International Microbiology

Opportunities for microbiologists in an emerging industry

IS200: an old and still bacterial transposon

IS200 is a mobile element found in a variety of eubacterial genera, such as Salmonella, Escherichia, Shigella, Vibrio, Enterococcus, Clostridium, Helicobacter, and Actinobacillus. In addition, IS200-like elements are found in archaea. IS200 elements are very small (707-711 bp) and contain a single gene. Cladograms constructed with IS200 DNA sequences suggest that IS200 has not spread among eubacteria by horizontal transfer; thus it may be an ancestral component of the bacterial genome. Self-restraint may have favored this evolutionary endurance; in fact, unlike typical mobile elements, IS200 transposes rarely. Tight repression of transposase synthesis is achieved by a combination of mechanisms: inefficient transcription, protection from impinging transcription by a transcriptional terminator, and repression of translation by a stem-loop mRNA structure. A consequence of IS200 self-restraint is that the number and distribution of IS200 elements remain fairly constant in natural populations of bacteria. This stability makes IS200 a suitable molecular marker for epidemiological and ecological studies, especially when the number of IS200 copies is high. In Salmonella enterica, IS200 fingerprinting is extensively used for strain discrimination.

IS200 es un elemento móvil presente en una variedad de géneros de eubacterias como Salmonella, Escherichia, Shigella, Vibrio, Enterococcus, Clostridium, Helicobacter y Actinobacillus. También se encuentran elementos similares a IS200 en arqueas. Los elementos IS200 son muy pequeños (707-711 pb) y contienen un solo gen. Los cladogramas construidos a partir de las secuencias de DNA de IS200 sugieren que este elemento no ha sufrido transferencia horizontal dentro de las eubacterias; por tanto, IS200 puede ser un componente ancestral del genoma bacteriano. La longevidad evolutiva de IS200 puede haber sido favorecida por su baja frecuencia de transposición, que contrasta con el comportamiento de muchos elementos móviles. En IS200, la síntesis de transposasa está reprimida por varios mecanismos: transcripción ineficaz, terminación de los transcritos iniciados en promotores foráneos y represión de la traducción por una estructura secundaria (“tallo-lazo”) de mRNA. Como consecuencia de este autocontrol, tanto el número como la distribución de elementos IS200 se mantienen relativamente constantes en las poblaciones naturales de bacterias. Esta estabilidad convierte a IS200 en un marcador adecuado para estudios epidemiológicos o ecológicos, especialmente cuando el número de copias de IS200 es alto. En Salmonella enterica, los perfiles de IS200 se usan habitualmente para la tipificación y discriminación de cepas.

IS200 é um elemento móvel presente em uma variedade de genêros de eubactérias como Salmonella, Escherichia, Shigella, Vibrio, Enterococcus, Clostridium, Helicobacter e Actinobacillus. Adicionalmente, elementos similares a IS200 também são encontrados em arquéas. Os elementos IS200 são muito pequenos (707-711 pb), e contém somente um gene. Os cladogramas construidos à partir das sequências de DNA de IS200 sugerem que esse elemento não deve ter sofrido transferência horizontal dentre as eubactérias; porisso os elementos IS200 podem ser componentes ancestrais do genoma bacteriano. A longevidade evolutiva de IS200 pode ter sido favorecida devido a sua baixa frequência de transposição, o que contrasta com o comportamento de muitos elementos móveis. Em IS200 a síntese de transposase está reprimida por uma combinação de mecanismos: transcrição ineficiente, proteção da transcrição devido a presença de seqüências de término transcricional, e repressão da tradução por uma estrutura secundária tipo alça de mRNA. Como consequência deste autocontrole, tanto o número como a distribuição de elementos IS200, foram mantidos relativamente constantes nas populações naturais de bactérias. Essa estabilidade converte o elemento IS200 em um marcador adequado para estudos epidemiológicos ou ecológicos, especialmente quando o número de cópias de IS200 é alto. No caso de Salmonella enterica, os perfis de IS200 tem sido usados habitualmente para a tipificação e discriminação de estirpes.

Competition for polymers among heterotrophic bacteria, isolated from particles of the Equatorial Atlantic

Three heterotrophic bacterial strains, isolated from organic particles of the upper water column of the Equatorial Atlantic, taken during a cruise on the R/V METEOR (1997), were investigated concerning their physiological and phylogenetic properties using classic microbiological and modern molecular-biological methods. All isolates are gram-negative rods able to use polymers such as cellulose, chitin or starch as sole carbon source. The phylogeny of these isolates was investigated by fluorescence in situ hybridization (FISH) and 16S rDNA sequencing. The three isolated strains belong to the Cytophaga/Flavobacteria, γ-Proteobacteria (Marinobacter sp.), and α-Proteobacteria (Sulfitobacter pontiacus). In order to study succession during growth on polymers naturally occurring in marine habitats, FISH was used as a new approach to detect cells from different phylogenetic clusters in the course of a single growth experiment. Mixed cultures consisting of the isolated strains in equal amounts were incubated with cellulose, chitin or starch. Isolate 4301-10/2, a member of the γ-Proteobacteria, dominated in mixed cultures growing on cellulose, chitin, or starch after only 10 days, with 55, 60, and 95%, respectively, of cells hybridizing with 4΄,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).

