Revista de Osteoporosis y Metabolismo Mineral

Papel de la proteína relacionada con la parathormona (PTHrP) en el metabolismo óseo: de la investigación básica a la clínica

Osteoclast generation from RAW 264.7 and PBMC cells. The set up in our lab

Abstract Introduction and objectives: osteoclasts are terminally differentiated giant multinucleated cells derived from the fusion of mononuclear progenitors of the monocyte/macrophage hematopoietic lineage. The objective of our group was to achieve the best method for osteoclast differentiation, from both RAW 264.7 cells and peripheral blood monocytes. Material and methods: RAW 264.7 cells and human PBMCs were differentiated into osteoclasts. Success in differentiation was assessed by TRAP staining. Osteoclast activity was detected by the resorption pits in Corning® Osteo Assay Surface Plates. Results: the optimal cell density for RAW 264.7 cell differentiation was 25,000 cells/cm2 with 30 ng/mL of RANKL for 6 days. Osteoclasts differentiated from PBMCs were observed after 4 weeks with 25 ng/mL M-CSF and 30 ng/mL RANKL. Individual pits or multiple pit clusters were observed on the surface plates. Conclusions: we report optimal conditions for the differentiation of osteoclasts from

Implicación de las conexinas, integrinas y cilio primario en la actividad de las células óseas

Resumen Introducción: los osteocitos son capaces de detectar diferentes señales, transducirlas en respuestas biológicas y trasmitirlas a los osteoblastos y osteoclastos, permitiendo el mantenimiento de la homeostasis ósea. La mecanotransducción ósea es posible gracias a que los osteocitos presentan diferentes estructuras mecanosensoras como las conexinas (Cx), las integrinas, el cilio primario e incluso receptores acoplados a proteínas G como el receptor de la parathormona tipo 1 (PTH1R). Objetivo: analizar la posible interacción de los diferentes elementos mecanosensores de los osteocitos y ver su influencia en la respuesta biológica. Material y métodos: se trabajó con las líneas celulares osteocíticas MLO-Y4 Cx43+/+ (scrambled (SCR) y ARNi α2) y Cx43-/-. Resultados y conclusión: los resultados obtenidos muestran que la Cx43 y la integrina α2 se encuentran involucradas en el aumento de la longitud del cilio primario, afectando potencialmente a su funcionalidad como mecanosensor (SCR vs. ARNi α2, p < 0,0001 SCR vs. Cx43-/- y p < 0,0001 ARNi α2 vs. Cx43-/-). La integrina α2 también influyó en la localización celular de Cx43 promoviendo que esta se encuentre en la membrana plasmática. También se observó que la activación de PTH1R por agonistas como parathormona (PTH) y proteína relacionada con la parathormona (PTHrP) inducen la fosforilación de la quinasa ERK 1/2, y estos efectos podrían verse afectados por la deficiencia en Cx43, pero no parecen ser mediados por el silenciamiento de integrina α2. Finalmente, se observó que la presencia de la Cx43 y de integrina α2 en los osteocitos aumenta su capacidad de adhesión (Cx43+/+ SCR y ARNi α2 vs. CX43-/- p < 0,001 y p = 0,0039) y que la deficiencia en Cx43 provoca un incremento de la mortalidad de estas células (Cx43-/- vs. Cx43+/+ p = 0,0074).

