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Introducción
La aplicación de productos farmacéuticos sobre la piel es un método terapéutico utilizado desde los inicios de la medicina1. La piel debido a sus características particulares, permite la administración de fármacos de manera local o regional, minimizando potenciales efectos secundarios sistémicos2. En la farmacoterapia es fundamental lograr la adhesión del paciente al tratamiento para que cumpla con la posología, dado que está directamente relacionada con la biodisponibilidad3.
En el caso de la aplicación tópica, un tipo de preparado farmacéutico muy utilizado son las emulsiones, consistentes en sistemas bifásicos de aceite-agua o agua-aceite donde un líquido se dispersa en otro, y el principio activo deseado se incorpora en una de las fases dependiendo de su solubilidad4. Sin embargo, uno de los mayores problemas de estas formulaciones es su estabilidad, la cual puede verse alterada de manera reversible o irreversible5. La pérdida de estabilidad es reversible cuando desaparece por agitación de la emulsión e incluye al cremado, la sedimentación y la floculación. Dentro de la inestabilidad irreversible está la coalescencia y la inversión de fases. Por este motivo, para lograr un producto adecuado es necesario lograr la mayor estabilidad posible de las emulsiones utilizadas6.
De acuerdo a la definición de la IUPAC el estado líquido-cristalino es un estado mesomórfico que posee un ordenamiento de largo alcance en lo que respecta a la orientación molecular y un ordenamiento parcial, o bien un desorden total, en lo referente a la posición de las moléculas. Este estado de la materia se presenta entre el estado sólido cristalino y el líquido isotrópico al variar por ejemplo la temperatura7,8. En los últimos años se han desarrollado emulsiones con estructuras líquido-cristalinas que aumentan la estabilidad de la emulsión aumentando la resistencia mecánica de la interfase aceite-agua y la fijación de las gotitas de la emulsión a dichas estructuras9-10. Los principios activos liposolubles se alojan en las cadenas hidrocarbonadas y las hidrosolubles en la zona polar de la estructura líquido-cristalina. Estos sistemas formarían una emulsión relativamente más estable y permitirían la incorporación de los principios activos, tanto hidrosolubles como liposolubles, los cuales se irían liberando paulatinamente desde el seno de la emulsión, y más lentamente desde los cristales líquidos formados11.
Una de las características particulares que poseen los cristales líquidos es su birrefringencia, fenómeno óptico por el cual cuando un haz de luz atraviesa el material cristalino, se descompone en dos rayos polarizados. Esta particularidad de los cristales líquidos resulta ser de utilidad en la identificación y caracterización de los mismos utilizando microscopía de polarización12,13.
El objetivo del presente trabajo fue analizar las características microscópicas de emulsiones convencionales y de emulsiones con cristales líquidos preparadas mediante la técnica descrita por Suzuki9 y aplicada posteriormente por Pasquali et al.14, a la que se incorporó el principio activo liposoluble Miconazol, el cual posee actividad terapéutica antimicótica4. Además, se analizó si la formación de los cristales líquidos es afectada o no por la presencia del antimicótico.
En la Figura 1 se presenta un esquema de la emulsión convencional y de la emulsión con cristales líquidos, donde se observan las diferencias estructurales entre ellas. En la Figura 1a correspondiente a la emulsión convencional, la interfase consiste en una capa formada por las moléculas del emulgente con su parte hidrófila hacia el exterior y la fracción lipófila hacia el interior de la gota4.En cambio, la Figura 1b corresponde a una emulsión en la cual la interfase está constituida por una multicapa correspondiente a los cristales líquidos formados por el emulgente y las moléculas de alcoholes y ácidos grasos superiores8.
Métodos
Para el presente estudio se prepararon tres emulsiones a fin de compararlas entre sí y caracterizar los cristales líquidos formados. La primera emulsión (a) se formuló por el método convencional con el agregado de nitrato de miconazol, las otras dos se elaboraron utilizando la técnica descripta por Pasquali et al.14 para la formación de cristales líquidos: una emulsión sin principio activo (b), y otra con el agregado de nitrato de miconazol (c). Todas las formulaciones se realizaron por triplicado.
El nitrato de miconazol, tanto en la muestra (a) como en la (c), se incorporó a la fase acuosa en la cual es soluble. Como esa fase presenta pH alcalino debido a que contiene trietanolamina, y dado el coeficiente de difusión y afinidad del nitrato de miconazol, este se hidrolizó y al mezclarse la fase acuosa con la oleosa, el miconazol pasó a la fracción oleosa en la muestra (a), y a la fase oleosa y a las estructuras hidrocarbonadas de los cristales líquidos en la muestra (c).