Tres cepas de bacterias heterótrofas, aisladas de partículas orgánicas de la parte superior de la columna de agua del Atlántico ecuatorial, tomadas durante un crucero con el R/V Meteor (1997), fueron investigadas respecto a sus propiedades fisiológicas y filogenéticas usando tanto técnicas microbiológicas clásicas como métodos moleculares modernos. Todas las cepas aisladas son bacilos Gram-negativos con capacidad de usar polímeros como celulosa, quitina o almidón como única fuente de carbono. La filogenia de estas cepas se investigó mediante hibridación in situ por fluorescencia (FISH) y secuenciación del rDNA 16S. Las tres cepas aisladas pertenecen a las Cytophaga/Flavobacterias, las γ-Proteobacterias (Marinobacter sp.), y las α-Proteobacterias (Sulfitobacter pontiacus). Para estudiar la sucesión a lo largo del crecimiento con polímeros presentes de forma natural en ambientes marinos, se usó FISH para detectar las células de diferentes grupos filogenéticos a lo largo de un experimento de crecimiento. Cultivos mixtos consistentes en las cepas aisladas en cantidades iguales se incubaron con celulosa, quitina o almidón. Transcurridos sólo 10 días, la cepa 4301-10/2, que es una γ-Proteobacteria, dominσ los cultivos mixtos con celulosa, quitina o almidσn, con el 55, 60 y 95%, respectivamente, de las cιlulas hibridadas con 4´,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).

Três estirpes de bactérias heterotróficas, isoladas de partículas orgânicas na parte superior da coluna d´água no Atlântico Equatorial, coletadas durante um cruzeiro com o R/V Meteor (1997), foram estudadas quanto as suas propriedades fisiológicas e filogenéticas usando técnicas microbiológicas clássicas e métodos moleculares modernos. Todas as estirpes isoladas são bacilos Gram negativos e que tem a capacidade de utilizar polímeros como celulose, quitina ou amido como única fonte de carbono. A filogênia das estirpes foi estudada através a hibridização in situ por fluorescência (FISH) e sequênciamento de rDNA 16S. As três estirpes isoladas pertencem aos grupos Cytophaga/Flavobactérias, γ-Proteobactιrias (Marinobacter sp.), e α-Proteobactιrias (Sulfitobacter pontiacus). Visando estudar a sucessγo das espécies durante o crescimento com polímeros presentes de forma natural nos ambientes marinhos, foi utilizada a técnica de FISH para detectar as células de grupos filogenéticos distintos, em experimento de crescimento. Cultivos mixtos constituidos das estirpes isoladas em quantidades iguais foram incubadas com celulose, quitina ou amido. Após somente 10 dias, a estirpe 4301-10/2, que é uma γ-Proteobactéria, dominou os cultivos mixtos com celulose, quitina ou amido perfazendo 55, 60 e 95% das células hibridizadas com 4´, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).

Distribution of phototrophic populations and primary production in a microbial mat from the Ebro Delta, Spain

Microbial mats arising in the sand flats of the Ebro Delta (Tarragona, Spain) were investigated during the summer season, when the community was highly developed. These mats are composed of three pigmented layers of phototrophic organisms, an upper brown layer mainly composed of Lyngbya aestuarii and diatoms, an intermediate green layer of the cyanobacterium Microcoleus chthonoplastes, and an underlying pink layer of a so-far unidentified purple sulfur bacterium. In the photic zone, oxygenic phototrophs constitute about 58% of total photosynthetic biomass, measured as biovolume, and anoxygenic phototrophs represent 42%. Diatoms constitute 11.8% of the oxygenic biomass, M. chthonoplastes 61.2%, and L. aestuarii and coccoid cyanobacteria 20.6 and 6.4%, respectively. In this laminated community, organic matter has an autochthonous origin, and photosynthesis is the most important source of organic carbon. Oxygen production reaches up to 27.2 mmol O2 m-2 h-1, measured at 1000 µE m-2 s-1 light intensity, whereas oxidation of sulfide in the light has been calculated to be 18.6 mmol S m-2 h-1. This amount represents 26% of the total photosynthetic production in terms of photoassimilated carbon, demonstrating the important role of anoxygenic phototrophs as primary producers in the pink layer of Ebro Delta microbial mats.

