. pseudomallei, un microorganismo patógeno muy relacionado filogenéticamente con B. mallei.

Se han desarrollado varias PCRs en tiempo real para la identificación fiable y rápida de B. mallei², pero solo una PCR en tiempo real ha sido evaluada con muestras de un brote de muermo en caballos³. Sin embargo, dada la gran plasticidad genómica de B. mallei y B. pseudomallei^4,5, disponer de otras dianas moleculares para la detección de estas especies patógenas del género Burkholderia podría superar las posibles limitaciones en relación a la sensibilidad y especificidad de los ensayos moleculares que se produjeran tras la aparición de nuevas cepas.

El desarrollo de métodos de identificación de B. mallei no solo rápidos, sensibles y específicos sino también posibles de hacer de forma rutinaria, concretamente los basados en plataformas moleculares como la PCR en tiempo real, resultaría beneficioso tanto para proporcionar un adecuado tratamiento al paciente infectado como para la vigilancia epidemiológica y la investigación forense, en el caso de una liberación intencionada.

OBJETIVOS

Comparar dos PCRs en tiempo real cuantitativas para la identificación de Burkholderiamallei, en términos de sensibilidad y especificidad analíticas: una basada en la amplificación de ADN mediante sondas de hibridación, desarrollada en el laboratorio de Biología Molecular del INTA y otra, mediante el uso de sonda TaqMan, desarrollado por Tomaso et al., 2006³ y método molecular recomendado por la OIE.

MATERIAL Y MÉTODO

Amplificación parcial de genes de Burkholderia mallei/B. pseudomallei y B. mallei (la secuencia de cebadores y sondas aparece en la Tabla 1):

Tabla 1 Cebadores y sondas utilizados para las qPCRs, en las sondas de hibridación una va marcada con fluoresceina en el extremo 3´ (donor) y la otra con un fluoróforoLightCycler (LC) Red o similar en el extremo 5´ (acceptor); esta sonda también va fosforilada en el extremo 3´. La sonda TaqMan va marcada con un fluoróforo emisor en el extremo 5´ y un quencher en el 3´. La transferencia de energía se basa en el fenómeno FRET (FluorescenceResonanceEnergy Transfer). 

La amplificación se llevó a cabo en un equipo LightCycler 2.0 (Roche) y las condiciones fueron:

Tabla 2 Reactivos utilizados y concentración final para ambos métodos de amplificación, en un volumen final de 20 µl y añadiendo 1 µl de ADN molde. 

La construcción de una curva estándar mediante diluciones seriadas 1/10, de ADN purificado, desde 7,04x10⁴-7,04x10⁵ hasta 7,04x10^-1fg/reacción para B. mallei, permitió determinar la eficiencia (ecuación: E = [10^{(-1/pendiente)}]), rango de linealidad, coeficiente de determinación (R²) y sensibilidad analítica. El límite de detección o LD (95% de probabilidad) se calculó realizando 20 replicados de las tres últimas diluciones. El punto de corte se estableció como aquel ciclo de cuantificación (Cq) correspondiente al límite de detección. La repetibilidad se expresó como la desviación estándar del ciclo de cuantificación⁸. Para la determinación de la especificidad (inclusividad y exclusividad) se utilizó ADN purificado (≈10⁶ egc/reacción) de la genoteca del laboratorio de Biología Molecular del INTA procedente de 9 cepas diana (B. mallei), 26 cepas no diana relacionadas (10 cepas de B. pseudomallei y 16 cepas de otras especies del género Burkholderia) y 14 cepas no relacionadas. Un resumen de los parámetros evaluados y de las cepas empleadas aparece en las Tablas 3 y 4.

Tabla 3 Panel de microorganismos usados para el estudio de especificidad y resultado de la qPCR en ambos métodos, las cifras representan los valores de Cq; NA: no amplifica. 

