International Microbiology

Year's comments for 2005

Mudanças estacionais nos ribotipos microbianos nos lagos cársticos e sulfurosos Cisó e Vilar, no nordeste da Espanha

Spatio-temporal changes in two sulfurous lakes from the karstic area of Banyoles (Girona, Spain), holomictic lake Cisó and meromictic lake Vilar, were studied over one year. Samples were collected at different depths from the two lakes on the same days, during each of the four seasons, and several physico-chemical variables (temperature, light, pH, conductivity, sulfide, oxygen concentration, pigment concentrations, etc.) were measured. To fingerprint bacterial populations from each sample, DNA was extracted, bacterial 16S rRNA genes were amplified by PCR, and restriction fragment length polymorphism (RFLP) analyses of the total bacterial 16S rDNAs were performed. Each 16S rDNA pool was independently digested with three restriction endonucleases (AluI, HinfI, and RsaI) and separated electrophoretically. More restriction fragments were obtained from the Lake Vilar samples than from the Lake Cisó samples. Moreover, intrasample and intersample differences were observed in each lake. RFLP patterns were compared by scoring similarities using the Jaccard coefficient and then building a multidimensional scaling (MDS) map from the resulting similarities matrix. In both lakes, results indicated that seasonality was mostly responsible for the observed fluctuations in the RFLP patterns, while the effect of stratification was less pronounced.

Se estudió a lo largo de un año el cambio espacio-temporal que se produjo en dos lagos sulfurosos de la zona cárstica de Banyoles (Girona, España), el lago Cisó, holomíctico, y el Lago Vilar, meromíctico. Se tomaron muestras a diferentes profundidades en los dos lagos los mismos días durante las cuatro estaciones y se midieron algunas variables fisicoquímicas (temperatura, luz, pH, conductividad, sulfuro, concentraciones de oxígeno y de pigmentos, etc.). Para obtener la impronta genética de las poblaciones bacterianas de cada muestra, se extrajo el DNA, se amplificaron los genesdel 16S rRNA mediante PCR y se analizó el polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) del total de 16S rDNA bacteriano. Los diferentes conjuntos de 16S rDNA bacteriano fueron digeridos de manera independiente con tres endonucleasas de restricción (AluI, HinfI, y RsaI) y separados por electroforesis. Se obtuvieron más fragmentos de restricción de las muestras del lago Vilar que del Cisó. Además, en cada lago se observaron también diferencias dentro de cada muestra y entre las diferentes muestras. Luego se compararon los patrones de RFLP puntuando las similitudes mediante el coeficiente Jaccard y la creación un mapa de escalamiento multidimensional (MDS) a partir de la matriz de similitudes resultante. Los resultados indicaron que la estacionalidad era la principal causa de las fluctuaciones observadas en los patrones de RFLP en ambos lagos, mientras que el efecto de la estratificación era menos pronunciado.

Ao longo de um ano se estudaram as mudanças espaço-temporários que se produziram em dois lagos sulfurosos da zona cárstica de Banyoles, o lago Cisó, holomíctico, e o Lago Vilar, meromíctico. Se tomaram amostras a diferentes profundidades nos dois lagos os mesmos dias durante as quatro estações e se mediram algumas volúveis físico-químicas (temperatura, luz, pH, condutividade, sulfureto, concentraçãos de oxigênio e de pigmentos, etc.). Para obter a estampagem em relevo genética das povoações bacterianas de cada amostra, se extraiu o DNA, se amplificaram os genes do 16S rRNA mediante PCR e se analisou o polimorfismo na longitude dos fragmentos de restrição (RFLP) do total de 16S rDNA bacteriano. Os diferentes conjuntos de 16S rDNA bacteriano foram digeridos de maneira independente com três endonucleasas de restrição (AluI, HinfI, e RsaI) e separados por electroforesis. Se obtiveram mais fragmentos de restrição das amostras do lago Vilar que do Cisó. Além disso, em cada lago se observaram também diferenças dentro de cada amostra e entre as diferentes amostras. Depois se compararam os patrões de RFLP pontuando as similitudes mediante o coeficiente Jaccard e a criação um mapa de escalamiento multidimensional (MDS) a partir da matriz de similaridades resultante. Os resultados indicaram que a estacionalidade era a principal causa das oscilações observadas nos patrões de RFLP em ambos lagos, enquanto que o efeito da estratificação era menos pronunciado.

