ORIGINAL

PREMIO AEBM.- REFERENCE 2002

El fenotipo de inestabilidad de microsatélites (MIN) revela un

patrón específico de mutaciones durante la carcinogénesis del colon

C. Esparza, P. Jiménez, R. Méndez, A. Clavero, C. Cabrera, F. Ruiz-Cabello 

Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Virgen de las Nieves, Granada.

Palabras clave: Inestabilidad de microsatélites, CCHNP, ß-2M, BAT26. 

Key Words: Microsatellite instability, HNPCC, ß-2M, BAT26. 

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Resumen 

Se ha investigado la presencia de mutaciones en genes ligados a apoptosis, crecimiento y diferenciación celular y respuesta inmunológica en 132 cánceres de colon escogidos al azar. Los tumores que presentaron alteraciones en estos genes, (BAX, TGFb-RII y b2m) parece constituir un grupo homogéneo que comparte la característica de inestabilidad de microsatélites, ya que todos ellos presentaron inestabilidad en BAT 26 y BAT40. Por el contrario, ninguno de los tumores MIN negativos presentaron alteraciones en las zonas de repetición de los genes anteriormente mencionados aún cuando algunos de ellos también tenían alteraciones en la expresión de antígenos de HLA, pero nunca asociadas a mutaciones en el gen de la b2m. El hecho de que en la mayoría de los casos, las mutaciones detectadas representan inactivaciones bialélicas, supone que estos genes están involucrados en la carcinogénesis de estos tumores, mediante un proceso de selección clonal, y probablemente a través de una ruta mutagénica diferente de la que se observa en la mayoría de los cánceres de colon esporádicos. 

Summary 

It has been investigated the presence of mutations in apoptosis, growth and cellular diferentiation and immunologic related genes in a total of 132 colon cancers chosen at random. The tumors that presented alterations at BAX, TGFb-RII and b2m genes appear to constitute a homogeneous group that shares the characteristic of microsatellite instability at BAT 26 and BAT40 loci. On the contrary, none of the tumors MIN negatives presented alterations in the repetition elements of these genes, although some of them also had alterations in the expression of antigens of HLA, but never associated to mutations in the gene of b2m gene. The fact that in most of the cases, the detected mutations represent biallelic inactivations, it supposes that these genes are involved in the tumorigenesis of these tumors, by a selection clonal process, and probably through a mutagenic pathway different of the observed in most of the sporadic colon cancers. 

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Introducción 

El cáncer colorrectal es la segunda enfermedad maligna diagnosticada más frecuentemente, y constituye la segunda causa más común de muerte por cáncer en el mundo occidental¹. Desde el punto de vista de genética molecular, un neoplasma se puede considerar como una proliferación clonal de células caracterizada por un crecimiento autónomo, y que presentan alteraciones genéticas heredadas o adquiridas de novo en el transcurso de la evolución del tumor. La generación de células tumorales es un proceso aleatorio pero en donde interviene un proceso de selección de clonas que escapan a los mecanismos de control proliferativo e inmunológico. En los cánceres colorrectales de fenotipo MIN dicho proceso podría dividirse en dos etapas². En la primera de estas etapas las mutaciones mutadoras en los genes de las proteínas reparadoras de ADN son responsables de la acumulación de cientos de miles de mutaciones somáticas de carácter clonal en zonas de repetición del ADN o microsatélites, debido a la incapacidad de reparación de errores en la replicación por alineamiento desigual en las cadenas de ADN. Las mutaciones en los microsatélites se acumulan indiscriminadamente a lo largo del genoma de la célula. En principio este estado de hipermutación no confiere a la célula ninguna propiedad neoplásica. Este aumento en la producción de mutaciones puede hacer que el proceso de tumorogénesis se acelere pero no es necesariamente la causa por la que ocurre. Por el contrario el aumento de la cantidad de mutaciones puede tener efectos negativos en la progresión del tumor, sobre todo en tumores tempranos la existencia de una gran carga de mutaciones lleva al apoptosis celular³ o a un proceso de envejecimiento prematuro. Incluso en cánceres colorrectales en estadio tardío progresan lentamente y tienen mejor pronóstico. En una segunda etapa también denominada etapa explosiva, se produce la transformación neoplásica. Esta transformación aparece cuando el estado hipermutador afecta a genes tumorales, relacionados con la diferenciación celular⁴, apoptosis⁵ o involucrados en el escape inmunológico⁶. Se produce pues una selección de estas clonas celulares que han adquirido una ventaja evolutiva frente al resto, que conlleva el desarrollo del tumor. Sería pues la selección y no el número de mutaciones la fuerza impulsora del crecimiento tumoral⁷. 