Los tapetes microbianos que se establecen en los sedimentos litorales del delta del Ebro (Tarragona, España) fueron investigados durante el verano, cuando la comunidad estaba muy desarrollada. Dichos tapetes se componen de tres capas pigmentadas, con diferentes organismos fotótrofos. La capa superior es de color marrón y está compuesta principalmente por Lyngbya aestuarii y diatomeas. Debajo de ésta, se observa una capa intermedia de color verde, donde predomina la cianobacteria Microcoleus chthonoplastes. Finalmente, por debajo de las dos anteriores se ve una lámina rosa, en la que el organismo fototrófico dominante es una nueva bacteria roja del azufre no identificada hasta este momento. En la zona fótica, los organismos fototróficos oxigénicos representan un 58% de la biomasa fotosintética total, medida ésta como biovolumen; el 48% restante corresponde a los organismos fotótrofos anoxigénicos. En relación a la biomasa oxigénica, las diatomeas constituyen un 11,8% del total, mientras que M. chthonoplastes, L. aestuarii y las cianobacterias cocoides representan un 61,2%, un 20,6% y un 6,4%, respectivamente. En esta comunidad multilaminada, la materia orgánica es de origen autóctono y la fotosíntesis es la principal fuente de carbono orgánico. La producción de oxígeno alcanza los 27,2 mmol O2 m-2 h-1 medida a una intensidad de luz de 1000 µE m-2 s-1. Mientras que la oxidación de sulfuro a la luz es de 18,6 mmoles S m-2 h-1. Esta última cantidad representa un 26% de la producción fotosintética total, expresada como C fotoasimilado, lo cual pone de manifiesto el papel destacado de las bacterias fototrofas anoxigénicas como productores primarios en la capa roja de los ecosistemas estudiados).

Os tapetes microbianos que se estabeleceram nos sedimentos litorâneos do Delta do Ebro (Tarragona, Espanha) foram investigados durante o verão, quando a comunidade estava altamente desenvolvida. Esses tapetes são compostos por três laminas pigmentadas, caracterizadas pela presença de diferentes organismos fototróficos. A lamina superior tem coloração marrom e está composta principalmente por Lyngbya aestuarii e diatomáceas. Na próxima camada, observa-se uma capa de coloração verde onde predomina a cianobactéria Microcoleus chthonoplastes. Finalmente, na camada inferior encontra-se uma lâmina rosa, na qual o organismo fototrófico dominante é uma nova bactéria púrpura sulfurosa, ainda não identificada. Na zona fótica, os organismos fototróficos oxigênicos representan cêrca de 58% da biomasa fotossintética total, medida em têrmos de biovolume, e os restantes 48% correspondem aos organismos fototróficos anoxigênicos. Com relação à biomasa oxigênica, as diatomáceas constituem cêrca de 11,8% do total, enquanto que M. chthonoplastes, L. aestuarii e as cianobactérias cocoides representam 61,2%, 20,6% e 6,4%. Nesta comunidade multilaminada, a matéria orgânica é de origem autóctone, sendo a fotossíntese a principal fonte de carbono orgânico. A produção de oxigênio alcança 27,2 mmol O2 m-2 h-1 medida à 1000 µE m-2 s-1. Enquanto que a oxidação de enxôfre na luz é de aproximadamente 18.6 mmoles m-2 h-1. Esse último valor representa cêrca de 26% da produção fotossintética total, expressa em têrmos de C fotoassimilado, o que coloca em evidência o papel relevante das bactérias fototróficas anoxigênicas como produtores primários na camada roseada dos ecossistemas estudados.

**Nucleotide sequence and expression of the ncr nickel and cobalt resistance in Hafnia alvei 5-5**

The structural genes for the nickel and cobalt resistance of the conjugative plasmid pEJH 501 of Hafnia alvei 5-5, contained on a SalI-EcoRI fragment of 4.8 kb, were cloned and sequenced. The DNA sequence included five genes in the following order: ncrA, ncrB, ncrC, ncrY, and ncrX. The predicted amino acid sequences of ncrA were homologous to the amino acid sequences of nreB of Achromobacter xylosoxidans 31A. Expression of ncr with the T7 RNA polymerase-promoter system allowed Escherichia coli BL21 (DE3) to overexpress NcrA, NcrB, and NcrC but not NcrY, and NcrX. The apparent molecular masses of NcrA, NcrB, and NcrC were 30, 33, and 17 kDa, respectively. Primer-extension analysis showed that ncr mRNA started at nucleotide position 23 upstream from ncrA. The promoter region of the ncr operon possessed a strong, putative -35 element of ð32-type promoter sequence, and transcriptional 'lacZ fusion studies indicated that the -35 element influenced ð32-specific transcription.