**Otimização statística do meio pella produção de biomassa e poli(3-hidroxibutirato) por una linhagem recombinante de Escherichia coli usando subproduitos agroindustrais**

A statistically based Plackett-Burman screening design identified milk whey and corn steep liquor concentrations as well as ionic strength (based on phosphate buffer concentration) as the three main independent components of the culture medium that significantly (p < 0.05) influenced biomass and poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) production in recombinant cells of Escherichia coli. This strain carries a plasmid encoding phb genes from a natural isolate of Azotobacter sp. Response surface methodology, using a central composite rotatable design, demonstrated that the optimal concentrations of the three components, defined as those yielding maximal biomass and PHB production in shaken flasks, were 37.96 g deproteinated milk whey powder/l, 29.39 g corn steep liquor/l, and 23.76 g phosphates/l (r² = 0.957). The model was validated by culturing the recombinant cells in medium containing these optimal concentrations, which yielded 9.41 g biomass/l and 6.12 g PHB/l in the culture broth. Similar amounts of PHB were obtained following batch fermentations in a bioreactor. These results show that PHB can be produced efficiently by culturing the recombinant strain in medium containing cheap carbon and nitrogen sources.

Un diseño estadístico de selección de Plackett-Burman identificó las concentraciones de suero de leche y de macerado de maíz, así como la fuerza iónica (dada por la concentración del tampón de fosfatos), como tres variables principales e independientes del medio de cultivo que, de forma significativa (p < 0,05), influían en el crecimiento y la acumulación de biomasa y poli(3-hidroxibutirato) (PHB) en células recombinantes de Escherichia coli. Esta cepa lleva un plásmido que codifica los genes phb provenientes de un aislado natural de Azotobacter sp. Aplicando la metodología de superficies de respuesta, mediante un diseño central compuesto direccionable, se demostró que los valores óptimos de las variables del proceso para la máxima producción de biomasa y de PHB eran: 37,96 g/l de suero de leche desproteinizado en polvo, 29,39 g/l de macerado de maíz y 23,76 g/l de fosfatos (r² = 0,957). En la validación del modelo, realizada utilizando los valores óptimos, se obtuvieron unas concentraciones de biomasa de 9,41 g/l y de PHB de 6,12 g/l en el medio. En los ensayos en lote en biorreactor se obtuvieron contenidos semejantes de PHB. Los resultados demostraron que el biopolímero puede producirse eficazmente con esta cepa recombinante a partir de fuentes de carbono y nitrógeno de bajo costo.

Um desenho de seleção, baseado no método estatístico Plackett-Burman identificou as concentrações do soro de queijo e de licor de milho bem como a força iônica (baseada em concentração do tampão fosfatos) as principais variáveis independentes do meio de cultura com significância (p < 0,05), os quais influíam na produção de biomassas e poli(3-hidroxibutirato) (PHB) em células recombinantes de Escherichia coli. Este linhagem leva un plasmídeo que codifica os genes phb de uma linhagem selvagem de Azotobacter sp. A metodologia de superficies de resposta, usando o desenho rotável compósito central, demonstrou que os valores ótimos das variáveis do processo para a máxima produção de biomassa e PHB foram 37,96 g/l de soro de queijo deproteinado, 23,76 g/l de fosfato (r² = 0,957) e 29,39 g/l de licor de milho. Na validação do modelo, feita usando esses valores ótimos, observaramse unas concentrações de biomassa de 9,41 g/l biomassa e 6,12 g/l de concentração de PHB no caldo de cultivo. Culturos no bioreactor mostraram resultados semelhantes. Os resultados demostraram que o biopolímero pode ser produzido eficientemente com esta linhagem recombinante a partir de fontes econômicas de carbono e nitrogênio.

