Revista de Osteoporosis y Metabolismo Mineral

Osteonecrosis of the jaw: lights and shadows in the knowledge of its pathophysiology

The Wnt/β-catenin pathway decreases the amount of osteoclasts in the bone and promotes its apoptosis

Resumen La activación de la señalización de Wnt/βcatenina en células del linaje osteoblástico conduce a un aumento en la masa ósea a través de un mecanismo dual: por una parte, aumentando la osteoblastogénesis, y por otra, disminuyendo la osteoclastogénesis. El predominio de un mecanismo sobre otro depende del estado madurativo del osteoblasto en el que produzca la acumulación de βcatenina. La activación de la señalización de Wnt/βcatenina en células del linaje osteoclástico y sus posibles efectos en la regulación de la masa ósea es menos conocida. Estudios previos han demostrado que la ablación condicional de βcatenina en los osteoclastos induce una disminución de la masa ósea asociada a un aumento de los osteoclastos, y este hecho se ha atribuido a un incremento de la osteoclastogénesis. Sin embargo, no se han evaluado otras posibilidades alternativas como que una disminución de la apoptosis normal de los osteoclastos pueda también contribuir al mayor número de los mismos. En este trabajo, para obtener información sobre este hecho, generamos ratones en los que la βcatenina se eliminó selectivamente de las células del linaje de monocito/macrófago utilizando un alelo flanqueado de la βcatenina (Catnb.) junto con la línea de deleción LisozimaMCre (LysMCre). El análisis tridimensional de los huesos de los ratones Catnbf/f;LysM revelaron una disminución significativa del grosor de la cortical femoral, mientras que el hueso trabecular vertebral no se vio afectado. Este fenotipo se asoció con un mayor número de osteoclastos en la superficie ósea. El número de osteoclastos en los cultivos procedentes de los ratones Catnbf/f;LysM fue dos veces mayor que en los cultivos obtenidos de los ratones control. La administración de WNT3a atenuó la formación de osteoclastos inducida por MβCSF y RANKL in vitro. Además, WNT3a promovió la apoptosis de osteoclastos, y este efecto fue contrarrestado, tanto por la presencia de DKK1 como por la ausencia de βcatenina. En conjunto, estos resultados apoyan un efecto autónomo celular de la βcatenina en el osteoclasto, y proporcionan evidencia convincente del papel proapoptótico de βcatenina en estas células.

Summary The activation of Wnt/βcatenin signaling in cells of the osteoblastic lineage leads to an increase in bone mass through a dual mechanism: increasing osteoblastogenesis and decreasing osteoclastogenesis. The predominance of one mechanism over another depends on the maturational state of the osteoblast in which βcatenin accumulation occurs. The activation of Wnt/βcatenin signaling in cells of the osteoclastic lineage and its possible effects on the regulation of bone mass is less known. Previous studies have shown that conditional ablation of βcatenin in osteoclasts induces a decrease in bone mass associated with an increase in osteoclasts, and this fact has been attributed to an increase in osteoclastogenesis. However, other alternative possibilities have not been evaluated, such as that a decrease in the normal osteoclast apoptosis may also contribute to the greater number of osteoclasts. In this paper, to obtain information about this fact, we generated mice in which βcatenin was selectively eliminated from cells of the monocyte/macrophage lineage using an allele flanked by βcatenin (Catnb.) together with the deletion line LisozimaMCre (LysMCre). The threeβdimensional analysis of the bones of the Catnbf/f;LysM mice revealed a significant decrease in the thickness of the femoral cortex, while the trabecular bone of the vertebrae was not affected. This phenotype was associated with a greater number of osteoclasts on the bone surface. The number of osteoclasts in the cultures from the Catnbf/f;LysM mice was twice as high as in the cultures obtained from the control mice. The administration of WNT3a attenuated the osteoclast formation induced by MβCSF and RANKL in vitro. In addition, WNT3a promoted apoptosis of osteoclasts, and this effect was counteracted, both by the presence of DKK1 and by the absence of βcatenin. Taken together, these results support a cellular autonomous effect of βcatenin in the osteoclast, and provide convincing evidence of the proapoptotic role of βcatenin in these cells.

