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Revista Española de Cirugía Oral y Maxilofacial
On-line version ISSN 2173-9161Print version ISSN 1130-0558
Rev Esp Cirug Oral y Maxilofac vol.29 n.4 Madrid Jul./Aug. 2007
ARTÍCULO CIENTÍFICO
Estudio comparativo del uso de la matriz ósea desmineralizada de origen humana y de la poliuretana derivada del aceite de mamona sobre el proceso de regeneración ósea. Estudio histométrico en calota de conejos
A comparative study on the use of demineralized bone matrix of human origin and polyurethane derived from castor oil in bone regeneration processes. A histometric study on rabbit calvaria
J. Rodrigues Laureano Filho1, M. Allais2, P. Edward Maurette2, J.R. Albergaria Barbosa3
1 Odontólogo, PhD en Cirugía y Traumatología Buco Maxilofacial. Profesor Asociado del Área de Cirugía y Traumatología Buco Maxilofacial de la Universidad de Pernambuco. Facultad de Odontología de Pernambuco. FOP-UPE. Recife - PE - Brasil.
2 Odontólogo USM. Caracas -Venezuela. MSc en Cirugía y Traumatología Buco-Maxilofacial de la Facultad de Odontología de Piracicaba. Universidad Estadual de Campinas (FOP-Unicamp). Piracicaba-SP-Brasil. Doctorando en Cirugía y Traumatología Buco-Maxilofacial de la Facultad de Odontología de Pernambuco. Universidad de Pernambuco (FOP-UPE). Recife-PE-Brasil.
3 Odontólogo, Cirujano Buco-Maxilofacial. Profesor Adjunto. Área de Cirugía y Traumatología Buco-Maxilofacial de la Facultad de Odontología de Piracicaba. Universidad Estadual de Campinas (FOP-Unicamp). Piracicaba-SP-Brasil.
Dirección para correspondencia
RESUMEN
Objetivo. Analizar histométricamente el efecto de la matriz ósea desmineralizada de origen humana y de la resina poliuretana derivada del aceite de mamona, sobre el proceso de regeneración ósea.
Diseño del estudio: fueron utilizados 24 conejos y en cada calota craniana fueron preparadas dos cavidades quirúrgicas, siendo una a cada lado de la sutura parietal. Los animales fueron divididos en dos grupos. En el grupo I la cavidad experimental (lado derecho) fue rellenada con la poliuretana derivada del aceite de mamona, mientras que en el grupo II la cavidad experimental fue rellenada con la matriz ósea desmineralizada de origen humano. Las cavidades de control fueron rellenadas solo con la sangre del animal. Los animales fueron sacrificados en los períodos postoperatorios de 04, 07 y 15 semanas.
Resultados. El análisis estadístico, realizado en base de los datos de la histometría, mostró una mayor neoformación ósea de los grupos I y II en relación al grupo control, no existiendo diferencia estadística cuando los grupos experimentales fueron comparados.
Conclusiones. El uso de poliuretana derivada del aceite de mamona y matriz ósea desmineralizada de origen humano mejoran el proceso de regeneración cuando lo comparamos a la regeneración ósea normal resultando que entre ambos materiales tuvieron un comportamiento similar sin diferencias estadísticas significantes entre sí.
Palabras clave: Matriz ósea; Regeneración ósea; Polímero de mamona.
ABSTRACT
Objective. The present study was aimed at carrying out a histological and histometric analysis on the effect of human demineralized bone matrix and a polyurethane resin, derived of the castor bean oil, on the bone regeneration process.
Design: For this, 24 rabbits were used and in each calvarium two surgical bone defect were prepared, one on the right side and another on the left side of the parietal suture. The animals were divided into two groups. In group I the experimental defect (right side) was filled with polyurethane derived from oil of the castor oil plant, while in group II the experimental cavity was filled with demineralized bone matrix of human origin. The control cavities were just filled with the blood of the animal. The animals were sacrificed in the postoperative period at 04, 07 and 15 weeks.
Results. The statistical analysis, which was based on the data of the histometric study, showed larger bone neoformation in groups I and II in relation to the control groups, and there were no statistical differences when the experimental groups were compared.
Conclusions. The use of polyurethane resin implants and demineralized human bone matrix helped and optimized the regeneration process when compared with natural bone regeneration, and similar behavior was obtained without statistical differences in both materials.
Key words: Bone matrix; Bone regeneration; Polyurethane resin implant.