Ampla distribuição da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase não fosforiladora entre as bactérias gram-positivas

The non-phosphorylating glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDHN, NADP+-specific, EC 1.2.1.9) is present in green eukaryotes and some Streptococcus strains. The present report describes the results of activity and immunoblot analyses, which were used to generate the first survey of bacterial GAPDHN distribution in a number of Bacillus, Streptococcus and Clostridium strains. Putative gapN genes were identified after PCR amplification of partial 700-bp sequences using degenerate primers constructed from highly conserved protein regions. Alignment of the amino acid sequences of these fragments with those of known sequences from other eukaryotic and prokaryotic GAPDHNs, demonstrated the presence of conserved residues involved in catalytic activity that are not conserved in aldehyde dehydrogenases, a protein family closely linked to GAPDHNs. The results confirm that the basic structural features of the members of the GAPDHN family have been conserved throughout evolution and that no identity exists with phosphorylating GAPDHs. Furthermore, phylogenetic trees generated from multiple sequence alignments suggested a close relationship between plant and bacterial GAPDHN families.

La gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa no-fosforilante (GAPDHN, NADP+-específica, EC 1.2.1.9) está presente en organismos eucariotas fotosintéticos y en algunas cepas de Streptococcus y Clostridium. En este trabajo se presentan los resultados de los análisis de actividad e inmunotransferencia, que se utilizaron para la primera prospección de la distribución de GAPDHN bacteriana en diversas cepas de Bacillus, Streptococcus y Clostridium. Se han identificado genes putativos gapN mediante amplificación por PCR de secuencias parciales de 700 bp utilizando cebadores degenerados construidos a partir de regiones proteínicas muy conservadas. Las secuencias de aminoácidos de estos fragmentos se alinearon con las de otras secuencias conocidas de GAPDHN eucarióticas y procarióticas, lo que demuestra la presencia de residuos conservados que participan en la actividad catalítica y que no se han conservado en las aldehído deshidrogenasas, una familia de proteínas estrechamente relacionadas con las GAPDHN. Los resultados confirman que las características estructurales básicas de los miembros de la familia GAPDHN se han conservado durante la evolución y que no existe identidad con las GAPDH fosforilantes. Además, los árboles filogenéticos generados a partir de alineaciones de secuencia múltiples sugieren una estrecha relación entre las familias GAPDHN en plantas y bacterias.

Indicou-se a presença da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase não fosforiladora (GAPDHN, NADP+-específica, EC 1.2.1.9) em organismos eucariotas fotossintéticos e em algumas cepas de Streptococcus e Clostridium. Neste trabalho apresenta-se os resultados da atividade en imunotransferência, usados para a primeira prospecção da distribuição da GAPDHN bacteriana em diversas cepas de Bacillus, Streptococcus e Clostridium. Se identificaram genes putativos gapN mediante amplificação por PCR de seqüências parciais de 700 bp utilizando iniciadores degenerados construídos a partir de regiões proteicas altamente conservadas. As seqüências de aminoácidos destes fragmentos se alinharam com as de outras seqüências desconhecidas de GAPDHNs eucarióticas e procarióticas, o que demonstra a presença de resíduos conservados que participam da atividade catalítica que não estão conservados nas aldeído desidrogenases, uma família de proteínas estreitamente relacionados com as GAPDHN. Este trabalho confirma que as características estruturais básicas dos membros da família GAPDHN se conservaram durante a evolução e que não existe identidade com as GAPDH fosforilantes. Além disso, as árvores filogenéticas geradas a partir de alinhamentos de seqüência múltiplas indicam uma estreita relação entre as famílias de GAPDHN de plantas e bactérias.

Discrepancias fenotípicas, genotípicas e filogenéticas para diferenciar Aeromonas salmonicida de Aeromonas bestiarum

The taxonomy of the "Aeromonas hydrophila" complex (comprising the species A. hydrophila, A. bestiarum, A. salmonicida, and A. popoffii) has been controversial, particularly the relationship between the two relevant fish pathogens A. salmonicida and A. bestiarum. In fact, none of the biochemical tests evaluated in the present study were able to separate these two species. One hundred and sixteen strains belonging to the four species of this complex were identified by 16S rDNA restriction fragment length polymorphism (RFLP). Sequencing of the 16S rDNA and cluster analysis of the 16S-23S intergenic spacer region (ISR)-RFLP in selected strains of A. salmonicida and A. bestiarum indicated that the two species may share extremely conserved ribosomal operons and demonstrated that, due to an extremely high degree of sequence conservation, 16S rDNA cannot be used to differentiate these two closely related species. Moreover, DNA-DNA hybridization similarity between the type strains of A. salmonicida subsp. salmonicida and A. bestiarum was 75.6 %, suggesting that they may represent a single taxon. However, a clear phylogenetic divergence between A. salmonicida and A. bestiarum was ascertained from an analysis based on gyrB and rpoD gene sequences, which provided evidence of a lack of congruence of the results obtained from 16S rDNA, 16S-23S ISR-RFLP, DNA-DNA pairing, and biochemical profiles.

