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Sanidad Militar

versão impressa ISSN 1887-8571

Sanid. Mil. vol.74 no.4 Madrid Out./Dez. 2018

http://dx.doi.org/10.4321/s1887-85712018000400003 

ARTÍCULO ORIGINAL

Desarrollo de un método de detección de Ocratoxina a (OTA) mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución con Detector de Masas en Tiempo de Vuelo

Development of a method for the Ochratoxin A (OTA) detection by High Resolution Liquid Chromatography with Time Mass Detector

CE Guamán Collaguazo1  , I Peraile Muñoz1  , C Fernández Martínez1  , JC Cabria Ramos2  , M Gil García1 

1Instituto Nacional de Técnica Aeroespacial “Esteban Terradas” (INTA). Departamento de Sistemas NBQ y Materiales Energéticos. Madrid. España.

2Tcol. Veterinario. Instituto Nacional de Técnica Aeroespacial “Esteban Terradas” (INTA). Departamento de Sistemas NBQ y Materiales Energéticos. Madrid. España.

RESUMEN

Antecedentes:

La ocratoxina A (OTA) es una micotoxina producida por algunos hongos (Aspergillus y Penicillium). Puede aparecer en diversos alimentos dependiendo de las condiciones de producción y almacenamiento. Presenta propiedades carcinógenas, nefrotóxicas, teratógenas, inmunotóxicas y neurotóxicas. Es tóxica por inhalación y por ingestión, presenta una elevada estabilidad y su obtención es relativamente sencilla, pudiendo representar un serio problema de salud pública y seguridad. Por ello existe la necesidad de desarrollar métodos de detección rápidos y específicos, que contribuyan a garantizar la seguridad de los ciudadanos. En este sentido, la cromatografía líquida acoplada a un detector de masas de tiempo de vuelo (HPLC-MSD (TOF)) se revela como una técnica diagnóstica muy adecuada para conseguir una detección rápida y específica de dicha micotoxina.

Objetivo:

Desarrollo de un método de detección de OTA, rápido y específico mediante HPLC-MSD (TOF).

Material y Métodos:

Se realizaron 36 ensayos con diferentes condiciones cromatográficas y espectrométricas. En todos los casos se utilizó un HPLC 1200 y un MSD-TOF 6210, con fuente de ionización electrospray (Agilent Technologies).

Resultados:

El cromatograma obtenido mostró el pico de OTA a un tiempo de retención de 1,791 ± 0,009 minutos. En su espectro de masas se observa el ion molecular [M+H]+ a 404,07986 uma y su perfil isotópico característico.

Conclusiones:

El método optimizado mediante HPLC-MSD (TOF) para la detección de OTA es rápido y específico. Este método podría ser adecuado para la detección de otras toxinas, permitiendo crear una base de datos para toxinas susceptibles de ser utilizadas como agentes bioterroristas.

PALABRAS CLAVE: Micotoxina; ocratoxina A; Agentes bioterroristas; HPLC-MSD (TOF)

SUMMARY

Antecedents:

Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin produced by some fungi (Aspergillus y Penicillium). It can be found in several types of food, depending on both production and storage conditions. It has carcinogenic, nephrotoxic, teratogenic, immunotoxic and neurotoxic properties. It is toxic by inhalation and by ingestion. Since this toxin has a high stability and its extraction is relatively simple, it represents a serious public health and safety problem. Therefore, in order to help ensure the safety of all the citizens, it is necessary to develop a fast and sensitive ochratoxin detection method. In this sense, liquid chromatography coupled to a time-of-flight mass detector (HPLC-MSD (TOF)) is revealed as a very suitable diagnostic technique to achieve a rapid and specific detection of this mycotoxin. Aim: Development of a fast and specific method of OTA using HPLC-MSD (TOF).

Material and Methods:

Thirty-six assays were tested with different chromatographic and spectrometric conditions. In all the assayed cases, HPLC 1200 and an MSD (TOF) 6210 with electrospray ionization source were used, (Agilent Technologies).

Results:

The chromatogram obtained showed the peak of OTA at a retention time of 1,791 ± 0,009 minutes. In its mass spectrum it is observed both the molecular ion [M+H]+ at 404,07986 uma and its characteristic isotopic profile.