Introducción
El hueso es un tejido conjuntivo extremadamente duro y con gran plasticidad, presentando un metabolismo altamente complejo, con potencial de reparación envolviendo iones, células, hormonas, proteínas y factores nutricionales. El tejido óseo posee una alta capacidad de reparación espontánea cuando es lesionado, reponiendo después de un breve intervalo de tiempo, toda la partes perdida. 1 Entre tanto, existen algunos casos en que los defectos son extensos y no tienen la capacidad de repararse espontáneamente, por lo que es necesario utilizar diversas técnicas quirúrgicas en la tentativa de reparación de la deficiencia ósea.2
La reconstrucción de estas lesiones amplias en tejidos duros siempre fue uno de los grandes desafíos para la ciencia, siendo utilizados para tal fin hueso autógeno, homógeno, liofilizado, desmineralizado, así como materiales artificiales o sintéticos.2
Los injertos óseos desmineralizados y liofilizados promueven una rápida cicatrización de los defectos óseos y poseen la propiedad de inducir una considerable formación ósea, además de no presentar ningún poder antigénico.3 Estos injertos tienen como desventaja su forma y su origen. El tamaño de sus partículas limita la cantidad de aposición coronal del hueso disponible en defectos horizontales y cualquier presión leve del tejido puede desplazar el material injertado. 4 Un gran problema en las reconstrucciones óseas es la dificultad de obtención de hueso humano viable en grandes cantidades, asociado a la prohibición en varios países de la comercialización de órganos o tejidos humanos y de la posibilidad de transmisión de enfermedades, así como su alto costo.1
En 1984, el grupo de Química Analítica y Tecnología de Polímeros de la Escuela de Ingeniería de São Carlos, SP Brasil, desarrolló una resina poliuretana de origen vegetal extraída del aceite de la mamona.5 Los polímeros poliuretanos tienen como ventajas el proceso y la flexibilidad de formulación, excelentes propiedades estructurales, ausencia de emisión de irritantes o vapores tóxicos, además de la biocompatibilidad.6 Henning y cols.7 en 1989 observaron la biocalcificación in vivo e in vitro de las resinas poliuretanas. En 1997, Carvalho y cols.8 observaron la oseointegración de este polímero y relataron la reabsorción y la substitución del polímero por tejido óseo.
Los estudios afirman que el hueso autógeno es el mejor material para injertar,9 pero varios sustitutos de tejido óseo han sido propuestos para evitar la morbilidad del sitio donante y el aumento del tiempo operatorio,10 buscando crear o extraer de la naturaleza materiales que promuevan el incremento de la reparación y neoformación ósea, siendo biocompatibles, osteocondutores y osteoindutores. 11
Material y método
Animales y anestesia
En el presente estudio fueron utilizados 24 conejos albinos de la raza Nueva Zelanda, hembras, con edad comprendida entre 3 y 6 meses, y peso medio de 2,9 kg. Los animales fueron mantenidos en jaulas en el Animalario de la Facultad de Odontología de Piracicaba Unicamp, durante el período experimental, con dieta sólida y agua sin restricción, a temperatura ambiente. Estos animales fueron divididos en dos grupos iguales (Grupo I y Grupo II) experimental.
El día anterior a la cirugía todos los animales fueron sometidos a tricotomía del pelo de la cabeza, pesados y los cálculos referentes al volumen anestésico fueron realizados para cada animal.
Para la aplicación de la anestesia general fue utilizada atropina 0,15 ml/kg de peso, por vía subcutánea, cinco minutos antes de la anestesia propiamente dicha para evitar la bradicardia provocada por el anestésico. Ketamina (Francotar® Virbac do Brasil Industria y Comércio Ltda. São Paulo.) y solución acuosa a 2% de Clorhidrato de 2-(2,6-xilidino)-5,6-dihidro-4-H-1,3-tiazin (Rompum® Bayer SA - Saúde Animal ) fueron aplicados en una concentración de 0,5 ml/Kg de peso, por vía intramuscular profunda.
Procedimiento quirúrgico
Los procedimientos operatorios experimentales fueron realizados bajo condiciones asépticas utilizándose instrumental estéril y campos deshechables. Después de realizada la tricotomía de la calota fue realizada la antisepsia con solución alcohólica de polivilpirrolidona yodo a 10% y posteriormente el aislamiento del área a ser operada con campos estériles.
El procedimiento quirúrgico fue dirigido a través del protocolo descrito por Alberius y cols.(1989);12 Alberius y cols.(1990);13 La piel y el tejido subcutáneo fueron seccionados a través de una incisión paramediana en la calota del conejo, realizada con lamina de bisturí nº 15, extendiéndose desde el hueso nasal hasta el frontal. El periostio que recubre la región frontal y la sutura coronal fue incidido, elevado y desplazado lateralmente (Fig. 1A). Dos cavidades óseas circulares, fueron producidas en la región parietal bilateralmente, utilizándose una fresa de trefina con 10 mm de diámetro, acoplada a un contra-ángulo reductor 16:1, montada en baja rotación en un motor eléctrico, con cuidado de no perforar el seno sagital y/o la duramadre (Figs. 1B y 1C).
