INTRODUCCIÓN
Las ocratoxinas son una familia de micotoxinas producidas por el metabolismo secundario de algunos hongos de los géneros Aspergillus (Aspergillus ochraceus, Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus) y Penicillium (Penicillium verrucosum). De todas ellas, la más tóxica es la Ocratoxina A (OTA), que puede aparecer en diversos alimentos como cereales y granos de café, dependiendo de las condiciones de producción y almacenamiento, sobre todo respecto a humedad y temperatura. El límite máximo permitido de OTA en alimentos para consumo humano está regulado por el Reglamento (CE) No 1881/20061 y depende del tipo de alimento (Tabla 1).
Alimento | Contenido máximo de OTA (µg/kg) |
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Cereales no elaborados | 5 |
Uvas pasas (pasas de Corinto, sultanas y otras variedades de pasas) | 10 |
Café tostado en grano y café tostado molido (excluido el café soluble) | 5 |
Café soluble (café instantáneo) | 10 |
La OTA produce en el hombre alteraciones carcinogénicas, nefrotóxicas, teratogénicas, inmunotóxicas y neurotóxicas. En los animales también provoca serios problemas de salud, especialmente en el ganado porcino, afectando a la producción en dicho sector y de manera indirecta, al hombre2. Es tóxica por inhalación y por ingestión y presenta una elevada estabilidad, mostrando una gran resistencia a la acidez y a la temperatura. Su obtención es relativamente sencilla a partir de alimentos contaminados, por lo que podría ser utilizada como un agente de guerra biológico o en un ataque bioterrorista, pudiendo representar un serio problema tanto de salud pública como de seguridad2,3,4.
Por este motivo existe la necesidad de desarrollar y estandarizar métodos de detección rápidos y específicos, que contribuyan a garantizar la seguridad de los ciudadanos, permitiendo la atención médica y la aplicación de medidas de protección específicas en el menor tiempo posible.
Algunos métodos desarrollados para la detección de esta micotoxina están basados en técnicas de cromatografía líquida de alta resolución con detección de fluorescencia3,5. Estos son métodos rápidos, pero poco específicos6,7. En este sentido, la cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un detector de masas de tiempo de vuelo (HPLC-MSD (TOF)) se revela como una técnica de diagnóstico muy adecuada para conseguir una detección rápida y específica de esta micotoxina, ofreciendo la posibilidad de crear bases de datos de toxinas relevantes para la salud pública y la seguridad.
En un analizador de masas de tiempo de vuelo los iones generados en la fuente de ionización son retenidos mediante un potencial eléctrico y, seguidamente, son acelerados aplicando una diferencia de potencial eléctrico pulsado, adquiriendo una elevada energía cinética. De esta manera los iones recorren el tubo de vuelo, libre de campo, hacia el detector, con una velocidad constante inversamente relacionada con la raíz cuadrada de la relación de masa/carga de los iones, por tanto, el tiempo que tardan éstos en recorrer el tubo de vuelo y alcanzar el detector será proporcional a la relación masa/carga de los mismos. La resolución será mayor cuanto menor sea la dispersión de energía de los iones generados en la fuente. Esta dispersión se compensa mediante el uso de “reflectron” o “espejo iónico”, que reenfoca los iones de una misma relación masa/carga sobre el detector. Por estas características, este tipo de analizador ofrece una gran sensibilidad, resolución y especificidad, ya que todos los iones generados llegan al detector proporcionando información isotópica de los compuestos analizados8,9.
El objetivo de este trabajo es el desarrollo de un método de detección de ocratoxina A, rápido y específico, utilizando la técnica de cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un detector de masas de tiempo de vuelo (HPLC-MSD (TOF)).
MATERIAL Y MÉTODOS
Para el desarrollo de este trabajo se utilizó una solución patrón de ocratoxina A (Figura 1) en metanol de las siguientes concentraciones: 1 ppm, 2 ppm, 5 ppm y 10 ppm. Se utilizaron un equipo de HPLC 1200 y un MSD (TOF) 6210, ambos de Agilent Technologies, con una fuente de ionización electrospray (ESI).
En todos los ensayos se trabajó en condiciones de fase reversa y en modo isocrático, utilizando una columna cromatográfica Zorbax SB-C18, 2,1 x 150 mm (5µm) a 40 ºC y se inyectó 10 µL de la solución patrón de ocratoxina A.
Se llevaron a cabo 36 ensayos variando la composición y flujo de la fase móvil y las condiciones del detector de masas.
En la siguiente tabla se muestra las fases móviles utilizadas con sus respectivas proporciones (Tabla 2).
Fase móvil | Proporción (v/v) |
---|---|
Ácido acético 0,99 % / Acetonitrilo (ACN) | 60:40 |
Ácido acético 1% / ACN | 50:50 |
Ácido fórmico (0,1%) / ACN | 50:50 |
Ácido Fórmico (0,1%) / ACN | 70:30 |
Ácido fórmico (0,4%) / ACN | 50:50 |
Ácido fórmico (0,8%) / ACN | 50:50 |
Ácido fórmico (0,8%) / ACN | 55:45 |
Ácido fórmico (0,4%) / Ácido fórmico (0,1%) en ACN | 50:50 |
Ácido trifluoroacético (TFA) 0,01% / ACN | 50:50 |
TFA 0,01% / ACN | 55:45 |
TFA 0,01% / ACN | 60:40 |
TFA 0,1% / ACN | 50:50 |
TFA 0,01% / Metanol | 55:45 |
TFA 0,01% / Metanol | 50:50 |
Los valores de flujo de fase móvil ensayados fueron: 0,2; 0,4; 0,5; 0,6 y 0,7 mL/min.