Las fases de la emulsión estaban compuestas de la siguiente manera:
la fase oleosa conformada por el ácido esteárico (15,00%), la vaselina líquida (20,00%) y el propilparabeno (0,03%);
la fase acuosa preparada con el metilparabeno (0,07%), la trietanolamina (4,14%), el agua y en las muestras (a) y (c) además el nitrato de miconazol (1%).
La muestra (a), se preparó por la técnica convencional: se agregó la fase acuosa con la totalidad del agua a la fase oleosa, ambas a una temperatura de 70°C con agitación manual hasta la formación de la emulsión.
Las muestras (b) y (c) fueron elaborados con la siguiente técnica que permite la formación de los cristales líquidos: una vez producidas las fases y manteniendo una temperatura media de 70ºC a baño María, se preparó la emulsión utilizando un agitador de paleta de velocidad variable (Eurostar digital, IKA Labortechnik). La fase oleosa se incorporó sobre una parte de la fase acuosa mientras se inició la agitación lenta (50 rpm), evitando la incorporación de aire. Una vez que se formó el núcleo de la emulsión, la velocidad se aumentó gradualmente hasta alcanzar 500 rpm mientras se agregaba el agua restante. Luego, la agitación se mantuvo constante durante 10 minutos mientras la temperatura bajaba progresivamente. Todas las sustancias utilizadas fueron calidad Farmacopea Argentina 7ma ed.
Observación y caracterización microscópica
La observación al microscopio de las emulsiones preparadas se realizó tanto por microscopía convencional como por microscopía con luz polarizada con objetivo 40x en todos los casos. La observación de las estructuras de cristales líquidos se realizó usando un microscopio de polarización (Carl Zeiss, modelo Axiolab) con una cámara digital (Olympus SP35) y la medición del tamaño de partículas se realizó con un microscopio convencional (Olympus CH30).
En la Figura 2 se muestran ejemplos de las imágenes obtenidas en formato JPG (2048x1536) por microscopia convencional de las emulsiones a las 48 horas de la preparación.
Figura 2. Imágenes obtenidas por microscopia convencional a las 48 horas de preparadas de: (a) Emulsión preparada por el método convencional con Miconazol; Emulsiones con cristales líquidos (b) sin Miconazol y (c) con Miconazol.
El tamaño de las gotas se midió en todas las muestras a la dilución 1:10. Para ello se registraron imágenes microscópicas digitales correspondientes a 10 campos distintos de cada muestra. Mediante una técnica comparativa con las imágenes de una regla graduada, se determinó la equivalencia entre pixeles y µm utilizando el software ImageJ. Luego, en cada imagen se contó la cantidad de gotas que tenían diámetros en los intervalos 0 - 0,5µm, 0,5µm - 1µm, 1µm - 2µm, 2µm - 3µm y 3µm - 4µm.
Resultados
Al caracterizar las imágenes microscópicas como las mostradas en el ejemplo de la Figura 2, se observó una distribución relativamente homogénea de los glóbulos de la fase oleosa con diversos tamaños de gotas, pudiéndose constatar la presencia de gotas secundarias15 tal como se aprecia en el detalle de la Figura 3.
Figura 3. Detalle de la imagen de la muestra (c) donde se observa claramente la formación de gotas secundarias.
En la Tabla 1 se presenta el número promedio de gotas de los distintos tamaños de las muestras analizadas. En la muestra (a) se observa que más del 50% de los glóbulos de la fase interna tienen tamaños en el intervalo de 1 a 3 µm siendo de mayor tamaño que los de las muestras (b) y (c). Se puede observar que tanto en las muestras con cristales líquidos sin Miconazol como en las que tienen Miconazol, alrededor del 80% de las gotas poseen tamaños en el intervalo 0,5 hasta 1 µm, valores similares a los obtenidos por Lavaselli et al.16 en emulsiones con cristales líquidos utilizando el principio activo Econazol.
