Revista de Osteoporosis y Metabolismo Mineral

Atypical femoral fractures: a rare complication possibly due to the accumulation of rare genetic variants

Genetic study of atypical femoral fractures using exome sequencing in three affected sisters and three unrelated patients

Resumen Objetivos: Las fracturas atípicas de fémur (FAF) son un tipo de fracturas poco frecuentes, a menudo relacionadas con un tratamiento prolongado con bisfosfonatos (BPs). Actualmente no se conocen con exactitud sus mecanismos patogénicos y no hay pruebas para identificar aquellos pacientes con un alto riesgo de sufrir una FAF. El objetivo de este trabajo es investigar las bases genéticas de las FAFs. Material y métodos: Se secuenció el exoma completo de 3 hermanas y de 3 pacientes adicionales no relacionadas, todas tratadas con BPs durante más de 5 años. Se seleccionaron variantes compartidas por las hermanas, de baja frecuencia y potencialmente patogénicas, y se construyó una red de interacciones de genes y proteínas con los datos hallados. Resultados: Identificamos 37 variantes raras (en 34 genes) compartidas por las 3 hermanas, algunas de ellas no descritas anteriormente. La variante más llamativa fue la mutación p.Asp188Tyr en el enzima geranilgeranil pirofosfato sintasa (codificada por el gen GGPS1), de la vía del mevalonato y esencial para la función del osteoclasto. Otro hallazgo interesante fueron dos mutaciones (una en las 3 hermanas y una en una paciente no relacionada) en el gen CYP1A1, implicado en el metabolismo de los esteroides. Identificamos otras variantes que también podrían estar involucradas en la susceptibilidad a las FAFs o en el fenotipo osteoporótico subyacente, tales como las presentes en los genes SYDE2, NGEF. COG4 y la FN1. Conclusiones: Nuestros datos son compatibles con un modelo donde la acumulación de variantes de susceptibilidad podría participar en la base genética de las FAFs.

Abstract Objectives: Atypical femoral fractures (AFF) are rare, often related to long-term bisphosphonate (BPs) treatment. Their pathogenic mechanisms are not precisely known and there is no evidence to identify patients with a high risk of AFF. The aim of this work is to study the genetic bases of AFFs. Materials and methods: Whole-exome sequencing was carried out on 3 sisters and 3 unrelated additional patients, all treated with BPs for more than 5 years. Low frequency, potentially pathogenic variants shared by the 3 sisters, were selected, were selected and a network of gene and protein interactions was constructed with the data found. Results: We identified 37 rare variants (in 34 genes) shared by the 3 sisters, some not previously described. The most striking variant was the p.Asp188Tyr mutation in the enzyme geranylgeranyl pyrophosphate synthase (encoded by the GGPS1 gene), from the mevalonate pathway and essential for osteoclast function. Another noteworthy finding was two mutations (one in the 3 sisters and one in an unrelated patient) in the CYP1A1 gene, involved in the metabolism of steroids. We identified other variants that could also be involved in the susceptibility to AFFs or in the underlying osteoporotic phenotype, such as those present in the SYDE2, NGEF, COG4 and FN1 genes. Conclusions: Our data are compatible with a model where the accumulation of susceptibility variants could participate in the genetic basis of AFFs.