Durante las perforaciones óseas, el procedimiento fue realizado bajo constante irrigación con solución fisiológica de cloreto de sodio 0,9% evitándose así el sobrecalentamiento del hueso. Después de la realización de las perforaciones, el tapón óseo confeccionado por de la trefina fue delicadamente retirado con la ayuda de un periostomo (Fig. 1D). Siempre la cavidad del lado derecho fue rellenada por el material a ser estudiado y la del lado izquierdo dejada vacía (Fig. 1E). Las cavidades del hueso parietal derecho del Grupo I fueron rellenadas con hueso desmineralizado de origen humano (DEMBONE TM Pacific Coast Tissue Bank ) (Fig. 1F) y las cavidades del lado izquierdo fueron rellenadas por sangre, sirviendo como control. La cavidad del parietal derecho de los conejos del Grupo II fue rellenada con AUG-EX (AUG-EX®-Poliquil-Araraquara-São Paulo ) (Fig. 1G), una resina poliuretana extraída del óleo de la mamona, y la cavidad del parietal izquierdo también fue rellenada con sangre, como control de este grupo. Posteriormente, el perióstio fue reposicionado y los planos superficiales suturados con nylon número 4.0 (Ethicon® Nylon4-0. Johnson & Johnson São José dos Campos/SP Brasil).
Todos los animales recibieron Penicilina Benzatina en dosis única de 1,0 ml, por vía intraperitoneal, siguiendo las recomendaciones del fabricante. En cada animal operado fue realizada una aplicación tópica de solución alcohólica de polivilpirrolidona yodo a 10%, como medida antiséptica local en el postoperatório inmediato. Los animales permanecieron en observación en el período inicial de la recuperación anestésica y en seguida fueron llevados a sus jaulas y mantenidos hasta el momento del sacrificio.
Los animales fueron sacrificados en los períodos de 04, 07 y 15 semanas de postoperatorio, con un total de cuatro animales de cada grupo, por período de sacrificio. Fue utilizada una sobredosis de la mezcla anestésica conteniendo Francotar y Rompum, para el sacrificio de los animales. Después de ésto, se realizo la retirada de los bloques óseos conteniendo las cavidades óseas del estudio.
Estudio histométrico
Para la realización del análisis histométrico lineal fueron utilizados un microscópio óptico con objetivo para aumento de 4/0,1, una filmadora, una computadora y un programa para análisis de las imagenes (Kontron eletronik Imaging System KS 400). Los cortes histológicos de los especímenes obtenidos de los animales de todos los grupos, teñidos con H&E fueron observados a través del analizador de imágenes Kontron Elektronik KS 400 2.0, da Zeiss.
Las imágenes histológicas seleccionadas fueron capturadas por el ordenador a través de la cámara. Para que esto fuese posible, fue establecido un "macro", o sea, un conjunto de funciones que permitieron ejecutar automáticamente la selección de las imágenes, la definición de las condiciones de la morfometría y la ejecución de la medida, a través del analizador de imágenes.
Cada lámina histológica fue focalizada en objetivas de 1X, y la imagen fue captada por el sistema y visualizada on line no display, que realizó la normalización y congelamiento de esta, pudiendo entonces ser debidamente medida. Siendo, entonces, sobrepuesto a ellas un retículo de 100 pontos, también denominado grada de intersecciones, donde cada punto corresponde a 300 x 300 µm, lo que equivale a 1,2 mm3, por tanto, el volumen total del retículo era de 120 mm3. El sistema empleado para el análisis histométrico fue por el contaje de puntos de forma manual que recaían sobre el hueso neoformado en las áreas de intersección de las líneas horizontales y verticales del retículo.
La evaluación de los datos se realizo a través do data list, una lista de resultados morfométricos. Para cada campo medido esa lista de resultados era transferida para el programa Excel, formando el banco de datos de cada animal.