Abstract Background: osteocytes are capable of detecting different signals, transducing them into biological responses and transmitting them to osteoblasts and osteoclasts, allowing the maintenance of bone homeostasis. Bone mechanotransduction is possible because osteocytes have different mechanosensor structures such as connexins (Cxs), integrins, the primary cilium and even receptors coupled to G proteins such as the type 1 parathyroid hormone receptor (PTH1R). Objective: to analyze the possible interaction of the different mechanosensor elements of the osteocytes and to observe their influence on the biological response. Material and methods: we worked with the osteocytic cell lines MLO-Y4 Cx43+/+ (scrambled [SCR] and RNAi α2) and Cx43-/-. Results and conclusion: our results show that Cx43 and integrin α2 are involved in lengthening the primary cilium, potentially affecting its functionality as a mechanosensor (SCR vs RNAi α2, p < 0.0001 SCR vs Cx43-/- and p < 0.0001 RNAi α2 vs Cx43-/-). The α2 integrin also influenced the cellular localization of Cx43, promoting its presence in the plasma membrane. Activation of PTH1R by agonists such as parathyroid hormone (PTH) and parathyroid hormone-related protein (PTHrP) was also found to induce ERK 1/2 kinase phosphorylation, and these effects could be affected by Cx43 deficiency, but do not appear to be. mediated by the silencing of α2 integrin. Finally, it was observed that the presence of Cx43 and integrin α2 in osteocytes increases their adhesion capacity (Cx43+/+ SCR and RNAi α2 vs CX43-/- p < 0.001 and p = 0.0039) and that deficiency in Cx43 causes an increase in the mortality of these cells (Cx43-/- vs Cx43+/+ p = 0.0074).

El secretoma de los osteocitos estimulados mecánicamente modula la función de las células mesenquimales

Resumen El esqueleto es un órgano metabólicamente activo que se remodela continuamente a la largo de nuestra vida. Esta remodelación implica un equilibrio entre la formación de hueso llevada a cabo por los osteoblastos y la resorción por los osteoclastos. Los osteocitos son los encargados de regular estos dos procesos y su estimulación mecánica, es esencial para mantener el buen funcionamiento óseo y prevenir enfermedades como la osteoporosis. La estimulación de los osteocitos provoca una alteración en la producción y secreción de moléculas de señalización que regulan la actividad de los osteoblastos y los osteoclastos. Las células madre mesenquimales han sido propuestas como posible terapia celular para la regeneración de distintos tejidos, incluido el tejido óseo. Hipotetizamos en el presente estudio que el secretoma de células osteocíticas de ratón estimuladas mecánicamente afecta a la capacidad proliferativa, adhesiva y a la expresión génica de células mesenquimales indiferenciadas y células mesenquimales preosteoblásticas. Para ello, se analizaron los procesos biológicos mencionados en líneas continuas celulares preosteoblásticas y células mesenquimales de ratón en presencia del medio condicionado por células osteocíticas MLO-Y4, después de ser sometidas a estímulo mecánico por flujo de fluido. Se observó que la proliferación aumentó en ambas líneas celulares en presencia del secretoma de osteocitos estimulados mecánicamente frente al control, mientras que osteocitos no mecanoestimulados provocaban su disminución. También se observó un aumento en la capacidad adhesiva de células C3H/10T1/2 tras la estimulación con el secretoma de osteocitos mecanoestimulados. En cuanto a la expresión de genes, solo el factor adipogénico PPARᵞ sufrió alteraciones en células MC3T3-E1 por el secretoma de osteocitos. Estos estudios indican que los osteocitos pueden modificar el comportamiento biológico de células mesenquimales mediante la secreción de factores solubles.

Abstract The skeleton is a metabolically active organ that is continuously remodeled throughout our lives. This remodeling entails a balance between the formation of bone conducted by the osteoblasts and resorption by osteoclasts. Osteocytes regulate these two processes and their mechanical stimulation is essential to maintain the good functioning of bones and prevent diseases such as osteoporosis. Osteocyte stimulation causes an alteration in the production and secretion of signaling molecules that regulate osteoblast and osteoclast activity. Mesenchymal stem cells have been proposed as a possible cellular therapy for the regeneration of different tissues including bone tissue. We hypothesize in the present study that the secretome of mechanically stimulated osteocytic mouse cells affect the proliferative, adhesive capacity and gene expression of undifferentiated mesenchymal cells and preosteoblastic mesenchymal cells. To that end, the above-mentioned biological processes were analyzed in continuous preosteoblastic cellular lines and mouse mesenchymal cells in the presence of the medium conditioned by MLO-Y4 osteocytic cells after undergoing a mechanical stimulus by fluid flow. It was observed that proliferation increased in both cellular lines in the presence of secretome of mechanically stimulated osteocytes versus control while non-mechanically stimulated osteocytes caused its reduction. It was also possible to observe an increased adhesive capacity of C3H/10T1/2 cells after stimulation with the secretome of mechanically stimulated osteocytes. Regarding gene expression, only the adipogenic factor PPARᵞ underwent alterations in MC3T3-E1 cells by the secretome of osteocytes. These studies indicate that osteocytes can modify the biological behavior of mesenchymal cells by the secretion of soluble factors.