En la tabla 3 se muestran los valores de los diferentes parámetros del detector de masas de tiempo de vuelo utilizados en los ensayos realizados.
Parámetros del detector de masas (TOF) | Valores |
---|---|
Presión del nebulizador (psi) | 30, 40, 50, 60 |
Flujo del gas de secado (L/min) | 10, 12, 13 |
Voltaje del capilar (V) | 3000, 3500, 4000 |
Fragmentador (V) | 50, 100, 150 |
Análisis de resultados
Se realizó el estudio del pico cromatográfico correspondiente a ocratoxina A obtenido a una concentración de 1 ppm. Las características analizadas fueron la simetría, área, anchura y altura de este pico, así como el tiempo de retención al que aparecía. Además, se realizó un cromatograma de extracción de iones (EIC) para completar dicho estudio. Los resultados obtenidos de este análisis permitieron la selección del método cromatográfico optimizado cuyos parámetros cromatográficos y del detector se muestran en las tablas 4 y 5.
Parámetros | Valores |
---|---|
Columna | Zorbax SB-C18, 2,1 x 150 mm (5µm) |
Temperatura columna | 40 ºC |
Volumen de inyección | 10 µL |
Fase móvil | Isocrático, ACN:Ácido Fórmico 0,1% (1:1) (v/v) |
Flujo | 0,7 mL/min |
Duración del ensayo | 10 minutos |
RESULTADOS
En la mayoría de los ensayos llevados a cabo se obtuvo un pico cromatográfico correspondiente a ocratoxina A.
El cromatograma obtenido con el método optimizado mostró el pico de OTA a un tiempo de retención de 1,791 ± 0,009 minutos y un área de pico de 5 x 106 (Figura 2).
En suespectro de masas (Figura 3) se observa el ion molecular [M+H]+ con una masa exacta de 404,07986 uma, así como su perfil isotópico característico (Figura 4).
En la tabla 6 se muestran las abundancias del ion molecular de la ocratoxina A y sus isótopos.
DISCUSIÓN
En la naturaleza existe un gran número de toxinas que podrían ser utilizadas como agentes de guerra biológicos, pudiendo originar un serio riesgo para la seguridad ciudadana. Para poder dar una protección adecuada a la sociedad frente a este tipo de riesgo es necesario desarrollar métodos de detección de estas toxinas que sean rápidos, sensibles y específicos. Además, sería interesante el desarrollo de métodos que permitan la detección simultánea de varias toxinas disminuyendo el tiempo de respuesta frente a un ataque con este tipo de agentes. Todo esto posibilitaría la aplicación de las medidas de protección y tratamiento concretas en el menor tiempo posible, ya que cuanto menor sea el tiempo transcurrido entre una posible contaminación y la aplicación de las contramedidas específicas, más posibilidades de éxito en recuperar a posibles víctimas existe.
En este sentido, los métodos cromatográficos son muy adecuados para la detección simultánea de diferentes toxinas10,11. Además, existen métodos oficiales para la detección de diferentes micotoxinas en alimentos (ocratoxina A, aflatoxinas, fumonisinas, etc.)12,13,14.
La cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas con diferentes tipos de analizadores nos ofrece la posibilidad de desarrollar métodos de detección rápidos, sensibles y específicos15,16. El uso de un analizador de masas de tiempo de vuelo proporciona información de masa exacta y distribución isotópica característica de los compuestos analizados, información fundamental en nuestro campo de actuación, detección de agentes de guerra biológica.
En este trabajo se han ensayado diferentes condiciones cromatográficas y espectrométricas dando como resultado, en la mayoría de los casos, un pico correspondiente a ocratoxina A. El estudio de las características de este pico ha permitido la optimización de un método cromatográfico para la detección de esta micotoxina. Con el método optimizado se ha obtenido un pico de OTA a un tiempo de retención corto (1,791 ± 0,009 minutos) lo cual nos indica que es un método rápido, con un área de 5 x106, lo cual nos indica que podría ser un método sensible. Además, el espectro de masas nos ha permitido obtener el ion molecular [M + H]+, la masa exacta y el perfil isotópico característico de esta micotoxina, lo que proporciona una gran especificidad.
Hay bastantes referencias bibliográficas sobre métodos de detección de ocratoxina A, y de micotoxinas en general, mediante cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas, la mayoría encaminados al control y regulación de la contaminación de alimentos de origen vegetal y animal por estas micotoxinas10,11,15,16, siendo su prioridad la detección y cuantificación de las mismas. En nuestro caso concreto, nuestra prioridad es la creación de bases de datos específicas de toxinas de interés en salud pública, animal y en Defensa, con potencial uso como agente de guerra biológica o sospechosas de ser utilizadas en un ataque bioterrorista. Por este motivo se han optimizado métodos cromatográficos acoplados a un detector de masas de tiempo de vuelo, que nos permite, por un lado, analizar y detectar una amplia variedad de toxinas y, por otro, nos proporciona información de masa exacta y perfil isotópico característico de cualquier compuesto analizado.