En nuestro estudio hemos realizado un estudio del patrón de mutaciones en microsatélites, con objeto tanto de determinar los marcadores de microsatélites ideales para la detección de este tipo de cáncer colorrectal en la práctica clínica como de dilucidar el proceso evolutivo y las vías de escape inmunológico de estas tumoraciones. 


Material y métodos 

Se han estudiado 132 casos de adenomas remitidos desde el Servicio de Digestivo del Hospital Virgen de las Nieves, Granada. El estudio se realizó sin ningún tipo de sesgo en la recogida de la muestra y sin conocimiento previo de la historia clínica de los pacientes. 

Se extrajo ADN de la pieza tumoral y de la mucosa normal, o en su defecto de los linfocitos del paciente. En aquellos casos positivos para inestabilidad de microsatélites, se realizó microdisección de la pieza tumoral para aumentar la sensibilidad del ensayo. Además se estudiaron muestras conservadas en parafina de los pacientes CO123 y CO140, correspondientes a distintos controles y a tumoraciones extracolónicas. 

En nuestro estudio hemos utilizado un panel de cuatro marcadores de repetición de mononucleótidos. Dos en zona no codificante BAT-26-poly(A)26, BAT40-poly (A)40 por su elevada sensibilidad; y otros presentes en genes relacionados con la proliferación celular, la apoptosis y la respuesta inmune: respectivamente los microsatélites TGFB- RII-poly(A)10 y BAX-poly(G)8 y varias regiones de repetición presentes en el gen de la B2microglobulina humana, un componente estructural de los antígenos HLA, necesarios para el reconocimiento inmunológico. 

Se amplificaron las secuencias mediante PCR, como ha sido previamente descrito⁸ aunque en este estudio se utilizaron cebadores fluorescentes. Los microsatélites de la b2m fueron analizados por secuenciación directa del DNA o RNA extraído de microdisección. Posteriormente las muestras fueron analizadas mediante electroforesis capilar en un secuenciador automático. Los resultados fueron procesados con el programa informático Genotyper y/o Sequense-Analysis. 


Resultados 

De los 132 pacientes encontramos diez presentaban inestabilidad de microsatélites (tabla I). 

 

Mutaciones en BAT 26 

Los diez casos inestables presentaron alteraciones en el marcador BAT 26, en todos los casos se produjo la aparición de un alelo inestable de menor tamaño que el alelo salvaje. En ningún momento se produjo solapamiento en los tamaños entre los alelos (tabla II). 

 

Mutaciones en BAT 40 

Los diez casos inestables presentaron alteraciones en el marcador BAT 40, en todos los casos se produjo la aparición de un alelo inestable de menor tamaño que el alelo salvaje. En este marcador si se encontró solapamiento de tamaños entre los alelos (tabla II). 

Mutaciones en el receptor de TGFBII 

Se detectaron ocho casos con inestabilidad en TGFBII, el estudio tras microdisección confirmó este hallazgo en los resultados dudosos, obtenidos al analizar la muestra completa (Figura 1a). 

 

Mutaciones en el gen BAX 

En cuatro de los siete casos en los que se pudo analizar el gen BAX, el perfil obtenido fue de inestabilidad. En todos los casos para la detección del alelo inestable fue necesaria la realización de microdisección (Figura1b). 

Mutaciones en el gen de la B2m humana 

El análisis de la expresión del gen mediante inmunoohistoquímica con anticuerpos monoclonales contra la B2m humana reveló la presencia de tumores con pérdida total de estos antígenos en 4 de los 10 casos que presentaban el fenotipo de inestabilidad de microsatélites. La expresión de antígenos HLA en el tejido tumoral fue totalmente negativa lo que revelaba claramente que este evento molecular (pérdida total de expresión de estos antígenos) debió de constituir una etapa importante en la evolución del tumor (Figura 2). Las mutaciones fueron identificadas tras el análisis de todo el gen de la B2m (Tabla III), ejemplo de mutación en Figura 3. Dos casos revelaron la presencia de mutaciones heterozigotas que conducirán a la aparición de condones stop y por tanto a la síntesis de proteínas no funcionantes. En otros dos casos, las mutaciones dieron lugar a mRNAs inestables y no se obtuvo amplificación a partir del cDNA. En estos 2 casos, las mutaciones se detectaron a partir del DNA obtenido de nidos tumorales microdisectados. El patrón de secuenciación reveló la existencia de una única mutación, lo que sugería la presencia de mutaciones homozigotas (bastante improbables) o la deleción de una copia entera del gen (más probable). 