La taxonomía del complejo "Aeromonas hydrophila" (que comprende las especies A. hydrophila, A. bestiarum, A. salmonicida, y A. popoffii) ha sido controvertida, en particular las relaciones entre los dos patógenos de peces, A. salmonicida y A. bestiarum. De hecho, de las pruebas bioquímicas evaluadas en el presente estudio, ninguna fue capaz de separar estas dos especies. Ciento dieciséis cepas pertenecientes a las cuatro especies de este complejo se identificaron mediante el análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) del 16S rDNA. La secuenciación del 16S rDNA y el análisis de grupos de RFLP de la región espaciadora intergénica (ISR) 16S-23S en cepas seleccionadas de A. salmonicida y A. bestiarum indicaron que las dos especies podrían compartir operones ribosómicos extremadamente conservados y demostraron que, debido a su elevado grado de conservación de secuencia, el 16S rDNA no puede utilizarse para diferenciar estas dos especies de relación tan estrecha. Además, la similitud de hibridación DNA-DNA entre las cepas tipo de A. salmonicida subsp. salmonicida y de A. bestiarum era del 75,6 %, lo que sugiere que pueden ser un único taxón. Sin embargo, el análisis simultáneo de las secuencias de los genes gyrB y rpoD puso de manifiesto una marcada divergencia filogenética entre A. salmonicida y A. bestiarum, lo cual aporta pruebas de la falta de congruencia de los resultados de 16S rDNA, ISR-RFLP, 16S-23S, apareamiento DNA-DNA y perfiles bioquímicos.

A taxonomia do complexo "Aeromonas hydrophila" (que compreende as espécies A. hydrophila, A. bestiarum, A. salmonicida, e A. popoffii) tem sido controvérsia, em particular a relacionada com as duas espécies patogênicas em peixes, A. salmonicida e A. bestiarum. De facto, com as provas bioquímicas efectuadas no presente estudo, observou-se que nenhuma foi capaz para separar estas duas espécies. Cento e dezasseis estirpes pertencentes às quatro espécies deste complexo identificaram-se por a análise do polimorfismo no tamanho dos fragmentos de restrição (RFLP) do 16S rDNA. A sequênciação do 16S rDNA e a análise dos grupos de RFLP da região espaciadora intergênica (ISR) 16S-23S em estirpes seleccionadas de A. salmonicida e de A. bestiarum indicaram que as duas espécies poderão partilhar operões ribossómicos extremamente conservados e demonstram que, devido ao seu elevado grau de conservação da sequência, o 16S rDNA não se pode utilizar para diferenciar estas duas espécies de relação tão estreita. Por outro lado, a semelhança de hibridação DNA-DNA entre estirpes tipo de A. salmonicida subsp. salmonicida e de A. bestiarum foi de 75,6% sugerindo que podem representar um único taxon. No entanto, a análise simultânea das sequências dos genes gyrB e rpoD apresenta uma notável divergência filogenética entre A. salmonicida e A. bestiarum, o qual evidencia uma falta de congruência no que diz respeito aos resultados de 16S rDNA, 16S-23S ISR-RFLP, emparelhamento DNA-DNA e perfis bioquímicos.