Functional studies of DKK1 variants present in the general population

Resumen Objetivos: En las últimas décadas se han identificado genes asociados a la masa ósea y al riesgo de fractura osteoporótica, varios de los cuales pertenecen a la vía de Wnt. En este proyecto se estudió la funcionalidad de 7 mutaciones de cambio de sentido del gen DKK1 –un inhibidor de la vía de Wnt– presentes en la población general. Material y métodos: Se realizaron estudios in vitro del gen reportero luciferasa para medir la actividad de la vía de Wnt en presencia o ausencia de DKK1 silvestre o mutada, y estudios de western blot, para evaluar si las distintas mutaciones afectan a su síntesis y/o a su estabilidad. Resultados: La proteína DKK1 con la variante p.Ala41Thr presenta menor actividad inhibidora de la vía en comparación con la proteína silvestre. También se observaron diferencias significativas entre los experimentos realizados en ausencia de DKK1 y los que incluyen DKK1 con la mutación p.Ala41Thr. Los western blots mostraron que la cantidad de proteína era similar para todas las variantes, tanto las mutadas como la silvestre, por lo que la pérdida de actividad de p.Ala41Thr no parecía deberse a falta de proteína. El resto de las mutaciones no presentaron un comportamiento diferente al de la proteína DKK1 silvestre. Conclusiones: La variante de cambio de sentido p.Ala41Thr de la proteína DKK1, con una frecuencia poblacional de 0,013%, presenta una pérdida parcial de su función inhibidora, que no es debida a la falta de expresión de ésta. Esta variante génica podría conllevar un aumento de la densidad mineral ósea en las personas de la población general portadoras de esta mutación.

Abstract Objectives: In recent decades, genes associated with bone mass and osteoporotic fracture risk have been identified, several of which belong to the Wnt pathway. In this project, the functionality of 7 missense mutations of the gene DKK1 –an inhibitor of the Wnt pathway– present in the general population was studied. Materials and methods: In vitro studies of the luciferase reporter gene were carried out to measure Wnt pathway activity in the presence or absence of wild-type or mutated DKK1, and western blot studies, to evaluate if the different mutations affect its synthesis and/or stability. Results: The DKK1 protein with the p.Ala41Thr variant shows lower pathway inhibitory activity compared to the wild-type protein. Significant differences were also observed between the experiments performed in the absence of DKK1 and those that include DKK1 with the p.Ala41Thr mutation. Western blots showed that the amount of protein was similar for all variants, both mutated and "wild-type, so the loss of p.Ala41Thr activity did not seem to be due to a lack of protein. The rest of the mutations did not show different behavior from that of the wild DKK1 protein. Conclusions: The missense variant p.Ala41Thr of the DKK1 protein, with a population frequency of 0.013%, shows a partial loss of its inhibitory function, which is not due to the lack of expression. This gene variant could lead to an increase in bone mineral density in those people in the general population who carry this mutation.

Bone tissue mechanical strength is independent of age in healthy individuals

Resumen Objetivos: La microindentación de impacto (MII) es una técnica que permite medir in vivo la resistencia tisular mecánica ósea. Se ha demostrado que la MII proporciona información útil sobre la evaluación de enfermedades esqueléticas, pero se desconoce el efecto que la edad puede ejercer sobre la propiedad ósea medida. El objetivo del estudio es analizar la relación entre la edad y la MII. Material y métodos: El índice de Resistencia Mineral Ósea (BMSi), la variable de medición de MII, se midió en 69 mujeres (mediana de edad: 49 años; rango: 30-81 años) y 19 varones (mediana de edad: 34 años; rango: 24-98 años) sanos. La correlación entre BMSi y la edad se analizó mediante regresión lineal. La asociación entre BMSi y edad se evaluó mediante ANOVA tras ajustar por el índice de masa corporal. El posible efecto de depleción estrogénica postmenopáusica sobre el BMSi se estudió comparando el subgrupo de mujeres más jóvenes con las más mayores mediante la prueba t de Student. Resultados: Los análisis de regresión lineal mostraron que la BMSi no se correlaciona con la edad en varones (R2=0,0016, p=0,74) ni en mujeres (R2=0,076, p=0,25). Asimismo, el análisis ajustado de ANOVA no demostró asociación entre la BMSi y la edad ni en varones (p=0,78) ni en mujeres (p=0,73). Finalmente, no se encontraron diferencias entre la BMSi entre las mujeres más jóvenes y las mayores (p=0,8). Conclusiones: La resistencia tisular mecánica ósea en individuos sanos es independiente a la edad y a la depleción estrogénica postmenopáusica.