Para establecer el número de puntos a ser contados en cada grupo, en los tres períodos postoperatorios, con un sistema de 100 puntos, se utilizo la fórmula propuesta para error padrón relativo:
Para las condiciones de trabajo la densidad de volumen (Vv), o sea la fracción de volumen ocupada por un objeto en una determinada estructura fue igual a 100%. En bioestadística es aceptable el índice de significancia de 0,05 (probabilidad igual a 95%), por eso fue atribuido ese valor a EPR. De esa forma:
Por sorteo fueron escogidas cinco laminas de cada grupo, en los períodos de sacrificios (4, 7 y 15 semanas). Todas las láminas seleccionadas contenían cortes histológicos semi-seriados con 6Ìm de espesor. Fueron analizados por toda la extensión del defecto, donde habían 360 puntos para cada grupo en los diferentes períodos de sacrificio. Para la contabilización de los puntos, fue evaluado solamente los lugares donde hubo presencia de tejido óseo neoformado.
Resultados
El estudio de las suposiciones reveló que ningún dato fue violado y que el análisis de variancia fue ejecutado sin la necesidad de correcciones en los datos.
En el cuadro de análisis de variancia, se observa que solamente hay efecto significativo del material. No hay indicios que afirmen que exista efecto significativo del tiempo o de la interacción entre los tiempos y los materiales.
A través de este resultado, se procedió a la comparación de medias de los materiales a través del test de Tukey.
Comparación de medias de los mmateriales
En la tabla 2 se observa que hay fuertes indicios de diferencia entre las medias verdaderas del tratamiento control y de los otros dos grupos. La figura 2 muestra la comparación entre las medias de formación de hueso obtenidas de los materiales.
Discusión
El interés en estudiar materiales capaces de sustituir el tejido óseo ha aumentado en las profesiones que componen el área de la salud,14 principalmente en la odontología, donde la aparición de tratamientos reconstructivos como los implantes oseointegrados y una mayor concienciación de la importancia de la reconstrucción ósea en los pacientes sometidos a procedimientos mutiladores, ha llevado la necesidad de reponer ese tejido óseo perdido con mayor frecuencia que anteriormente.15
El injerto óseo autógeno hasta ahora es considerado el mejor substituto óseo en defectos críticos, pero a pesar de sus ventajas, existen algunas desventajas que siguen causando problemas, tales como la mayor morbilidad y el ser un recurso capaz de agotarse, motivando de esta forma a diversas especialidades medico- odontológicas a procurar substitutos óseos a la altura, que posean las ventajas y minimizándose las desventajas.16 El mercado dispone de sustancias comercialmente consolidadas y algunas todavía en fase de prueba, que han sido usadas como sustitutos óseos efectivos, con algunas propiedades esperadas, tales como: biocompatibilidad, osteoconducción, osteoinducción y reabsorción.2
Entre los sustitutos óseos derivados del tejido óseo, optamos por utilizar el hueso desmineralizado de origen humano por ser uno de los mas utilizados en la odontología, por ser homógeno,17 y uno de los pocos, en esta categoría, disponibles comercialmente, además de presentar buenos resultados reconocidos científicamente.9,18 La propiedad discutible del hueso desmineralizado de origen humano de promover la osteoinducción, es un dato importante para que lo utilizáramos en esta investigación.9
Otra categoría de substitutos óseos es la compuesta por los no derivados del tejido óseo, como las cerámicas (hidroxiapatita, tricálcio- fosfato), vidrio bioactivo, sulfato de calcio y los polímeros, entre otros. Estos biomateriales son materiales sintéticos desarrollados con el objetivo de estimular y promover la reparación ósea, evitando la utilización del injerto o por lo menos minimizando su uso.14 En esta categoría destacamos los biopolímeros por presentar, en los últimos años, una gran evolución científica.18 Entre los biomateriales encontramos la poliuretana derivada del aceite de la mamona, que fue utilizada en este estudio, por encontrar su desarrollo total a nivel nacional, por ser de origen vegetal y de bajo coste,14 así como también por presentar pruebas científicas de biocompatibilidad, 23 y potencial de osteoconducción.14,18
Con el intento de evaluar los diferentes materiales que vienen siendo desarrollados para ayudar en la reparación ósea, varios métodos de pesquisa son utilizados. Según Frame,19 en 1980, un modelo animal ideal para la investigación de injertos óseos debe ser barato, de fácil disponibilidad y manipulación, así como presentar una región adecuada con hueso cortical y esponjoso que permita la preparación de cavidades óseas de tamaño suficiente para la investigación. En 1980 Frame,19 confirmo que la calota craneal de los conejos es una excelente región para realizar estudios de substitutos óseos que serán utilizados en los maxilares, debido a la semejanza que existen entre los huesos cranianos de los conejos y los maxilares de los humanos. Embriológicamente tienen el mismo origen, intramembranoso, morfológicamente, se encuentran formados por dos corticales separadas por hueso medular y fisiológicamente presentan el mismo patrón de reparación.19 Kramer y cols.20 (1968), demostraron que, la principal fuente de células osteogénicas es el tejido óseo de los márgenes del defecto, hecho que capacita a la calota de los conejos ,ya que la interferencia del perióstio es menor que en otras regiones tanto del conejo como de otros animales.