A novel therapeutic target for osteoarthritis: control of cellular plasticity and senescence using connexin43

Resumen Introducción: La artrosis (OA) es una enfermedad musculoesquelética degenerativa que afecta aproximadamente al 13% de la población occidental. A día de hoy no existe un tratamiento eficaz que evite el progreso de la misma o facilite la regeneración del cartílago articular. La conexina43 (Cx43) es una proteína transmembrana que se encuentra en niveles elevados en el cartílago y en la membrana sinovial de pacientes con OA. Esta proteína forma canales que permiten el intercambio de moléculas e iones entre dos células en contacto o entre la célula y su entorno, denominados uniones comunicantes (UCs) y hemicanales, respectivamente. En este estudio se investigó la función de la Cx43 y de las UCs en la degradación del cartílago articular de pacientes con OA. Material y métodos: Se han aislado condrocitos primarios del cartílago de donantes OA y sanos. Se evaluaron los niveles proteicos mediante Western blot, inmunofluorescencia y citometría de flujo. La expresión génica se ha evaluado mediante RT-qPCR, mientras que la comunicación celular se estudió mediante el ensayo scrape loading/dye transfer. La senescencia celular se evaluó midiendo la actividad de la βgalactosidasa mediante citometría celular o microscopía. Resultados: Los resultados obtenidos indican que la sobreactividad de la Cx43 y de la comunicación intercelular a través de UCs detectadas en OA están implicadas con el progreso de la enfermedad al activar procesos de desdiferenciación celular hacia un estado inmaduro y senescencia celular. Utilizando condrocitos en cultivo aislados del cartílago de donantes con OA hemos demostrado que el incremento de la Cx43 activa factores implicados en la transición epitelio-mesénquima (TEM), como el factor de transcripción Twist-1. El incremento en el número de células desdiferenciadas y con altos índices de proliferación celular desencadena en senescencia celular vía p53/p16INK4a, activando el fenotipo secretor asociado a senescencia (SASP, del inglés Senescence-Associated Secretory Phenotype) que incluye la síntesis y liberación de factores inflamatorios como la interleuquina 6 (IL-6). La disminución de los niveles de la Cx43 utilizando pequeñas moléculas como la oleuropeína o técnicas de edición genética como CRISPR/Cas9 revirtió el proceso dando lugar a rediferenciación celular, mejorando el fenotipo celular con incremento en proteínas implicadas en formación del tejido y diminuyendo la síntesis de MMPs y del componente inflamatorio y senescencia. Conclusiones: La disminución de la Cx43 en condrocitos artrósicos restaura regeneración tisular, por activación de rediferenciación celular y disminución de senescencia. Estos resultados corroboran el uso de la Cx43 como una diana terapéutica eficaz para restaurar regeneración del cartílago en pacientes con OA y evitar la progresión de la enfermedad.

Summary Introduction: Osteoarthritis (OA) is a degenerative musculoskeletal disease, which affects approximately the 13% of western population. Nowadays, there is no effective treatment for OA to avoid disease progression or to promote cartilage regeneration. Connexin43 (Cx43) is a transmembrane protein increased in cartilage and synovium from OA patients. Cx43 forms membrane channels that allow the exchange of molecules and ions between two adjacent cells through gap junctions (GJs), or between a cell and its environment through hemichannels. In this study we investigated the involvement of Cx43 and GJ intercellular communication in the degradation of articular cartilage in chondrocytes from patients with OA. Material and methods: Primary chondrocytes were obtained from cartilage from OA and healthy donors. Protein levels were evaluated by western-blot, immunofluorescence and flow cytometry. RNA expression was evaluated by RT-qPCR. A scrape loading/dye transfer assay was used to evaluate cell communication. Cell senescence was analysed by flow cytometry or by light microscopy using βgalactosidase assay. Results: Cx43 and GJs overactivities were correlated with the progression of OA, by promoting chronic cell dedifferentiation and senescence in vitro assays. We found that Cx43 overexpression activates factors involved in epithelial-to-mesenchymal transition, such as Twist-1. Increased levels of dedifferentiated cells, with high rates of cell proliferation, led to cell senescence via p53/p16INK4a, activating the senescence-associated secretory phenotype (SASP) and promoting the synthesis and liberation of inflammatory factors, including the interleukin-6 (IL-6). Cx43 downregulation by using small molecules, such as oleuropein, or by genetic edition with CRISPR technology, led to the chondrocyte redifferentiation and an improved phenotype, with increased synthesis of extracellular matrix proteins such as Col2A1 and downregulating the synthesis of MMPs, inflammation and senescence. Conclusions: Downregulation of Cx43 in OA chondrocytes restores regeneration by activating chondrocyte re-differentiation and decreasing cellular senescence. These results corroborate the use of Cx43 as an effective therapeutic target in order to restore cartilage regeneration and avoid OA progression.