Los genes estructurales de la resistencia a níquel y cobalto del plásmido conjugativo pEJH 501 de Hafnia alvei 5-5, contenido en un fragmento SalI-EcoRI de 4,8 kb, fueron clonados y secuenciados. La secuencia de DNA incluye cinco genes en el siguiente orden: ncrA, ncrB, ncrC, ncrY, y ncrX. Las secuencias de aminoácidos equivalentes a ncrA fueron homólogas a las secuencias de aminoácidos codificadas por nreB en Achromobacter xylosoxidans 31A. La expresión de los genes ncr mediante el sistema promotor de la RNA polimerasa T7 permite a Escherichia coli BL21 (DE3) sobreexpresar NcrA, NcrB, y NcrC, pero no NcrY ni NcrX. Los pesos moleculares aparentes de NcrA, NcrB y NcrC fueron 30, 33, y 17 kDa, respectivamente. El análisis de extensión de los cebadores mostró que el mRNA de ncr se iniciaba a una distancia de 23 nucleótidos corriente arriba del ncrA. La región promotora del operón ncr posee una fuerte secuencia promotora de tipo ð32 en la posición -35, y estudios transcripcionales de fusión con ´lacZ indicaron que el elemento situado en -35 influye sobre la transcripción específica de ð32.

Os genes estruturais de resistência à níquel e cobalto do plasmídeo conjugativo pEJH 501 de Hafnia alvei 5-5, contido em um fragmento SalI-EcoRI de 4800 pares de bases (pb), foram clonados e sequenciados. A sequência de DNA inclue cinco genes na seguinte ordem: ncrA, ncrB, ncrC, ncrY, e ncrX. As sequências de aminoácidos equivalentes à ncrA foram homólogas às sequências de aminoácidos codificadas para nreB em Achromobacter xylosoxidans 31A. A expressão dos genes de ncr mediante o sistema promotor da RNA polimerase T7 permite a Escherichia coli BL21 (DE3) supra-expressar NcrA, NcrB, e NcrC, porém não os genes NcrY e NcrX. Os pesos moleculares aparentes de NcrA, NcrB e NcrC foram 30, 33, e 17 kDa, respectivamente. A análise de extensão de iniciadores mostrou que o mRNA de ncr era iniciado a uma distância de 23 nucleotídeos antes de ncrA. A região promotora do operon de ncr possue uma sequência promotora putativa forte do tipo ð32 na posição -35, e estudos transcricionais de fusão com ´lacZ indicaram que o elemento situado na posição -35 tem influência na transcrição específica ð32.

Cell aggregation: a mechanism of pathogenic Leptospira to survive in fresh water

Transmission of leptospirosis is facilitated by the survival of pathogenic leptospires in moist environments outside their mammalian host. In the present study, the survival mechanisms of Leptospira interrogans serovar Canicola in aqueous conditions and lack of nutrients were investigated. In distilled water, leptospires were able to remain motile for 110 days (pH 7.2). However, when incubated in a semi-solid medium composed of distilled water and 0.5% purified agarose (pH 7.2), they survived 347 days. In this viscous environment, aggregates of live spirochetes were observed. Neither antibiotics (e.g. tetracycline and ampicillin) nor nutrients inhibited leptospiral aggregation. Immunoblot analysis suggested that cells incubated in water down-regulate the expression of LipL31, an inner-membrane protein, but retain expression of other membrane proteins. These studies provide insights into the mechanisms by which pathogenic Leptospira survives for prolonged periods of time in natural aqueous environments, a key stage in the leptospiral lifecycle.

La supervivencia de Leptospira en ambientes húmedos, fuera del mamífero hospedador, facilita la transmisión de la enfermedad. Nosotros estudiamos la supervivencia de Leptospira interrogans serovar Canicola en medios acuosos carentes de nutrientes. En agua destilada (pH 7,2), las leptospiras conservaron la movilidad durante 110 días. Sin embargo, cuando se incubaron en un medio semisólido, compuesto de agua destilada y 0,5% de agarosa purificada, sobrevivieron 347 días. En este medio viscoso se observó que las leptospiras formaban agregados. Ni la presencia de nutrientes ni la de antibióticos (ampicilina o tetraciclina) inhibieron la agregación. El análisis por inmunotransferencia indica que en las leptospiras incubadas en agua disminuye la expresión de la proteína de membrana interna LipL31; no obstante, conservan la expresión de otras proteínas de membrana. Este estudio proporciona una visión de los mecanismos que permiten la supervivencia de las especies patógenas de Leptospira en ambientes acuáticos naturales, un proceso importante en el ciclo natural de la leptospirosis.