Summary Objective: Impact microindentation (IMI) is a technique that allows the measurement of mechanicalbone tissue resistance in vivo. IMI has proven to provide useful information on the evaluation of skeletal diseases, but the effect of age on the bone property that is measured by this technique is unknown. This study aims to analyzethe relationship between age and MIH. Materials and methods: Bone Material Strength index (BMSi), IMI’s output variable, was measured in 69 healthy women (median age: 49 years, range: 30-81 years) and 19 healthy men (median age: 34 years, range: 24-98 years). The correlation between BMSi and age was analyzed by linear regression. The association between BMSi and age was evaluated by ANOVA after adjusting for body mass index. The potential effect of postmenopausal estrogenic depletion on BMSi was studied by comparing the younger vs the older subset of women through a t-student test. Results: Linear regression analysis showed that BMSi was not correlated with age in either men (R2=0.0016, p=0.74) or women (R2=0.076, p=0.25). Similarly, the BMI-adjusted ANOVA model revealed a lack of association of BMSi with age in men (p=0.78) and women (p=0.73). Finally, there were not significant differences on BMSi detected between the younger and the older subset of women (p=0.8). Conclusions: Bone tissue mechanical resistance in healthy individuals is independent of age and postmenopausal estrogenic depletion.

Factors secreted by bone cells induce intracellular calcium accumulation and cyclic AMP and activation of ERK 1/2 in prostate cancer cells; evaluation by fluorescence techniques in living cells

Resumen Objetivos: Analizar en células tumorales de próstata los efectos causados por el secretoma de células óseas sobre la proliferación y sobre vías de señalización intracelular relacionadas con la progresión del cáncer de próstata. Material y métodos: Se caracterizaron los efectos de factores secretados presentes en medios condicionados de pre-osteoblastos MC3T3-E1 y osteocitos MLO-Y4 sobre la proliferación de células de adenocarcinoma de próstata metastásicas PC-3 mediante tinción por azul de tripano. Se observó por técnicas de fluorescencia en células vivas los efectos de los medios condicionados por células MC3T3-E1 y MLO-Y4 en moléculas de señalización intracelular implicadas en la progresión tumoral de células de adenocarcinoma de próstata PC-3. Se estudió la acumulación de calcio intracelular utilizando el indicador de calcio fluorescente Fluo-4AM y la generación de AMP cíclico, y la activación de la quinasa ERK 1/2 por Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente (FRET) usando los biosensores EPAC y ERK-NES, respectivamente. Resultados: La estimulación de células PC-3 con medios condicionados de pre-osteoblastos MC3T3-E1 y osteocitos MLO-Y4 indujo aumento en la proliferación de las células de adenocarcinoma PC-3. Los medios condicionados por células óseas causaron también aumento transitorio en la acumulación de calcio intracelular y de la generación de AMP cíclico e incrementaron la activación de la quinasa ERK 1/2. Conclusiones: Las células óseas secretan factores activadores de la proliferación y de vías de señalización que favorecen la progresión tumoral de células de cáncer de próstata, sugiriendo que la comunicación cruzada entre estos tipos celulares puede favorecer el desarrollo de nichos metástasicos de cáncer de próstata en el hueso.

Summary Objective: To analyze in prostate tumor cells the effects caused by the secretome of bone cells on proliferation and on intracellular signaling pathways related to the progression of prostate cancer. Materials and methods: The effects of secreted factors present in conditioned media of pre-osteoblasts MC3T3-E1 and osteocytes MLO-Y4 on the proliferation of metastatic prostate adenocarcinoma cells PC-3 were characterized using trypan blue staining. The effects of media conditioned by MC3T3-E1 and MLO-Y4 cells on intracellular signaling molecules involved in the tumor progression of prostate adenocarcinoma cells PC-3 were observed by fluorescence techniques in living cells. The accumulation of intracellular calcium was studied using the fluorescent calcium indicator Fluo-4AM and the generation of cyclic AMP, and ERK 1/2 activation by Fluorescent Resonance Energy Transfer (FRET) using the EPAC and ERK-NES biosensors, respectively. Results: The stimulation of PC-3 cells with conditioned media of pre-osteoblasts MC3T3-E1 and osteocytes MLO-Y4 induced an increase in PC-3 adenocarcinoma cell proliferation. Media conditioned by bone cells also caused a transient increase in intracellular calcium accumulation and generation of cyclic AMP and increased ERK 1/2 activation. Conclusions: Bone cells secrete proliferation-activating factors and signaling pathways that favor the tumor progression of prostate cancer cells, suggesting that cross-communication between these cell types may favor the development of metastatic niches of prostate cancer in the bone.