Qualitative and quantitative status of general bone in osteonecrosis of the jaws. Effect of bisphosphonates

Resumen Objetivo: La osteonecrosis de maxilares (ONM) es una enfermedad recientemente descrita cuya etiopatogenia es desconocida, aunque se ha atribuido, entre otras causas, al tratamiento prolongado con bifosfonatos. Sin embargo, mientras que la ONM es una patología localizada, la acción de los bifosfonatos es generalizada, es decir, afecta a todos los huesos. No hay estudios que muestren el estado óseo general de los pacientes con ONM. Con este trabajo hemos querido estudiar en pacientes afectos de ONM dicho estado general mediante medidas cuantitativas y estimaciones cualitativas del hueso por medio de la densidad mineral ósea (DMO) y el trabecular bone score (TBS) y los parámetros ultrasonográficos en el calcáneo (QUS), además de la presencia de otras enfermedades y la toma de fármacos (especialmente los bifosfonatos) en los pacientes con ONM que pudieran participar en su etiopatogenia. Material y método: Estudio observacional y transversal de casos y controles, realizado en 304 pacientes de ambos sexos, en los que el grupo de casos (grupo I) estaba formado por 24 pacientes que habían sufrido una ONM, mientras que el grupo control (grupo II) estaba formado por 280 pacientes que no presentaban ONM y que recibían bifosfonatos desde un mínimo de 5 años por causas diversas. A todos ellos se les realizó una densitometría ósea (DXA, Hologic 4500 Discovery®) en la columna lumbar y en la extremidad proximal del fémur. Además, se les realizó mediciones del TBS en la columna lumbar, así como de los parámetros ultrasonográficos en el calcáneo (Hologic, Sahara®) en el pie dominante (QUS). Resultados: Los pacientes afectos de ONM tenían una mayor comorbilidad que los controles, con una mayor prevalencia de las siguientes enfermedades: diabetes mellitus, cáncer, artritis reumatoide, hipertiroidismo, cardiopatía, arritmias, insuficiencia cardíaca e hipercolesterolemia. Por ello, el consumo de corticoides, (orales e inhalados), anticoagulantes, hipnóticos, bifosfonatos i.v. (zoledronato), y quimioterapia antineoplásica fue también mayor entre los pacientes afectos de ONM que los pacientes controles. Sin embargo, entre los pacientes con ONM el porcentaje que tomaba bifosfonatos orales fue menor. Los valores densitométricos (DMO medida en la columna lumbar L2-L4, cuello femoral y total de cadera) fueron más elevados en los pacientes con ONM en comparación con los de los controles. El TBS no mostró diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos, y los ultrasonidos presentaron valores más elevados de QUI y SOS en los pacientes con ONM que en los controles. La prevalencia de fracturas por fragilidad fue similar en ambos grupos. Conclusiones: Nuestros pacientes afectos de ONM mostraron una mayor comorbilidad y un mayor consumo de fármacos que los pacientes del grupo control, a excepción de bifosfonatos orales. Por otro lado, tanto la DMO como los parámetros ultrasonográficos mostraron valores más elevados en los pacientes con ONM que los controles. Si consideramos la DXA como una técnica medidora de la cantidad de masa ósea, y el TBS y la ultrasonografía de calcáneo técnicas estimadoras de aspectos cualitativos del hueso, podemos suponer que ni la cantidad ni la calidad óseas en general parecen estar afectadas en la ONM, siendo probablemente otro su mecanismo etiopatogénico. Los bifosfonatos orales no parecen estar entre los fármacos que participen en la etiología de la ONM, aunque sí los bifosfonatos más potentes que se administran por vía intravenosa, si bien no pueden considerarse independientemente de la patología subyacente para la cual se administran.