A sobrevivência de Leptospira em ambientes úmidos, fora do mamífero hospedeiro, facilita a transmissão da enfermidade. Foi estudada a sobrevivência de Leptospira interrogans sorovar Canicola em meios aquosos carentes de nutrientes. As leptospiras em água destilada (pH 7,2) conservaram a mobilidade durante 110 dias. Quando foram incubadas em um meio semisólido, composto de água destilada adicionada de 0,5% de agarose purificado, as leptospiras sobreviveram 347 dias. Neste meio viscoso se observou que as leptospiras formam agregados. Nem a presença de nutrientes nem a de antibióticos (ampicilina ou tetraciclina) inibiu a agregação. A análise por imunotransferência indica que nas leptospiras incubadas em água há uma diminuição na expressão da proteína da membrana interna Lip L31, apesar de se conservar a expressão de outras proteínas da membrana. Este estudo proporciona uma visão dos mecanismos que permitem a sobrevivência das espécies patógenas de Leptospira em ambientes aquosos naturais, um processo importante no ciclo natural da leptospirose.

Signature sequences in diverse proteins provide evidence for the late divergence of the Order Aquificales

The Aquificales species are presently believed to be the earliest branching lineage within Bacteria. However, the branching order of this group in different phylogenetic trees is highly variable and not resolved. In the present work, the phylogenetic placement of Aquificales was examined by means of a cladistic approach based on the shared presence or absence of definite signature sequences (consisting of conserved inserts or deletions) in many highly conserved and important proteins, e.g. RNA polymerase β (RpoB), RNA polymerase β´ (RpoC), alanyl-tRNA synthetase (AlaRS), CTP synthase, inorganic pyrophosphatase (PPase), Hsp70 and Hsp60. For this purpose, fragments of the above genes that contained the signature regions were cloned from different Aquificales species (Calderobacterium hydrogenophilum, Hydrogenobacter marinus, and Thermocrinis ruber) and the sequence data were compared with those available from all other species. The presence in Aquificales species of distinctive inserts in Hsp70 and Hsp60 that are not found in any Firmicutes, Actinobacteria, or Thermotoga-Clostridium species excluded them from these groups of Bacteria. The shared presence of prominent indels in the RpoB (>100 amino acids), RpoC (>100 amino acids) and AlaRS (4 amino acids) proteins, which are only found in the various Aquificales species, the Chlamydiae, the CFBG (Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroides-green sulfur bacteria) group, and Proteobacteria, strongly suggests their placement within these groups of Bacteria. A specific relationship between Proteobacteria and Aquificales is suggested by the presence in inorganic pyrophosphatase of a 2-amino-acid insert that is uniquely found in these phyla. However, the Aquificales species lacked a number of other protein signatures (e.g. indels in CTP synthase and Hsp70) that are characteristic of Proteobacteria, indicating that they constitute a distinct phylum related to Proteobacteria. These results provide strong and consistent evidence that the Aquificales diverged after the branching of Firmicutes, Actinobacteria, Thermotoga, Deinococcus-Thermus, green nonsulfur bacteria, Cyanobacteria, Spirochetes, Chlamydiae, and CFBG group, but before the emergence of the Proteobacteria.

Actualmente se cree que las especies de Aquificales son las que primero se separaron dentro del dominio Bacteria. No obstante, el orden de ramificación de este grupo no está resuelto y en los diferentes árboles filogenéticos es altamente variable. En este trabajo hemos examinado la posición filogenética de Aquificales mediante un enfoque cladístico basado en la presencia o ausencia de secuencias signatura definidas (consistentes en adiciones o deleciones conservadas) en muchas proteínas importantes y muy conservadas, como son la RNA polimerasa β (RpoB), la RNA polimerasa β´ (RpoC), la alanil-tRNA sintetasa (AlaRS), la CTP sintasa, la pirofosfatasa inorgαnica (PPasa), Hsp70 y Hsp60. Con este objeto, se clonaron fragmentos de los genes de las proteνnas enumeradas que contenνan las regiones signatura provenientes de diferentes especies de Aquificales (Calderobacterium hydrogenophilum, Hydrogenobacter marinus y Thermocrinis ruber) y se compararon las secuencias con las disponibles del resto de las especies. La presencia de insertos distintivos en las proteínas Hsp70 y Hsp60 de las especies de Aquificales, no presentes en ninguna especie de Firmicutes, Actinobacteria o Thermotoga-Clostridium, las excluyen de estos grupos del dominio Bacteria. La presencia compartida de importantes inserciones-deleciones en las proteínas RpoB (>100 aa), RpoC (>100 aa) y AlaRS (4 aa) que sólo se encuentran en varias especies de Aquificales, así como de Clamidias, el grupo CFBG (Cytophaga-Flavobacterias-Bacteroides-Bacterias verdes del azufre) y las Proteobacterias indica su pertenencia a estos grupos de Bacteria. Un inserto de 2 aa en la pirofosfatasa inorgánica, únicamente presente en los genes homólogos de Aquificales y Proteobacterias, parece indicar una relación específica entre estos dos fílums. No obstante, las especies de Aquificales carecen de algunas otras signaturas de proteínas (por ejemplo, los indeles en CTP sintasa y Hsp70) características de las Proteobacterias, lo cual indica que constituyen un fílum separado pero relacionado con las Proteobacterias. Estos resultados prueban intensa y consistentemente que las Aquificales se separaron después de la ramificación de los grupos Firmicutes, Actinobacterias, Thermotoga, Deinococcus-Thermus, Bacterias verdes del azufre, Cianobacterias, Espiroquetas y Clamidias-CFBG, pero antes de la emergencia de las Proteobacterias.

