Rápida identificación del 7-dehidrocolesterol en pacientes
con Síndrome de Smith-Lemli-Opitz
E. García-Fuentes, M.I, Vicioso, E. del Castillo.
Servicio de Análisis Clínicos. Hospital Materno-Infantil. Málaga.
Palabras clave: síndrome de Smith-Lemli-Opitz, 7-dehidrocolesterol, colesterol oxidasa, métodos enzimáticos, espectometría ultravioleta.
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Key Words: Smith-Lemli-Opitz syndrome, 7-dehidrocholesterol, cholesterol oxidase, enzymatic assays, ultraviolet epectrometry.
Resumen
El síndrome de Smith-Lemli-Opitz es un trastorno autosómico recesivo caracterizado por unos bajos niveles de colesterol sérico y un acúmulo de su precursor, el 7-dehidrocolesterol. En los pacientes con este síndrome, el método enzimático normalmente utilizado para la medida del colesterol (basados en la colesterol oxidasa) da unos valores falsamente altos. El diagnóstico del síndrome siempre se tiene que confirmar poniendo de manifiesto valores elevados de 7-dehidrocolesterol. Hemos usado un método rápido y simple mediante espectrofotometría ultravioleta para la detección de dicho compuesto. El 7-dehidrocolesterol mostró un espectro ultravioleta característico, con unas absorciones máximas a 271, 282 y 293 nm. Este test parece ser suficientemente sensible para detectar niveles elevados de 7-dehidrocolesterol. Concluimos que la determinación por espectrofotometría ultravioleta del 7-dehidrocolesterol sérico es un método simple y barato para detectar rápidamente el síndrome de Smith-Lemli-Opitz en la mayoría de los laboratorios cínicos.
Summary
Smith-Lemli-Opitz syndrome is an autosomal recessive disorder characterised by a low serum cholesterol levels and an accumulation of his precursor, 7-dehydrocholesterol. The enzymatic method for cholesterol measurement (based on cholesterol oxidase) give falsely high values for serum cholesterol in samples from patients with this syndrome. However, the diagnosis should always be confirmed by demonstrating markedly increased concentration of 7-dehydrocholesterol. We used a simple and rapid method for detection of serum 7-dehydrocholesterol by use of ultraviolet spectrophotometry. 7-dehydrocholesterol showed characteristic ultraviolet spectrum with absorption maxim at 271, 282 and 293 nm. This test appears to be sensitive enough to detect increased levels of 7-dehydrocholesterol. We conclude that ultraviolet spectrophotometry determination of serum 7-dehydrocholesterol is a simple and cheap test to detect the Smith-Lemli-Opitz syndrome rapidly in clinical laboratories.
Recibido: 4-IX-00
Aceptado: 21-III-01
Introducción
El síndrome de Smith-Lemli-Opitz (S-SLO) es un trastorno autosómico recesivo descrito en 1964 por Smith y cols.1. Se caracteriza por múltiples anomalías congénitas. Los rasgos clínicos más típicos son microcefalia, retraso del crecimiento y desarrollo, anomalías faciales (micrognatia, ventanas nasales en anteversión, etc.), malformaciones a nivel genital (criptorquidia, hipospadias, genitales ambiguos, etc.) y en las extremidades (polidactilia, clinodactilia, etc.), defectos cardiacos, catara
tas y otras numerosas anomalías tanto a nivel externo como en los órganos internos2.
La incidencia del S-SLO en la población caucásica de América del Norte se estima en 1:20.000 nacimientos. En España existen menos casos descritos, aproximadamente unos 203,4. ]]>
Recientemente se demostró que en el S-SLO existían unos niveles anormalmente bajos de colesterol y elevados los de su precursor, el 7-dehidrocolesterol [5,7-colestandien-3ß-ol] (7-DHC)5 y el 8-dehidrocolesterol [5,8-colestandien-3ß-ol] (8-DHC)6. Estas anomalías bioquímicas son debidas a un bloqueo de la síntesis del colesterol, exactamente a nivel de la 7-dehidrocolesterol-Δ7-reductasa (7-DHC-Δ7-R), enzima responsable de la reducción del doble enlace C7-8 del 7-DHC (fig. 1)7,8.
Figura 1. Esquema simplificado de la biosíntesis del colesterol a partir de acetato. Las dos rutas señaladas convierten el colesterol, principalmente la de la derecha. El déficit de 7-DHC-A7-reductasa provoca el bloqueo de la biosíntesis del colesterol en los sujetos homozigotos con síndrome de Smith-Lemli-Opitz, con el consiguiente acúmulo de su precursos, el 7-DHC.
El diagnóstico clínico de este síndrome no siempre se puede realizar en base a los rasgos clínicos y muchas veces puede pasar inadvertido. Por esto, y con el objetivo de establecer con certeza la existencia del S-SLO, se necesita del diagnóstico bioquímico de dicho síndrome, el cual se realiza poniendo de manifiesto una importante elevación de los niveles séricos del 7-DHC y 8-DHC. El mejor método para el análisis del 7-DHC es la cromatografía gaseosa/espectrometría de masas (CG/EM)6. Para ello se necesita disponer de un material muy costoso y sofisticado, el cual no se encuentra normalmente en los laboratorios clínicos.