Conclusions:

The OTA detection method optimized by HPLC-MSD (TOF) is fast and specific. This method could be suitable for the detection of other toxins, allowing the creation of a database for toxins suspected of being used as bioterrorist agents (or biological warfare agents).

KEYWORDS: Mycotoxin; ochratoxin A; bioterrorist agents (or biological warfare agents); HPLC-MSD (TOF)

INTRODUCCIÓN

Las ocratoxinas son una familia de micotoxinas producidas por el metabolismo secundario de algunos hongos de los géneros Aspergillus (Aspergillus ochraceus, Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus) y Penicillium (Penicillium verrucosum). De todas ellas, la más tóxica es la Ocratoxina A (OTA), que puede aparecer en diversos alimentos como cereales y granos de café, dependiendo de las condiciones de producción y almacenamiento, sobre todo respecto a humedad y temperatura. El límite máximo permitido de OTA en alimentos para consumo humano está regulado por el Reglamento (CE) No 1881/20061 y depende del tipo de alimento (Tabla 1).

Tabla 1 Contenido máximo de ocratoxina A en algunos alimentos (Reglamento (CE) 1881/2006). 

Alimento Contenido máximo de OTA (µg/kg)
Cereales no elaborados 5
Uvas pasas (pasas de Corinto, sultanas y otras variedades de pasas) 10
Café tostado en grano y café tostado molido (excluido el café soluble) 5
Café soluble (café instantáneo) 10

La OTA produce en el hombre alteraciones carcinogénicas, nefrotóxicas, teratogénicas, inmunotóxicas y neurotóxicas. En los animales también provoca serios problemas de salud, especialmente en el ganado porcino, afectando a la producción en dicho sector y de manera indirecta, al hombre2. Es tóxica por inhalación y por ingestión y presenta una elevada estabilidad, mostrando una gran resistencia a la acidez y a la temperatura. Su obtención es relativamente sencilla a partir de alimentos contaminados, por lo que podría ser utilizada como un agente de guerra biológico o en un ataque bioterrorista, pudiendo representar un serio problema tanto de salud pública como de seguridad2,3,4.

Por este motivo existe la necesidad de desarrollar y estandarizar métodos de detección rápidos y específicos, que contribuyan a garantizar la seguridad de los ciudadanos, permitiendo la atención médica y la aplicación de medidas de protección específicas en el menor tiempo posible.

Algunos métodos desarrollados para la detección de esta micotoxina están basados en técnicas de cromatografía líquida de alta resolución con detección de fluorescencia3,5. Estos son métodos rápidos, pero poco específicos6,7. En este sentido, la cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un detector de masas de tiempo de vuelo (HPLC-MSD (TOF)) se revela como una técnica de diagnóstico muy adecuada para conseguir una detección rápida y específica de esta micotoxina, ofreciendo la posibilidad de crear bases de datos de toxinas relevantes para la salud pública y la seguridad.

En un analizador de masas de tiempo de vuelo los iones generados en la fuente de ionización son retenidos mediante un potencial eléctrico y, seguidamente, son acelerados aplicando una diferencia de potencial eléctrico pulsado, adquiriendo una elevada energía cinética. De esta manera los iones recorren el tubo de vuelo, libre de campo, hacia el detector, con una velocidad constante inversamente relacionada con la raíz cuadrada de la relación de masa/carga de los iones, por tanto, el tiempo que tardan éstos en recorrer el tubo de vuelo y alcanzar el detector será proporcional a la relación masa/carga de los mismos. La resolución será mayor cuanto menor sea la dispersión de energía de los iones generados en la fuente. Esta dispersión se compensa mediante el uso de “reflectron” o “espejo iónico”, que reenfoca los iones de una misma relación masa/carga sobre el detector. Por estas características, este tipo de analizador ofrece una gran sensibilidad, resolución y especificidad, ya que todos los iones generados llegan al detector proporcionando información isotópica de los compuestos analizados8,9.

El objetivo de este trabajo es el desarrollo de un método de detección de ocratoxina A, rápido y específico, utilizando la técnica de cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un detector de masas de tiempo de vuelo (HPLC-MSD (TOF)).