Atualmente acredita-se que as espécies de Aquificales são as que primeiro se separaram dentro do dominio Bacteria. No entanto, a ordem de ramificação deste grupo não está resolvida e é altamente variável nas diferentes árvores filogenéticas. Neste trabalho foi examinada a posição filogenética de Aquificales mediante uma aproximação cladística baseada na presença ou ausência compartilhada de seqüências com assinaturas definidas (representando adições ou deleções conservadas), encontradas em muitas proteinas importantes e altamente conservadas como são a RNA polimerase β (RpoB), a RNA polimerase β' (RpoC), a alanil-tRNA sintetase (AlaRS), a CTP sintase, a pirosfosfatase inorgβnica (PPase), Hsp 70 e Hsp60. Com esse obtetivo foram clonados fragmentos dos genes das proteνnas enumeradas e que continham as regiυes assinatura provenientes de diferentes espιcies de Aquificales (Calderobacterium hydrogenophilum, Hydrogenobacter marinus e Thermocrinis ruber) e comparadas as seqüências com as disponíveis para as demais espécies. A presença de inserções distintas nas proteínas Hsp70 e Hsp60 das espécies de Aquificales as quais não foram encontrados em nenhuma espécie de Firmicutes, Actinobactérias ou Thermotoga-Clostridium, exclue estes grupos do domínio Bacteria. A presença compartilhada de importantes inserções-deleções nas proteínas RpoB (>100 aa), RpoC (>100 aa) e AlaRS (4 aa) em várias espécies de Aquificales assim como de Clamídeas, o grupo CFBG (Cytophaga-Flavobactérias-Bacteroides-Bactérias verdes do enxofre) e as Proteobactérias indica fortemente a inserção dessas espécies nos grupos de Bacteria. Uma adição de 2 aa na pirofosfatase inorgânica, presente unicamente nos genes homólogos de Aquificales e Proteobactérias, parece indicar uma relação específica entre estes dois filos. Entretanto, as espécies de Aquificales não possuem assinatura em algumas proteínas (por exemplo, os indels em CTP sintase e Hsp70) que são características das Proteobactérias indicando que elas constituem um filo distinto, embora relacionado com as Proteobactérias. Estes resultados representam uma forte e consistente evidência de que os Aquificales se divergiram depois da ramificação dos Firmicutes, Actinobactérias, Thermotoga, Deinococcus-Thermus, Bactérias verdes do enxofre, Cianobactérias, Espioquetas e os grupos Clamídeas-CFBG, porém antes do surgimento das Proteobactérias.

Laboratory diagnosis of brucellosis in a rural endemic area in northeastern Spain

Sera obtained from 62 patients from four mountain counties in Catalonia (Northeastern Spain), in whom brucellosis had been diagnosed on the basis of clinical evidence and/or personal history, were analyzed using the rose Bengal test, standard serum agglutination test (SAT), Coombs’ test, ELISA, and complement fixation. The diagnosis was further confirmed through blood cultures. Clinical evidence, epidemiology, and the results from serologic tests were used to assign patients to one of two groups: group 1 (n = 38) patients had primary infections, whereas group 2 (n = 24) patients had been previously exposed to the microorganism, i.e. re-infection of group 2 individuals occurred after long periods of time during which no active infection by Brucella had been detected. Receiving-operating charts (ROC) were used to determine the diagnostic value of the different tests and to establish discriminant values. Blood culture was a valuable diagnostic tool in group 1 (0.92 sensitivity) but was inappropriate in group 2 (0.08). The combination of positive rose Bengal test and agglutination ≥1/160 was valid for diagnosis in group 1. In group 2, agglutination <1/160 (including negative agglutination) did not rule out brucellosis. The combination of positive rose Bengal test and Coombs’ test ≥1/320 was the best diagnostic criterion (0.8 specificity; 1 sensitivity). ELISA (for IgG, IgM, or both) did not improve diagnostic accuracy.