Estudios de asociación de genoma completo (GWAS) versus validación funcional: reto de la era post-GWAS

Resumen En los últimos años se han dedicado muchos esfuerzos a la determinación de variantes y genes que pueden ser importantes en la determinaación de la densidad mineral ósea (DMO) y, a su vez, en diversas patologías óseas. Para conseguir esto, la aproximación que ha presentado mayores éxitos ha sido la de los estudios de asociación de genoma completo (GWAS). En particular, en la investigación sobre la biología ósea, se han publicado más de 50 grandes GWAS o metaanálisis de GWAS identificando más de 500 loci genéticos asociados con diferentes parámetros óseos como son la DMO, la resistencia ósea y el riesgo de fractura. Si bien el descubrimiento de las variantes asociadas es un aspecto esencial, es igualmente importante la validación funcional de dichas variantes para dilucidar su efecto y la relación causal que tienen con la enfermedad genética. Al tratarse de un aspecto mucho más lento y tedioso, se ha convertido en el nuevo reto de esta era post-GWAS. Entre los genes que ya se han abordado se incluyen varios de la vía de WNT y en especial el gen SOST, que juega un papel muy importante tanto en la determinación de la DMO poblacional como en enfermedades monogénicas con elevada masa ósea y que ha dado lugar a un nuevo tratamiento contra la osteoporosis. En esta revisión recogemos los principales estudios GWAS con relación a fenotipos del hueso, así como algunos ejemplos de validaciones funcionales para analizar las asociaciones encontradas en los mismos.

Abstract Over the past few years, efforts have been made to determine the variants and genes that may be important to determine bone mineral density (BMD) that, at the same time, are involved in several bone diseases. To achieve this, the approach that has been the most successful of all has been genome-wide association studies (GWAS). In particular, in research on bone biology over 50 different large GWAS or GWAS metanalyses have been published identifying a total of 500 genetic loci associated with different bone parameters such as BMD, bone resistance, and risk of fracture. Although the discovery of associated variants is an essential aspect, the functional validation of such variants is equally important to elucidate their effect, as well as the causal correlation they have with genetic disease. Since it is a much more time consuming and tedious aspect it has become the new challenge of this post-GWAS era. Among the genes that have already been studied several Wnt signaling pathway genes have been included, among them, the SOST gene that plays a crucial role both determining the BMD of the population and monogenic diseases with elevated bone mass giving rise to a new therapy against osteoporosis. In this review we’ll be collecting the main GWAS associated with bone phenotypes, as well as some functional validations undertaken to analyze the associations found in them.

Revista de Osteoporosis y Metabolismo Mineral

Papel de la proteína relacionada con la parathormona (PTHrP) en el metabolismo óseo: de la investigación básica a la clínica

Osteoclast generation from RAW 264.7 and PBMC cells. The set up in our lab

Implicación de las conexinas, integrinas y cilio primario en la actividad de las células óseas

El secretoma de los osteocitos estimulados mecánicamente modula la función de las células mesenquimales

Estudios de asociación de genoma completo (GWAS) versus validación funcional: reto de la era post-GWAS

Tibia en sable