Debido a esto, hemos adaptado un método espectrofotométrico reciente9 muy simple y rápido para la detección cualitativa al ultravioleta (UV) del 7-DHC sérico. El estudio se realizó con el fin de evaluar el uso de la determinación espectrofotométrica del 7-DHC para la detección de este síndrome.
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Material y métodos
Pacientes
Se analizó el suero de un paciente de 5 meses de edad con el diagnóstico clínico de S-SLO y de 80 sujetos (40 niños y 40 adultos) sin los signos y síntomas clínicos típicos de dicho síndrome, alguno de los cuales estaban bajo algunas condiciones clínicas especiales (ictericia, hipercolesterolemia, pancreatitis, insuficiencia renal crónica, traumatismo, etc.). Estas personas fueron incluidas como controles con el fin de observar la posible existencia de algún falso positivo en el método de detección al UV del 7-DHC.
Determinación cualitativa del 7-DHC
El método empleado9 se basa en la obtención del espectro de absorción característico del 7-DHC, el cual muestra unos picos máximos en el UV a 271, 282, y 293 nm10. ]]>
En un primer paso se realiza una extracción de lípidos del suero. Se toma una alícuota de 200 μl de suero en un tubo de cristal, añadiéndosele 6 volúmenes (1.2 ml) de mezcla extractora n-hexano:etanol (5:1, v/v). Tras agitación en vortex durante 30 s, se centrifuga a 3000 r.p.m. durante 1 min. Se recoge la fase superior (n-hexano) y se transfiere a una cubeta de cuarzo de 1 ml para la medida de la absorbancia en el UV en un espectrofotómetro Ultrospec III (Pharmacia LKB, Suecia).
Se realizan medidas consecutivas de la absorbancia en un rango de longitudes de onda comprendido entre 220 y 300 nm, utilizándose n-hexano como blanco de todas las determinaciones. La determinación del cociente entre las absorbancias a 282 y 234 nm se realizó para eliminar la absorbancia de fondo existente a 282 nm, la cual parece ser debida a sustancias que tienen su máxima absorción a 234 nm9.
Determinación del colesterol total
La medida del colesterol total (CT) se realizó mediante un método enzimático (CHOD-PAP, Olimpus Diagnostica, Ireland) en un OLYMPUS AU800. En un primer paso, los ésteres de colesterol son hidrolizados gracias a la colesterol esterasa. Posteriormente la totalidad del colesterol, tanto el libre como el procedente de la hidrólisis, es oxidado mediante la colesterol oxidasa a Δ4-colestenona. El H2O2 producido en esta reacción se determina cuantitativamente gracias a una peroxidasa, la cual transforma la 4-aminofenazona y el fenol en 4-(p-benzoquinona-monoimino)-fenazona, midiéndose este compuesto espectrofotométricamente.
Determinación por cromatografía gaseosa ]]>
La confirmación de los niveles de CT y 7-DHC en el paciente con S-SLO se realizó mediante cromatografía de gases (CG).
Estadística
Los datos se expresan como media ± SD.
Resultados
Análisis cualitativo al UV del 7-DHC ]]>
El espectro de absorción al UV del suero del paciente con S-SLO se muestra en la figura 2. Dicho espectro muestra unos picos de absorción máximos a 271, 282 y 293 nm, los cuales son característicos del 7-DHC (tabla 1).
Fig 2. Espectro ultravioleta obtenido a partir del suero del paciente en S-SLO.
Absorbancia | Absorbancia | Absorbancia | Absorbancia | |
271 nm | 282 nm | 293 nm | 282/234 | |
Paciente S-SLO | 1.121 | 1.170 | 0.794 | 2.88 |
Controles (n=80)* | 0.065 ± 0.028 | 0.061 ± 0.024 | 0.063 ± 0.015 | 0.25 ± 0.07 |
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En la figura 3 se representa el intervalo de espectros obtenidos a partir de los sueros control. En ningún caso se encuentra ni el espectro típico ni los picos máximos propios del 7-DHC.
Figura 3. Intervalo de espectros ultravioleta obtenidos a partir del suero de los controles
Por otro lado, se comprueba que el cociente entre las absorbancia a 282 y 234 nm es muy superior en el paciente objeto de estudio que en los controles (tabla 1).
Análisis enzimático del colesterol ]]>
La tabla 2 nos muestra la concentración de CT determinada por el método enzimático, el cual utiliza la colesterol oxidasa. Para el paciente con S-SLO se observan unas concentraciones bastante inferiores a las obtenidas en los controles de su misma edad.
CT | CT (CG) | 7-DHC (CG) | |
Paciente S-SLO | 40 | 29.2 | 49.2 |
Controles (n=40) | 149 ± 23 * | 100-180** | < 0.3** |
Bibliografía
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