Divergência genômica de algumas cepas de Escherichia coli: provas da transferência horizontal e variação na velocidades de mutação

This report describes the sequencing in the Escherichia coli B genome of 36 randomly chosen regions that are present in most or all of the fully sequenced E. coli genomes. The phylogenetic relationships among E. coli strains were examined, and evidence for the horizontal gene transfer and variation in mutation rates was determined. The overall phylogenetic tree indicated that E. coli B and K-12 are the most closely related strains, with E. coli O157:H7 being more distantly related, Shigella flexneri 2a even more, and E. coli CFT073 the most distant strain. Within the B, K-12, and O157:H7 clusters, several regions supported alternative topologies. While horizontal transfer may explain these phylogenetic incongruities, faster evolution at synonymous sites along the O157:H7 lineage was also identified. Further interpretation of these results is confounded by an association among genes showing more rapid evolution and results supporting horizontal transfer. Using genes supporting the B and K-12 clusters, an estimate of the genomic mutation rate from a long-term experiment with E. coli B, and an estimate of 200 generations per year, it was estimated that B and K-12 diverged several hundred thousand years ago, while O157:H7 split off from their common ancestor about 1.5-2 million years ago.

Se secuenciaron 36 regiones del genoma de Escherichia coli B elegidas al azar y que están presentes en la mayoría o en todos los genomas de E. coli secuenciados. Se examinaron las relaciones filogenéticas entre cepas de E. coli y se buscaron pruebas de transferencia génica horizontal y de variación en la tasa de mutación. El árbol filogenético conjunto de genes indica que E. coli B y K-12 son las cepas con un parentesco más estrecho, mientras que E. coli O157:H7 se encuentra más alejada y aún más lo están Shigella flexneri 2a y E. coli CFT073, siendo esta última la más distante de todas. En el grupo B, K-12 y O157:H7, varias regiones indican que hay topologías alternativas. La transferencia génica horizontal es una explicación plausible de estas incongruencias filogenéticas, pero también hemos hallado pruebas de una evolución más rápida en sitios sinónimos en el linaje O157:H7. Así pues, una interpretación más profunda de estos resultados queda confundida por una asociación entre unos genes que muestran una evolución más rápida y otros que son transferidos horizontalmente. Usando genes que apoyan los grupos B y K-1, y empleando una estima de la tasa de mutación obtenida a partir de un experimento de evolución a largo plazo con E. coli B y suponiendo 200 generaciones por año, se estimó que las cepas B y K-12 divergieron hace varios cientos de miles de años, mientras que O157:H7 se separó de su ancestro común hace entre 1,5 y 2 millones de años.

Se seqüenciaram 36 regiões do genoma de Escherichia coli B escolhidas ao acaso que estão presentes na maioria ou em todos os genomas de E. coli seqüenciados. Se examinaram as relações filogenéticas entre as cepas de E. coli e se buscaram provas da transferência horizontal de genes e se calculou a variação na freqüência de mutação. A árvore filoge nético completo indica que E. coli B e K-12 são as cepas com mais um parentesco estreito, enquanto E. coli ou157:h7 se encontra mais afastada e mais ainda o estão Shigella flexneri 2a e E. coli CFT073, sendo esta última a mais distante de todas. No grupo B, K-12 e O157:H7, várias regiões apóiam topologias alternativas. A transferência horizontal pode explicar essas incongruências filogenéticas. No entanto, também achamos provas de mais uma evolução rápida em lugares sinônimos na linhagem O157:H7. Uma ulterior interpretação destes resultados se confunde por uma associação entre genes que mostram uma evolução mais rápida e os que são transferidos horizontalmente. Mediante o uso de genes do grupo formado por B e K-1, e calculando a velocidade de mutação em um experimento a longo termo com E. coli B e um cálculo de 200 gerações por ano, se estimou que as cepas B e K-12 se separaram há várias centenas de milhares de anos, enquanto Ou157:H7 se separou de seu ancestral comum há entre 1,5 e 2 milhões de anos.

Regulamento da transferência conjugativa por Lrp e metilação Dam no plasmídio R100

Conjugal transfer of the F-like plasmid R100 occurs at higher frequencies in the absence of DNA adenine methylation. Lower levels of R100-encoded FinP RNA were found in a Dam- host, suggesting that Dam methylation regulates FinP RNA synthesis. Lack of the leucine-responsive regulatory protein (Lrp) causes a decrease in R100 plasmid transfer, indicating that Lrp is an activator of R100-mediated conjugation. Hence, host-encoded regulators previously described for the Salmonella virulence plasmid (pSLT) seem to play analogous roles in R100. Repression of conjugal transfer in rich medium is an additional trait shared by R100 and pSLT. DNA sequence comparisons in regulatory loci support the view that R100 and pSLT are closely related.