Isoflavones and bone health

Resumen Los fitoestrógenos representan una familia de componentes derivados de plantas. Tienen una estructura esteroidea y son capaces de actuar en el receptor estrogénico. Poseen propiedades tanto estrogénicas como antiestrogénicas, en función del tejido en el que actúen. Los mecanismos potenciales por los cuales los fitoestrógenos pueden afectar a las actividades celulares se han dividido en efectos genómicos y no genómicos. Los primeros actúan a través de receptores de estrógenos, y estos últimos están mediados por proteínas celulares. El mecanismo de acción de las isoflavonas de soja en el hueso puede considerarse beneficioso, ya que actúan estimulando la actividad de los osteoblastos. Por otra parte, a través del sistema RANK-L/OPG inducen una disminución en la supervivencia y la actividad de los osteoclastos. Este artículo revisa estudios in vitro, en animales y humanos, que involucran a las isoflavonas y la salud ósea con el fin de conocer el efecto que sobre ésta tendrán dichas sustancias en aquellas mujeres postmenopáusicas que las utilizan en el contexto del tratamiento o prevención del síndrome climatérico. En general, la valoración global de los estudios en humanos muestra variabilidad en el diseño, en la variedad de fuentes de isoflavonas, en el tiempo del análisis y en la dosis. Además, es preciso considerar la variabilidad en la biodisponibilidad y el metabolismo de las isoflavonas entre los sujetos. Todo ello dificulta obtener conclusiones consistentes. En conclusión, los resultados arrojan algunos resultados positivos, justificando la necesidad de investigaciones adicionales. Desde un punto de vista clínico, las isoflavonas son utilizadas en aquellas mujeres con síntomas climatéricos que no pueden o no desean realizar terapia hormonal. No estarían indicadas con el objetivo de tratar la osteoporosis, pero aquellas mujeres que las utilizan a las dosis y tiempo adecuados pueden esperar un beneficio en el sentido de mantenimiento de su masa ósea.

Summary Phytoestrogens are a family of plant-derived components that present a steroid structure and can act in the estrogen receptor. They contain both estrogenic and antiestrogenic properties, depending on the tissue in which they act. The potential mechanisms by which phytoestrogens can affect cell activities have been divided into genomic and non-genomic effects. The former act through estrogen receptors, and the latter are mediated by cellular proteins. The active mechanism of soy isoflavones in bone may be beneficial, as they act by stimulating the activity of the osteoblasts. On the other hand, through the RANK-L/OPG system they bring about a decrease in osteoclast survival and activity. This article reviews in vitro studies, in animals and humans, that involve isoflavones and bone health to ascertain how these substances affect those postmenopausal women who use them in treatment or prevention of the climacteric syndrome. In general, the global assessment of human studies shows variability in the design, in the variety of isoflavone sources, in the time of the analysis and in the dose. In addition, the variability in the bioavailability and metabolism of isoflavones between the subjects must be considered. All this makes it difficult to obtain consistent conclusions. To sum up, some positive results justify the need for further research. From a clinical point of view, isoflavones are used in women with climacteric symptoms who cannot or do not wish to undergo hormone therapy. They would not be indicated for treating osteoporosis, but those women who use them at the right doses and time can expect a benefit in maintaining bone mass.

A proposal for reorganizing the world of scientific publications which would save Spain millions of euros

Review of the scientific evidence regarding clinical use of the Trabecular Bone Score (TBS) SEIOMM official position (2018)