MATERIAL Y MÉTODOS

Para el desarrollo de este trabajo se utilizó una solución patrón de ocratoxina A (Figura 1) en metanol de las siguientes concentraciones: 1 ppm, 2 ppm, 5 ppm y 10 ppm. Se utilizaron un equipo de HPLC 1200 y un MSD (TOF) 6210, ambos de Agilent Technologies, con una fuente de ionización electrospray (ESI).

Figura 1 Estructura química de ocratoxina A (C20H18O6NCl), Pm 403,816. 

En todos los ensayos se trabajó en condiciones de fase reversa y en modo isocrático, utilizando una columna cromatográfica Zorbax SB-C18, 2,1 x 150 mm (5µm) a 40 ºC y se inyectó 10 µL de la solución patrón de ocratoxina A.

Se llevaron a cabo 36 ensayos variando la composición y flujo de la fase móvil y las condiciones del detector de masas.

En la siguiente tabla se muestra las fases móviles utilizadas con sus respectivas proporciones (Tabla 2).

Tabla 2 Fases móviles y proporción de las mismas utilizadas en los ensayos. 

Fase móvil Proporción (v/v)
Ácido acético 0,99 % / Acetonitrilo (ACN) 60:40
Ácido acético 1% / ACN 50:50
Ácido fórmico (0,1%) / ACN 50:50
Ácido Fórmico (0,1%) / ACN 70:30
Ácido fórmico (0,4%) / ACN 50:50
Ácido fórmico (0,8%) / ACN 50:50
Ácido fórmico (0,8%) / ACN 55:45
Ácido fórmico (0,4%) / Ácido fórmico (0,1%) en ACN 50:50
Ácido trifluoroacético (TFA) 0,01% / ACN 50:50
TFA 0,01% / ACN 55:45
TFA 0,01% / ACN 60:40
TFA 0,1% / ACN 50:50
TFA 0,01% / Metanol 55:45
TFA 0,01% / Metanol 50:50

Los valores de flujo de fase móvil ensayados fueron: 0,2; 0,4; 0,5; 0,6 y 0,7 mL/min.

En la tabla 3 se muestran los valores de los diferentes parámetros del detector de masas de tiempo de vuelo utilizados en los ensayos realizados.

Tabla 3 Valores de los parámetros del detector de masas (TOF) ensayados. 

Parámetros del detector de masas (TOF) Valores
Presión del nebulizador (psi) 30, 40, 50, 60
Flujo del gas de secado (L/min) 10, 12, 13
Voltaje del capilar (V) 3000, 3500, 4000
Fragmentador (V) 50, 100, 150

Análisis de resultados

Se realizó el estudio del pico cromatográfico correspondiente a ocratoxina A obtenido a una concentración de 1 ppm. Las características analizadas fueron la simetría, área, anchura y altura de este pico, así como el tiempo de retención al que aparecía. Además, se realizó un cromatograma de extracción de iones (EIC) para completar dicho estudio. Los resultados obtenidos de este análisis permitieron la selección del método cromatográfico optimizado cuyos parámetros cromatográficos y del detector se muestran en las tablas 4 y 5.

Tabla 4 Condiciones cromatográficas empleadas para la detección e identificación de OTA. 

Parámetros Valores
Columna Zorbax SB-C18, 2,1 x 150 mm (5µm)
Temperatura columna 40 ºC
Volumen de inyección 10 µL
Fase móvil Isocrático, ACN:Ácido Fórmico 0,1% (1:1) (v/v)
Flujo 0,7 mL/min
Duración del ensayo 10 minutos

Tabla 5 Condiciones del MSD-TOF empleadas para la detección e identificación de OTA. 

Parámetros Valores
Fuente de ionización Electrospray
Polaridad Positiva
Presión nebulizador 50 psi
Flujo de gas de secado 13 L/min.
Temperatura de gas de secado 350 ºC
Voltaje del capilar 3500V
Fragmentador 100V
Target mass [M+H]+

RESULTADOS

En la mayoría de los ensayos llevados a cabo se obtuvo un pico cromatográfico correspondiente a ocratoxina A.

El cromatograma obtenido con el método optimizado mostró el pico de OTA a un tiempo de retención de 1,791 ± 0,009 minutos y un área de pico de 5 x 106 (Figura 2).

Figura 2 Cromatograma de HPLC-MSD(TOF) de ocratoxina A (1ppm). 