A partir del suero de 62 pacientes de tres comarcas de montaña de Cataluña (noreste de España) con brucelosis según los síntomas clínicos y/o historia personal, se probó el valor diagnóstico de diferentes pruebas tales como el test del rosa de Bengala, el test de aglutinación estándar del suero (SAT), el test de Coombs, el test ELISA y el test de fijación del complemento. Para el diagnóstico se realizaron también cultivos de sangre. Basándose en los síntomas clínicos, los datos epidemiológicos y los resultados de las pruebas serológicas, los pacientes se clasificaron en dos grupos: grupo 1 (38 casos), infectados por primera vez, y grupo 2 (24 casos), cuyos pacientes habían padecido una exposición previa al microorganismo, esto es, individuos reinfectados por Brucella después de un largo período sin infección activa. Para determinar el valor diagnóstico de las diferentes pruebas y establecer valores discriminatorios se utilizó el gráfico “receiving-operating chart” (ROC). El cultivo de sangre fue apropiado para el grupo 1 (sensibilidad 0,92), pero no para el grupo 2 (sensibilidad 0,08). La combinación de los test del rosa de Bengala y de aglutinación (≥1/160), tuvieron valor diagnóstico para el grupo 1. Sin embargo, para el grupo 2 el test de aglutinación (<1/160, se incluyen las aglutinaciones negativas) no fue apropiado para la detección de Brucella. El mejor criterio de diagnóstico de brucelosis fue la combinación del test rosa de Bengala y el test de Coombs (≥1/320; especificidad 0,8 y sensibilidad 1). El test ELISA (con IgG o con IgM, o con ambas) no mejoró el diagnóstico de la enfermedad.

A partir do soro de 62 pacientes, provenientes de três zonas montanhosas da Cataluña (noreste da Espanha), nos quais havia sido diagnosticado brucelose com base nos sintomas clínicos e/ou uma história pessoal, foi testado o valor diagnóstico de diferentes provas tais como: o teste de rosa de bengala, o teste de aglutinação padrão do soro (SAT), teste de Coombs, o teste ELISA e o teste de fixação do complemento. Para o diagnóstico foram realizados também cultivos de sangue. Com base nos sintomas clínicos, dados epidemiológicos e os resultados do teste sorológico, os pacientes foram classificados em dois grupos: grupo 1 (38 casos), infectados pela primeira vez e o grupo 2 (24 casos), pacientes que haviam sido expostos previamente ao microrganismo, isto é, indivíduos reinfectados por Brucella depois de uma grande período sem infecção ativa. Para se determinar o valor diagnóstico das diferentes provas e estabelecer valores discriminatórios foi utilizado o gráfico “receiving-operating chart” (ROC). Os cultivos de sangue foram apropriados para o grupo 1 (sensibilidade 0,92), mas não para o grupo 2 (sensibilidade 0,08). A combinação dos testes de rosa de Bengala e de aglutinação (≥1/160), tiveram valor diagnóstico para o grupo 1. Sem dúvida, para o grupo 2, o teste de aglutinação (<1/160, são incluídas as aglutinações negativas) não foi adequado para a detecção de Brucella. O melhor critério de diagnóstico para brucelose foi a combinação do teste rosa de bengala e o teste de Coombs (≥1/320; especificidade 0,8 e sensibilidade 1). O teste ELISA (com IgG ou com IgM, ou com ambas) não melhorou o diagnóstico da enfermidade.

Clostridium difficile pilot study: effects of probiotic supplementation on the incidence of C. difficile diarrhoea

Colonic infection with Clostridium difficile, leading to pseudomembranous colitis, is a common complication of antibiotic therapy, especially in elderly patients. It has been suggested that non-pathogenic probiotic bacteria might prevent the development and recurrence of C. difficile infection. This double-blind, placebo-controlled study examines the role of probiotic administration in the prevention of C. difficile-associated diarrhoea (CDAD) in elderly patients receiving antibiotic therapy. Consecutive patients (150) receiving antibiotic therapy were randomised to receive either a probiotic containing both Lactobacillus and Bifidobacterium or placebo for 20 days. Upon admission to hospital, bowel habit was recorded and a faecal sample taken. Trial probiotic or placebo was taken within 72 h of prescription of antibiotics, and a second stool sample was taken in the event of development of diarrhoea during hospitalisation or after discharge. Of the randomised patients, 138 completed the study, 69 with probiotics in conjunction with antibiotics and 69 with antibiotics alone. On the basis of development of diarrhoea, the incidence of samples positive for C. difficile-associated toxins was 2.9% in the probiotic group compared with 7.25% in the placebo-control group. When samples from all patients were tested (rather than just those developing diarrhoea) 46% of probiotic patients were toxin-positive compared with 78% of the placebo group.