Tabla 1. Valores medios y porcentajes de la cantidad de los distintos tamaños de gotas en las emulsiones: (a) convencional; con cristales líquidos (b) sin Miconazol, y (c) con Miconazol.
| Diámetro [µm] | (a) Convencional con Miconazol | (b) Con cristales líquidos sin Miconazol | (c) Con cristales líquidos con Miconazol | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| N° | % | N° | % | N° | % | |
| 0 - 0,5 | 16 | 10,1 | 1 | 0,8 | 1 | 0,8 |
| 0,5 - 1 | 30 | 19 | 112 | 88,2 | 97 | 79,5 |
| 1 - 2 | 49 | 31 | 14 | 11,0 | 24 | 19,7 |
| 2 - 3 | 35 | 22,2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 3 - 4 | 28 | 17,7 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Figura 4. Imágenes obtenidas por microscopia de luz polarizada a 48 horas de preparadas de: (a) Emulsión preparada por el método convencional con Miconazol; emulsiones con formación de cristales líquidos (b) sin Miconazol y (c) con Miconazol.
En la Figura 4 se muestran ejemplos de las imágenes obtenidas de las emulsiones observadas con luz polarizada. En estas imágenes se puede constatar la presencia de estructuras birrefringentes sólo en las muestras (b) y (c), por lo que se verifica la presencia de estructuras líquido-cristalinas en las muestras preparadas por la técnica descripta por Pasquali et al.14. El análisis de las imágenes de los cristales líquidos formados permite caracterizarlos como birrefringentes con la formación de cruces de extinción uniáxicas negativas.
Las muestras se observaron nuevamente al microscopio óptico, tanto convencional como con luz polarizada a los 12 meses de preparadas, constatando la persistencia de las estructuras líquido-cristalinas birrefringentes en las muestras (b) y (c).
En la Figura 5 se muestran ejemplos de las imágenes obtenidas en formato JPG (2048x1536) por microscopia convencional de las emulsiones a los 12 meses de preparadas.
Figura 5. Imágenes obtenidas por microscopia convencional a los 12 meses de preparadas de: (a) Emulsión preparada por el método convencional con Miconazol; Emulsiones con cristales líquidos (b) sin Miconazol y (c) con Miconazol.
Figura 6. Imágenes obtenidas por microscopia de luz polarizada a los 12 meses de preparadas: (a) Emulsión preparada por el método convencional con Miconazol; emulsiones con formación de cristales líquidos (b) sin Miconazol y (c) con Miconazol.
En la Figura 6 se muestran ejemplos de las imágenes obtenidas de las emulsiones observadas con luz polarizada a los 12 meses de preparadas. En estas imágenes se puede constatar la presencia de estructuras birrefringentes sólo en las muestras (b) y (c), por lo que se verifica la presencia de estructuras líquido-cristalinas en las muestras a los 12 meses de su preparación utilizando la técnica descripta por Pasquali et al.14.
Discusión
Mediante el análisis de las imágenes obtenidas por microscopia convencional se observó que en la emulsión convencional los glóbulos de la fase interna son mayores a los que presentan las emulsiones con cristales líquidos. La presencia de gotas secundarias en las formulaciones con estructuras líquido-cristalinas coincidió con lo descripto por Pasquali et al.14 en este tipo de preparados.
El análisis de las imágenes obtenidas por microscopia de polarización, mostró que los cristales líquidos presentes en las emulsiones (b) y (c) poseen la estructura de cruces de extinción uniáxicas negativas características de las fases liotrópicas laminares con texturas cónicas focales17,18.
En un trabajo previo, Lavaselli et al. estudiaron emulsiones con cristales líquidos obtenidas por medio de la misma técnica con los principios activos Econazol16y Terbinafina19, las cuales presentaron cristales líquidos de similares características a los observados en el presente trabajo.
Conclusiones
En base a los resultados obtenidos en este trabajo, se comprueba que el agregado de Miconazol como principio activo no influye en la formación de las estructuras líquido-cristalinas por la técnica empleada. Además, considerando los resultados obtenidos previamente en las preparaciones con Econazol16 y Terbinafina19 se puede inferir que el agregado de estos principios activos no interfiere con la formación de los cristales líquidos, por lo que la fase laminar depende de los componentes utilizados en la formulación y de la técnica empleada para prepararla.
Dado que es fundamental determinar la estabilidad de los sistemas a lo largo del tiempo, se repetirán estos estudios a los 24 meses. También se propone para un trabajo futuro la evaluación de la estabilidad física de los sistemas emulsivos con Miconazol respecto a su comportamiento al ser sometidos a los ensayos de Test de centrifugación, Stress Térmico y Estabilidad acelerada.