En suespectro de masas (Figura 3) se observa el ion molecular [M+H]+ con una masa exacta de 404,07986 uma, así como su perfil isotópico característico (Figura 4).

Figura 3 Espectro de masas de ocratoxina A. 

Figura 4 Perfil isotópico de ocratoxina A. 

En la tabla 6 se muestran las abundancias del ion molecular de la ocratoxina A y sus isótopos.

Tabla 6 Abundancias del ion molecular de ocratoxina A. 

m/z Abundancia
404,07986 28809
405,08292 5735
406,07749 9271

DISCUSIÓN

En la naturaleza existe un gran número de toxinas que podrían ser utilizadas como agentes de guerra biológicos, pudiendo originar un serio riesgo para la seguridad ciudadana. Para poder dar una protección adecuada a la sociedad frente a este tipo de riesgo es necesario desarrollar métodos de detección de estas toxinas que sean rápidos, sensibles y específicos. Además, sería interesante el desarrollo de métodos que permitan la detección simultánea de varias toxinas disminuyendo el tiempo de respuesta frente a un ataque con este tipo de agentes. Todo esto posibilitaría la aplicación de las medidas de protección y tratamiento concretas en el menor tiempo posible, ya que cuanto menor sea el tiempo transcurrido entre una posible contaminación y la aplicación de las contramedidas específicas, más posibilidades de éxito en recuperar a posibles víctimas existe.

En este sentido, los métodos cromatográficos son muy adecuados para la detección simultánea de diferentes toxinas10,11. Además, existen métodos oficiales para la detección de diferentes micotoxinas en alimentos (ocratoxina A, aflatoxinas, fumonisinas, etc.)12,13,14.

La cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas con diferentes tipos de analizadores nos ofrece la posibilidad de desarrollar métodos de detección rápidos, sensibles y específicos15,16. El uso de un analizador de masas de tiempo de vuelo proporciona información de masa exacta y distribución isotópica característica de los compuestos analizados, información fundamental en nuestro campo de actuación, detección de agentes de guerra biológica.

En este trabajo se han ensayado diferentes condiciones cromatográficas y espectrométricas dando como resultado, en la mayoría de los casos, un pico correspondiente a ocratoxina A. El estudio de las características de este pico ha permitido la optimización de un método cromatográfico para la detección de esta micotoxina. Con el método optimizado se ha obtenido un pico de OTA a un tiempo de retención corto (1,791 ± 0,009 minutos) lo cual nos indica que es un método rápido, con un área de 5 x106, lo cual nos indica que podría ser un método sensible. Además, el espectro de masas nos ha permitido obtener el ion molecular [M + H]+, la masa exacta y el perfil isotópico característico de esta micotoxina, lo que proporciona una gran especificidad.

Hay bastantes referencias bibliográficas sobre métodos de detección de ocratoxina A, y de micotoxinas en general, mediante cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas, la mayoría encaminados al control y regulación de la contaminación de alimentos de origen vegetal y animal por estas micotoxinas10,11,15,16, siendo su prioridad la detección y cuantificación de las mismas. En nuestro caso concreto, nuestra prioridad es la creación de bases de datos específicas de toxinas de interés en salud pública, animal y en Defensa, con potencial uso como agente de guerra biológica o sospechosas de ser utilizadas en un ataque bioterrorista. Por este motivo se han optimizado métodos cromatográficos acoplados a un detector de masas de tiempo de vuelo, que nos permite, por un lado, analizar y detectar una amplia variedad de toxinas y, por otro, nos proporciona información de masa exacta y perfil isotópico característico de cualquier compuesto analizado.

AGRADECIMIENTO

Becas de Formación del Instituto Nacional de Técnica Aeroespacial “Esteban Terradas” (INTA). Resolución 3D0/38161/2016, de 17 de octubre.

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Recebido: 11 de Abril de 2018; Aceito: 27 de Abril de 2018

Dirección para correspondencia: Matilde Gil García. Área de Defensa Biológica, Departamento de Sistemas NBQ y Materiales Energéticos. Subdirección General de Sistemas Terrestres. Instituto Nacional de Técnica Aeroespacial “Esteban Terradas” (INTA). Ctra. M301, km 10,5, 28330 San Martín de la Vega (Madrid). Tlfn: 911742369. gilgm@inta.es.