NCTC: National Collection of Type Cultures (ReinoUnido). CCUG: Culture Collection, University of Göteborg (Suecia). CECT: Colección Española de Cultivos Tipo (España). ATCC: American Type Culture Collection (Estados Unidos de América). ISCIII: Instituto de Salud Carlos III. UCM: Universidad Complutense de Madrid

Tabla 4 Resultados de la validación de las qPCRs,obtenidos con la cepa de referencia de B. mallei NCTC 10230. LD calculado en base al tamaño del genoma de B. mallei, estimado en 5,84 Mb. 

egc: equivalentes de genoma completo.

RESULTADOS

El método molecular recomendado por la OIE detecta la presencia de B. mallei mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) usando una sonda TaqMan (Figura 1), mientras que el ensayo desarrollado por el laboratorio de Biología Molecular del INTA detecta la presencia de B. mallei y B. pseudomalleimediante qPCR y la utilización de dos parejas de sondas de hibridación (Figura 2). El gen flipP se amplifica de forma exclusiva en B. mallei, el gen orf11 se amplifica también de forma única en B. pseudomallei, mientras que el gen orf13 se amplifica de forma exclusiva en B. mallei y B. pseudomallei; ninguno de los tres genes se amplifica en el resto de cepas del género ni en las cepas no relacionadas (Tabla 3).

Figura 1 Detección molecular del gen fliP de B. mallei. Curvas de amplificación, fluorescencia recogida por el canal de 530 nm. 

Figura 2 Detección molecular del gen orf13 de B. mallei y B. pseudomallei. A. Curvas de amplificación, fluorescencia recogida por el canal de 610 nm. B. Curvas de fusión, fluorescencia recogida por el canal de 610 nm. 

Los dos ensayos mostraron una alta especificidad analítica, siendo 100% la inclusividad en ambos métodos, para las cepas de B. mallei, y 90% la exclusividad en el método desarrollado en el laboratorio de Biología Molecular del INTA y del 100% en el método molecular recomendado por la OIE, para las cepas no relacionadas. El ensayo desarrollado en el laboratorio obtuvo un límite de detección de 70,4 fg/reacción (11,2 egc/reacción), del orden del obtenido con el método recomendado por la OIE y además permitió la amplificación específica de ADN de B. mallei (Tabla 4).

DISCUSIÓN

Los sistemas de secreción tipo III (type III secretionsystem-TTS) se han relacionado con la patogenicidad de varias bacterias Gramnegativas⁹. B. pseudomallei y B. mallei, albergan un grupo de genes estrechamente relacionados con el grupo de genes del TTS de patógenos de plantas¹⁰. Adyacente a este grupo de genes que codifican para proteínas estructurales secretoras existe un número de marcos de lectura abierto (open readingframes-ORFs) que codifican para proteínas con poca o ninguna homología con proteínas conocidas, pero que proporcionan evidencia de que se expresan los genes TTS⁷. El gen orf11, se amplifica de forma específica en B. pseudomallei, mientras que el gen orf13, se amplifica de forma exclusiva en B. pseudomallei y B. mallei, y no se amplifica en el resto de especies del género Burkholderia⁷. Estas diferencias permitirían identificar de forma específica ambas especies de Burkholderia.

Los resultados de la validación conseguidos por el método desarrollado en el laboratorio de Biología Molecular del INTA fueron similares a aquellos obtenidos por el método recomendado por la OIE (LD de 70 fg/reacción³) y por otros autores (eficiencia del 98,7-99 %, repetibilidad de 0,072-0,080, especificidad analítica del 93-100%²; especificidad analítica del 99-100%¹¹). Respecto al LD al 95% de probabilidad obtenido mediante elmétodo de identificación basado en sondas de hibridación (70 fg/reacción o de 11,2 egc/reacción), éste fue inferior al que consiguióBowerset al., 2010¹², con un valor de 100 copias por reacción, pero superior al que obtuvo Janseet al., 2013², de 4,5 fg/reacción. Estas diferencias en el LD podrían deberse a que el método utilizado para su cálculo puede variar de unos estudios a otros. En relación a la especificidad del método basado en sondas de hibridación, hubo tres muestras que amplificaron dando lugar a un resultado dudoso que redujo en un 10% la exclusividad del ensayo; sin embargo, tras el análisis de las curvas de fusión estas muestras no dieron lugar a ningún pico de fusión, por lo que no se pueden considerar positivas.