La infección de colon por Clostridium difficile, que produce colitis pseudomembranosa, es una complicación frecuente en las terapias con antibióticos, especialmente en pacientes de la tercera edad. Se ha sugerido que las bacterias probióticas no patógenas podrían prevenir el desarrollo de la infección por C. difficile. Este estudio de doble ciego con control mediante placebos examina la influencia de la administración de probióticos en la prevención de diarrea asociada a C. difficile (CDAD) en pacientes de la tercera edad sometidos a terapia con antibióticos. Se escogieron al azar 150 pacientes consecutivos sometidos a terapia con antibióticos y se les administró aleatoriamente durante 20 días un probiótico que contenía Lactobacillus y Bifidobacterium o un placebo. Tras su ingreso hospitalario, se anotó su régimen intestinal y se tomó una muestra fecal. El probiótico o el placebo se administró durante las 72 h primeras del tratamiento con antibióticos, y se tomó una segunda muestra de heces en el caso de aparecer diarrea durante la hospitalización o tras el alta médica. De los pacientes escogidos, 138 completaron el estudio, 69 tratados con antibióticos y probióticos y 69 solamente con antibióticos. Entre los pacientes que tuvieron diarrea, se encontró un 2,9% de muestras positivas para la toxina asociada a C. difficile en el grupo tratado con probióticos, en comparación con el 7,25% detectado en el grupo control tratado con placebo. Cuando se analizaron muestras de todos los pacientes (no solamente los que tuvieron diarrea), un 46% de los pacientes tratados con probióticos dieron positivo para la toxina, en comparación con el 78% del grupo tratado con placebo.

A infecção do cólon por Clostridium difficile, derivando em colite pseudomembranosa, é uma complicação comum nas terapias com antibióticos, especialmente em pacientes na terceira idade. Tem sido sugerido que as bactérias probióticas não patógenas poderiam ter um efeito preventivo sobre o desenvolvimento da infecção por C.difficile. Este estudo, duplamente cego, com controle mediante placebos, examina a influência da administração de probióticos sobre a prevenção de diarréia associada a C. difficile (CDAD) em pacientes da terceira idade submetidos à terapia com antibióticos. Foram escolhidos 150 pacientes submetidos à terapia com antibióticos e se administrou, aleatoriamente, durante 20 dias um probiótico que continha Lactobacillus e Bifidobacterium ou um placebo. Na admissão hospitalar foram anotados o regime intestinal do paciente e foram colhidas amostra fecal. Durante as primeiras 72 horas do tratamento com antibióticos foram administrados conjuntamente probiótico ou placebo e foi tomada uma segunda amostra de fezes, caso o paciente desenvolvesse diarréia durante ou após a alta médica. Dos pacientes escolhidos, 138 completaram o estudo, 69 tratados com antibióticos e probióticos e 69 somente com antibióticos. Dentre os pacientes que desenvolveram diarréia, foram encontradas 2,9% de amostras positivas para a toxina associada a C. difficile no grupo tratado com probióticos, em comparação com 7,25% detectado no grupo controle tratado com placebo. Quando foram analisadas as amostras de todos os pacientes (não somente os que desenvolveram diarréia), 46% dos pacientes tratados com probióticos apresentaram positividade para a toxina em comparação com 78% do grupo tratado com placebo.

Simultaneous PCR detection of ica cluster and methicillin and mupirocin resistance genes in catheter-isolated Staphylococcus

Recent data show that more than 50% of catheter-associated bloodstream infections are caused by staphylococci. Staphylococcal infections produced by intercellular-adhesion cluster (ica) carriers can be even more problematic due to the presence of methicillin and mupirocin resistance genes. In the present study, a multiplex PCR protocol that allows the simultaneous identification of staphylococci and detection of both the ica and methicillin and/or mupirocin resistance genes was developed. Furthermore, the method allows differential detection of the ica locus from Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis.

Estudios recientes han demostrado que más del 50% de las septicemias asociadas al uso de catéteres están causadas por estafilococos. Las infecciones estafilococales producidas por cepas portadoras del operón de adhesión intercelular (ica) pueden agravarse por la presencia de genes de resistencia a la meticilina y/o a la mupirocina. Hemos desarrollado un protocolo de PCR múltiple que permite, simultáneamente, identificar estafilococos y detectar la presencia de ica y de los genes de resistencia a la meticilina y/o a la mupirocina. Además, dicho método permite la detección diferencial del locus ica de Staphylococcus aureus y/o S. epidermidis.

Estudos recentes têm demonstrado que mais de 50% das septicemias associadas ao uso de catéteres são causadas por estafilococos. As infecções estafilocócicas produzidas por cepas portadoras de operón de adesão intercelular (ica) podem agravar-se pela presença de genes de resistência a meticilina e/ou a mupirocina. Foi desenvolvido um protocolo de PCR múltiplo que permite, simultaneamente, identificar estafilococos e detectar a presença de ica e dos genes de resistência a meticilina e/ou a mupirocina. Este método permite a detecção diferencial do locus ica de Staphylococcus aureus e/ou de S. epidermidis.

In memory of Federico Uruburu (1934-2003)

Happy microbes in hostile niches: A symposium on extremophiles