 

Estudio familiar 

Tras consultar las historias clínicas de los diez casos inestables, detectamos que dos de los pacientes eran hermanos. Se procedió al estudio de muestras conservadas en parafina de distintos controles realizados. El hallazgo más interesante fue la detección de inestabilidad en una muestra de adenoma descrita en el informe como anatomopatológicamente normal (Figura 4). 

 

Discusión y conclusiones 

La utilización de estos marcadores es de enorme utilidad para la detección rápida de familias susceptibles de presentar HNPCC sin necesidad de realizar estudio genético en los genes reparadores. Especialmente el marcador BAT 26, al presentar una carácter cuasimonomórfico y no existir solapamiento entre alelos inestables y estables en nuestra población, podría utilizarse para descartar casos normales sin necesidad de análisis paralelo de tejido normal. Además su alta representatividad en toda la muestra⁹, reflejada en la no necesidad de realizar microdisección, simplifica el proceso de análisis y aumenta la sensibilidad frente a la utilización de otros marcadores. El hallazgo de inestabilidad en la muestra de adenoma, anatomopatológicamente informado como normal, es un dato muy interesante que nos permitirá clasificar a pacientes con altas probabilidades de padecer este síndrome hereditario pero de los que no se conoce la mutación familiar. Por lo que sería recomendable realizar este análisis en las muestras obtenidas de las colonoscopias de revisión en pacientes con alto riesgo de padecer HNPCC bien por su historia familiar o por la edad de aparición de la primera tumoración. 

La acumulación de mutaciones en 2 o más de estos marcadores en el tejido tumoral refleja de forma inequívoca el fenotipo MIN, la posibilidad de un componente presente en la línea germinal y la indicación de estudios genéticos con detalle. Finalmente, la inactivación de genes ligados al crecimiento celular, (TGFRII), a la apoptosis, BAX y a la respuesta inmunológica, B2M refleja la historia natural de este grupo de tumores de colon que no sólo presentan características clínicas diferentes (en general son de mejor pronóstico) sino genéticas, con ausencia de grandes aberraciones cromosómicas y de mutaciones en p53. 

El mejor pronóstico de estos tumores, ha sido relacionado por una mayor respuesta inmunológica. De hecho, estos tumores suelen presentar un mayor infiltrado inflamatorio. Muy probablemente, la mayor respuesta inflamatoria está relacionada por la activación de numerosos clonos de células T que están reconociendo un gran número de epítopos extraños que son a su vez el resultado del gran número de proteínas mutadas. No obstante, no todas estas proteínas mutadas tienen el mismo impacto biológico sobre la historia del cáncer en estos pacientes. Por este motivo, no resulta sorprendente que sean precisamente aquellas que tienen una participación en los mecanismos de control de la proliferación, apoptosis y respuesta inmune las que sean seleccionadas. En este sentido, cabe destacar las mutaciones encontradas en el gen de la B2m (Tabla III), un componente estructural de los antígenos HLA y por tanto de la respuesta inmune mediada por linfocitos T. La inactivación del gen parece producirse por la aparición de mutaciones capaces de eliminar la expresión de las dos copias génicas. Este hecho resulta revelador por cuanto las mutaciones son representativas de toda la masa tumoral. Esta homogenidad no se ha podido constatar ni para TGFBR ni para BAX lo cual indicaría que la inactivación de las dos copias del gen B2m representan una etapa evolutiva importante en el desarrollo de estos tumores. Es decir la segunda mutación conlleva la pérdida total de la expresión génica y la expansión de esta clona probablemente por escape inmunológico¹⁰. Dado, que la única función conocida de la B2m, es la de actuar como soporte estructural de la cadena pesada de los antígenos HLA, su inactivación tiene por objetivo, evitar la respuesta inmune, lo cual, en estos tumores que son particularmente inmunogénicos, constituye un proceso crucial en la evolución del tumor. 

Agradecimientos 

Agradecemos a Inmaculada Delgado y a Josefa Gil por su experta sistencia técnica. Esta trabajo fue financiado por el Fondo de Investigaciones Sanitarias, Servicio Andaluz de Salud. 

 

Bibliografía 

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