La transferencia conjugativa de R100, un plásmido de la familia de F, ocurre a frecuencias más altas en ausencia de metilación Dam. Los mutantes Dam- contienen menores cantidades de RNA FinP que la estirpe silvestre; ello sugiere que la metilación Dam regula la síntesis de RNA FinP. La carencia de proteína reguladora de respuesta a la leucina (Lrp) produce una disminución de la transferencia de R100; ello indica que Lrp es un activador de la conjugación mediada por R100. Por tanto, los reguladores codificados por el hospedador que regulan la transferencia del plásmido de virulencia de Salmonella (pSLT) parecen ejercer funciones análogas en la conjugación mediada por R100. La represión de la transferencia conjugativa en medio rico es otro rasgo común a R100 y pSLT. La comparación de secuencias en loci reguladores apoya la existencia de un estrecho parentesco entre R100 y pSLT.

A transferência conjugativa de R100, um plasmídio da família de F, ocorre a freqüências mais altas em ausência de metilação Dam. Os mutantes Dam- contêm menores quantidades de RNA FinP que a estirpe silvestre; isso sugere que a metilação Dam regula a síntese de RNA FinP. A carência de proteína reguladora da resposta à leucina (Lrp) produz uma diminuição da transferência de R100; isso indica que Lrp é um ativador da conjugação mediada por R100. Portanto, os reguladores codificados pelo hospedador que regulam a transferência do plaásmídio de virulência de Salmonella (pSLT) parecem exercer funções análogas na conjugação mediada por R100. A repressão da transferência conjugativa no meio rico é outro rasgo comum a R100 e pSLT. A comparação de seqüências em loci reguladores apóia a existência de um estreito parentesco entre R100 e pSLT.

Caracterização molecular de InJR06, um integron de classe 1 situado em um plásmido conjugativo de Salmonela enterica ser. Typhimurium

The presence of class 1, 2, and 3 integrons was investigated in four pediatric isolates of Salmonella enterica ser. Typhimurium (S. Typhimurium). A class 1 integron was detected in one S. Typhimurium strain, the only one that also showed resistance to various aminoglycoside antibiotics. This integron, called InJR06, and the aminoglycoside resistance determinants were located in pS06, a large (≥ 55 kb) conjugative plasmid. A single mobile cassette (encoding the aminoglycoside adenylyltransferase ANT(3´´)-Ia) was detected in the variable region of InJR06, while the architecture of the attI1 and attC sites was conserved.

Se investigó la presencia de integrones de clase 1, 2 y 3 en cuatro aislamientos pediátricos de Salmonella enterica ser. Typhimurium (S. Typhimurium). Un integrón de clase 1 se detectó en una cepa de S. Typhimurium, la única que además presentaba resistencia a varios antibióticos aminoglucósidos. Este integrón, llamado InJR06, y los determinantes de resistencia a aminoglucósidos se localizaron en pS06, un plásmido conjugativo de tamaño grande (≥ 55 kb). El análisis de la región variable de InJR06 mostró que un casete génico codifica la aminoglucósido adeniltransferasa ANT(3´´)-Ia y que la arquitectura de los sitios attI1 y attC está conservada.

Se averiguou a presença de integrones de classe 1, 2 e 3 em quatro isolamentos pediátricos de Salmonela enterica ser. Typhimurium (S. Typhimurium). Um integrón de classe 1 se pôde detectar em uma cepa de S. Typhimurium, a única que além disso apresentava resistência a vários antibióticos aminoglucósidos. Este integrón, chamado InJR06, e os determinantes de resistência a aminoglucósidos se localizaram em pS06, um plásmido conjugativo de tamanho grande (≥ 55 kb). A análise da região variável de InJR06 mostrou que um cassete genético codifica a aminoglucósido adeniltransferasa ANT(3´´)-Ia e que a arquitetura dos lugares attI1 e attC está conservada.

Action CRECE: an initiative of the Federation of Spanish Scientific Societies (COSCE)