La utilización de defectos críticos (aquellos donde la reparación ósea espontánea no es capaz de rellenar el defecto en su totalidad con tejido óseo) en los modelos de estudio de injertos óseos tiene una importancia relevante, ya que cualquier neoformación de tejido óseo que ocurra puede ser atribuida al material que fue utilizado para su relleno.1,19 Un estudio completo realizado por Frame,19 en 1980, evaluó diversos diámetros en la calota craniana de conejos de la raza New Zealand y observó que las cavidades no presentaron reparación ósea cuando éstas eran mayores de 15 mm de diámetro; en este trabajo fueron confeccionadas cavidades de 10 mm de diámetro, tamaño considerado inferior al crítico, pero solo de esta forma sería capaz de realizar dos cavidades en la misma calota una para el grupo experimental y otra para el grupo control; cabe destacar que los diversos períodos de sacrificio (4, 7 e 15 semanas) permiten evaluar la regeneración ósea igual que si al final ocurriese reparación completa. Otra justificativa para el diámetro utilizado es que el objetivo principal del trabajo fue comparar la regeneración entre dos sustitutos óseos, y no la regeneración ósea natural de la calota del conejo.
Los resultados demostraron que al final del mayor período para el sacrificio, que eran 15 semanas, la reparación ósea espontánea no fue suficiente para promover la regeneración ósea completa entre los bordes de las cavidades control. Esto confirma los resultados de diversos autores que concuerdan que si el defecto crítico no recibe un tratamiento específico, sino que se permite la regeneración espontánea éste no tendrá una completa reparación ósea.10,22 Con ésto, la reparación ósea encontrada en las cavidades experimentales de este trabajo puede ser relacionada al relleno de las cavidades con la matriz ósea desmineralizada y es polímero de mamona. A pesar de que las cavidades utilizadas no son consideradas defectos óseos críticos, éstas presentaban un diámetro que permitió evaluar la capacidad de reparación de los sustitutos óseos utilizados.
De forma general, observamos a través del análisis histológico, que los materiales utilizados influenciaron positivamente en la neoformación ósea de los defectos mejorándola en calidad y cantidad, cuando comparadas con el grupo control. En ambos grupos experimentales la osteoconducción fue la vía responsable para la reparación. El hueso desmineralizado presentó un comportamiento semejante al encontrado por otros autores en diferentes trabajos.1,23
Con el objetivo de proporcionar una mayor comparación entre los materiales de estudio, utilizamos un análisis histométrico que es capaz de cuantificar la neoformación ósea.24,25
El análisis estadístico de las medidas histométricas en relación al volumen de hueso neoformado en el interior de los defectos, revelo, a través del test de Tukey a un 5% de probabilidad, una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos experimentales y el grupo control. Esto demuestra la importancia del relleno de los defectos con algún tipo sustituto para una reparación ósea con mayor cantidad y mejor calidad.
Cuando las medidas de los grupos experimentales fueron comparadas entre sí no hubo diferencia estadísticamente significante. A pesar de que numéricamente, el grupo Polímero de Mamona había presentado una mayor media de formación que el Hueso Desmineralizado. Frente a estos resultados podemos suponer que, talvez una muestra mayor o un mayor control de las variables, posibilitaría una diferencia significativa.
En la regeneración ósea, el uso de sustitutos osteocondutores está contraindicada en la reparación de grandes defectos, debido a que la regeneración ósea con este tipo de material se limita a la periferia del implante. Por esto, es importante la combinación de una matriz osteocondutora con materiales osteoindutores, como los factores de crecimiento, para obtenerse una reparación ósea completa.26
Conclusiones
El uso de poliuretana derivada del aceite de mamona y la matriz ósea desmineralizada de origen humano mejoran el proceso de regeneración cuando lo comparamos a la regeneración ósea normal siendo que entre ambos materiales tuvieron un comportamiento similar sin diferencias estadísticas significantes entre sí.
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Dirección para correspondencia:
José Rodrigues Laureano Filho
Facultad de Odontología de Pernambuco UPE
Área de Cirugía Buco Maxilofacial
Av. Gal Newton Cavalcanti, N 1650, 54.
753-220 Tabatinga - Camaragibe - Pernambuco, Brasil
Email: marvisallais@cirugia-maxilofacial.net
Recibido: 18.04.06
Aceptado: 01.06.07