Summary Objetive: Osteonecrosis of the jaw (ONJ) is a recently reported disease whose origin and development are unknown, although prolonged bisphosphonate treatment has been attributed, among other causes. While ONJ is a localized condition, the action of bisphosphonates is widespread and affects all bones. No studies show the general bone status of patients with ONJ. Our study examines the general condition in patients with ONJ using quantitative measurements and qualitative estimates of bone by means of bone mineral density (BMD) and trabecular bone score (TBS) and ultrasound parameters in the calcaneus (QUS), along with other diseases and the taking of drugs (especially bisphosphonates) in patients with ONJ who may be involved in the pathogenesis. Material and method: Observational and cross-sectional study of cases and controls, conducted in 304 patients of both sexes, in which the case group (group I) was formed by 24 patients who had suffered ONJ. The control group (group II) contained 280 patients who did not present ONJ and who received bisphosphonates over at least 5 years for various reasons. All of them underwent bone densitometry (DXA, Hologic 4500 Discovery®) in the lumbar spine and proximal femur. In addition, TBS measurements were made in the lumbar spine, as well as ultrasound parameters in the calcaneus (Hologic, Sahara®) in the dominant foot (QUS). Results: Patients suffering ONJ presented greater comorbidity than controls, with a higher prevalence of diabetes mellitus, cancer, rheumatoid arthritis, hyperthyroidism, heart disease, arrhythmias, heart failure and hypercholesterolemia. Therefore, the consumption of corticosteroids, (oral and inhaled), anticoagulants, hypnotics, bisphosphonates i.v. (zoledronate), and antineoplastic chemotherapy was also higher among patients with ONJ than control patients. However, among the patients with ONJ the percentage taking oral bisphosphonates was lower. Densitometric values (BMD measured in lumbar spine L2-L4, femoral neck and total hip) were higher in patients with ONJ compared to those in controls. The TBS showed no statistically significant differences between the two groups, and the ultrasound showed higher values of QUI and SOS in patients with ONJ than in controls. The prevalence of fragility fractures was similar in both groups. Conclusions: Patients with ONJ in our study presented greater comorbidity and a higher consumption of drugs than the patients in the control group, except for oral bisphosphonates. On the other hand, both BMD and ultrasound showed higher values in patients with ONJ than in controls. If we consider DXA as a technique for measuring the amount of bone mass, and TBS and calcaneal ultrasound estimating qualitative aspects of bone, we could assume that neither bone quantity nor quality in general seems to be affected in ONJ, and that its etiopathogenic mechanism is probably another. Oral bisphosphonates do not appear to be among the drugs involved in ONJ’s origin and development, but the most potent and intravenously administered bisphosphonates are, although they cannot be considered independently of the underlying disease for which they are administered.

Osteogenic cells affected by soluble tumor factors contribute to bone pre-metastatic niche formation

Resumen Objetivo: Analizar el efecto de los secretomas de tumores sólidos organotrópicos hacia el hueso en células de linaje osteogénico, de tipo osteoblástico y osteocítico, en la expresión de genes relacionados con el metabolismo óseo. Material y método: Caracterizamos los cambios en expresión génica por PCR cuantitativa a tiempo real del eje OPG/RANKL, así como de otros genes relacionados con la diferenciación osteoblástica como son Runx2 y osteocalcina, inducidos por los medios condicionados de células tumorales prostáticas, mama y melanoma en pre-osteoblastos MC3T3-E1 y osteocitos MLO-Y4 murinos o en osteoblastos humanos, según correspondiese por especie. Resultados: La estimulación de las células osteocíticas con medios condicionados de células de melanoma o adenocarcinoma prostático indujo un incremento en la expresión génica de OPG y también de RANKL, viéndose incrementado la ratio OPG/RANKL. Únicamente el secretoma de las células de adenocarcinoma prostático alteró la expresión de Runx2 en osteocitos. Los medios condicionados de células de cáncer de mama modificaron únicamente la expresión de RANKL en células osteoblásticas, viéndose disminuido la ratio OPG/RANKL. Conclusión: Los factores solubles tumorales tienen como diana celular a las células osteocíticas, favoreciendo la inducción de un nicho pre-metastásico óseo por modificación de la ratio OPG/RANKL en el entorno óseo, y, con ello, la progresión de tumores organotrópicos óseos como son el melanoma y adenocarcinomas prostático.

Summary Objective: To analyze the effect of the secrets of solid organotropic tumors towards bone in osteogenic, osteoblastic and osteocytic lineage cells, in the expression of genes related to bone metabolism. Material and method: We characterize the changes in gene expression by quantitative real-time PCR of the OPG/RANKL axis, as well as other genes related to osteoblastic differentiation such as Runx2 and osteocalcin, induced by the conditioned means of prostate tumor cells, breast and melanoma in pre MC3T3-E1 osteoblasts and murine MLO-Y4 osteocytes or in human osteoblasts, as appropriate by species. Results: Stimulation of osteocitic cells with conditioned means of melanoma or prostate adenocarcinoma cells induced an increase in OPG and RANKL gene expression, with the OPG/RANKL ratio being increased. Only the secretome of prostate adenocarcinoma cells altered the expression of Runx2 in osteocytes. Conditioned media of breast cancer cells only modified the expression of RANKL in osteoblast cells, with a decrease in OPG/RANKL ratio. Conclusion: Soluble tumor factors have osteocitic cells as their cellular target, favoring the induction of a pre-metastatic bone niche by modifying the OPG/RANKL ratio in the bone environment, and, thus, the progression of bone organotropic tumors such as melanoma and prostatic adenocarcinomas.

Metastatic transverse vertebral fracture due to lung cancer

Vitamin D and heart failure. Pathophysiology, prevalence, and prognostic association