B. pseudomallei es una bacteria patógena presente en el medio ambiente que causa una enfermedad llamada melioidosis, similar al muermo. Afecta a humanos y animales de regiones tropicales y subtropicales, especialmente el sur y sureste asiático y el norte de Australia. También pueden darse casos en regiones no endémicas introducidos por viajeros procedentes de zonas endémicas¹³. B. mallei y B. pseudomallei son microorganismos estrechamente relacionados y provocan una enfermedad grave, y potencialmente fatal, en humanos. El diagnóstico de estas enfermedades es difícil en regiones endémicas, pero resulta aún más complejo en aquellas no endémicas, donde no están incluidas dentro del diagnóstico diferencial y la melioidosis concretamente es confundida frecuentemente con la tuberculosis¹⁴. Por todo ello, el desarrollo de un método de identificación rápido y fiable que pudiera discernir entre estas dos especiesdel género Burkholderia,como el desarrollado por el laboratorio de Biología Molecular del INTA, resultaría de gran utilidad.

La mayoría de los formatos de sondas específicos de secuencia de ADN, usan el principio FRET (FluorescenceResonanceEnergy Transfer), en el que se produce la transferencia de energía desde una molécula fluorescente (fluoresceína) a otra molécula adyacente también fluorescente (p. ej., LightCycler Red 640 o similar). Las sondas de hibridación usan dos oligonucleótidos diseñados para que hibriden de forma específica con el fragmento amplificado durante la PCR; solo cuando los dos oligonucleótidos se alinean en regiones adyacentes sobre la molécula diana, los fluoróforos donante y aceptor se encuentran lo suficientemente próximos para que se produzca el fenómeno FRET. La sonda TaqMan contiene unfluoróforo emisor y un quencher muy próximos el uno del otro; cuando la sonda está intacta, el quencher suprime la señal fluorescente del emisor también vía FRET; durante la PCR, la polimerasa rompe la sonda, separando el emisor y el quencher, permitiendo al emisor emitir fluorescencia. Al final de la amplificación, las sondas TaqMan son digeridas mientras que las de hibridación permanecen intactas y pueden usarse en un experimento de curvas de fusión. En el caso de este estudio, el experimento de curvas de fusión se empleó para verificar la especificidad del fragmento amplificado mediante la comprobación de su temperatura de fusión, lo que evitó tener que recurrir a una electroforesis en gel de agarosa que alargaría el tiempo análisis de la muestra y ésta podría contaminarse.

El mayor tiempo de amplificación durante la fase de alineamiento con la sonda TaqMan (63 °C durante 1 minuto) del método de referencia, podría haber alargado el tiempo de análisis en comparación con el método desarrollado en el laboratorio de Biología Molecular del INTA basado en sondas de hidrólisis (60 °C durante 10 segundos seguido de 72 °C durante 12 segundos); sin embargo, la preparación de la mezcla de reacción de la PCR duplex, más compleja por llevar dos parejas de oligonucleótidos, y la introducción del experimento de curvas de fusión tras la amplificación, en el segundo método, compensó las diferencias en tiempo. Por todo ello, los dos métodos se podrían considerar rápidos, en comparación con otras técnicas no basadas en biología molecular, y relativamente iguales en relación al tiempo de análisis.

Para completar el proceso de validación del método desarrollado por el laboratorio de Biología Molecular del INTA sería necesario utilizar muestras clínicas, y así determinar su sensibilidad y especificidad diagnósticas.

CONCLUSIONES

El método desarrollado por el laboratorio de Biología Molecular del INTA permite una rápida amplificación de ADN de Burkholderiamallei con unas elevadas sensibilidad y especificidad analíticas. Además, posibilita la diferenciación entre B. malleiy B. pseudomallei.