ARTÍCULO ORIGINAL

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NEUROPROTECCIÓN DE LAS CÉLULAS GANGLIONARES
DE LA RETINA

RETINAL GANGLION CELL NEUROPROTECTION IN CULTURE

GARCÍA M¹, RUIZ EDERRA J², HERNÁNDEZ-BARBÁCHANO E¹, URCOLA JA³, BILBAO J⁴,
ARAIZ J⁵, DURÁN JA⁵, VECINO E¹

RESUMEN Objetivo: Estudiar la supervivencia de las células ganglionares de la retina (CGR) de cerdo en cultivo, analizando el posible efecto neuroprotector de las células de Müller de la retina (CMR) y del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). Métodos: Las retinas de cerdo adulto fueron disociadas y cultivadas en diferentes condiciones: 1) sobre sustrato de laminina/poli-D-lisina en medio de cultivo químicamente definido; 2) sobre sustrato de laminina/poli-D-lisina en medio químicamente definido al que se añadió BDNF; 3) sobre monocapas de CMR en medio químicamente definido; 4) sobre sustrato de laminina/poli-D-lisina en medio condicionado procedente del sobrenadante de las CMR. Las CGR fueron identificadas mediante inmunocitoquímica, utilizando anticuerpos contra el neurofilamento de 68 kDa, y observadas con un microscopio de fluorescencia. Se analizó la supervivencia para cada condición de cultivo y se clasificaron las CGR en función de su tamaño y del número y longitud de las neuritas. Resultados: La supervivencia de las CGR aumentó cuando las células fueron cultivadas sobre monocapas confluentes de CMR o en medio condicionado. Estas condiciones produjeron un incremento en el área media de las células y un aumento en el número de neuritas emitidas por cada célula, así como en la longitud de las neuritas. Cuando el medio de cultivo se suplementó con BDNF no se obtuvo ningún efecto sobre la supervivencia de las CGR aunque aumentó el tamaño, y el número y longitud de sus neuritas. Conclusión: Nuestro trabajo demuestra que algún/os factor/es secretados por las células de Müller tienen un efecto neuroprotector sobre las CGR in vitro. El BDNF produce también un incremento en el área media de las células y favorece la formación de neuritas, sin embargo no aumenta la supervivencia. Palabras clave: Células ganglionares de la retina, células de Müller, neuroprotección, cerdo, BDNF.

SUMMARY Purpose: To study the pig retinal ganglion cell (RGC) survival in culture, analysing the possible neuroprotective effect of retinal Müller glia (RMG) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Methods: Adult pig retina were dissociated and cultured under different conditions: 1) on laminin/poly-D-lysine-coated coverslips in chemically defined medium (CDM); 2) on laminin/poly-D-lysine-coated coverslips in CMD supplemented with BDNF; 3) on confluent monolayer cultures of RMG in CDM; 4) on laminin/poly-D-lysine substrate in conditioned medium obtained from RMG. RGCs were identified by immunocytochemistry using antibody against 68 kDa neurofilament and observed under an fluorescent microscope. RGCs were classified on the basis of the size, number and length of neurites, and their survival was assayed for each treatment. Results: Confluent RMG substrates and RMG conditioned medium significantly increased the survival of cultured pig RGC. Moreover these two conditions increased the mean area of RGCs and enhanced neurite growth and elongation. Addition of BDNF to culture medium did not modify survival but increased RGC size, neurite number and neurite length. Conclusions: These findings demonstrate that factor(s) secreted by RMG exert beneficial effects on adult RGC survival and neurite regeneration in vitro, and might constitute important agent(s) for RGC neuroprotection. BDNF also increases the mean area of RGCs and enhances neurite growth but it does not increase the survival of RGCs (Arch Soc Esp Oftalmol 2003; 78: 151-158). Key words: Retina ganglion cells, Müller cells, neuroprotection, pig, BDNF.

 

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Recibido:19/6/02. Aceptado: 11/2/03.
Departamento Biología Celular. Facultad de Medicina. Universidad del País Vasco. Lejona. Vizcaya. España. 
¹ Doctor en Biología.
² Licenciado en Biología. 
³ Licenciado en Medicina. 
⁴ Doctor en Medicina. Dpto.. Medicina Preventiva y Salud Pública. Facultad Medicina. Universidad del País Vasco.. 
⁵ Doctor en Medicina. Dpto. Dermatología, Oftalmología y Otorrinolaringología. Facultad de Medicina. Universidad del País Vasco. 
Presentado parcialmente como comunicación al Annual Meeting of the Association for Research in Vision and Ophthalmology, Fort Lauderdale, Florida; 5-10 de mayo de 2002.
Proyecto subvencionado: Univ. País Vasco (1/UPV00075.327-E-14887/2002) and European Community (Pro Age Ret QLK6-2000-00569). 
Los autores manifiestan que no tienen interés comercial ni han recibido apoyo económico.. 

Correspondencia: 
Elena Vecino
Dpto. Biología Celular e Histología
Facultad de Medicina. Universidad del País Vasco
48940 Leioa (Vizcaya)
España
E-mail: gcpvecoe@lg.ehu.es 

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INTRODUCCIÓN

Las células ganglionares de la retina (CGR) mueren por apoptosis durante la axotomía y el glaucoma (1,2), dicho proceso parece ser selectivo y no afecta por igual a los distintos tipos de CGR (3-5).

Se ha descrito que los factores neurotróficos como el BDNF, favorecen la supervivencia de las CGR tras la axotomía (3,4,6) y tras el incremento crónico de la presión intraocular (7).

Por otro lado, se ha demostrado que las células de Müller de la retina (CMR), que constituyen el tipo glial más representado en la retina, protegen contra el efecto excitotóxico del glutamato y aumentan la supervivencia de las CGR en cultivo (8). Estas células gliales sintetizan algunos factores neurotróficos como el factor de crecimiento de fibroblastos (9) y el factor neurotrófico ciliar (10), que podrían estar implicados en el efecto neuroprotector de estas células.

Teniendo en cuenta estos antecedentes nos planteamos estudiar la respuesta de las CGR de cerdo adulto en diferentes condiciones de cultivo, en concreto analizamos el efecto del BDNF y las CMR sobre la supervivencia y regeneración de las CGR. Hemos utilizado la retina de cerdo como modelo experimental por la gran similitud que tiene con la retina humana.

MATERIAL Y MÉTODO

Cultivo de las células de la retina

Toda la experimentación con animales se realizó siguiendo la normativa de ARVO para el uso de animales en la Investigación.

Los ojos de cerdo, procedentes del matadero, fueron procesados mediante el método descrito por Gaudin et al (11). La digestión del tejido se llevó a cabo utilizando papaína activada al 0,2% (Worthington, Lakewood, USA). Los fragmentos se disociaron mediante disgregaciones repetidas y las células aisladas se sembraron en DMEM/Hams-F12, al que se añadió un 5% de suero fetal bovino (FCS) y penicilina-estreptomicina (10 UI).

El número de células y su viabilidad se analizó utilizando la técnica del azul de tripano. Las células se cultivaron a una densidad de 5 x 10⁵ células/cm² sobre cubreobjetos estériles pretratados secuencialmente con poli-D-lisina (2 µg/cm² durante 1 hora, Sigma-Aldrich) y laminina (1 µg/cm² durante toda la noche; Sigma-Aldrich). Los cultivos celulares se mantuvieron en incubador humidificado en atmósfera de 5% CO₂/95% O₂.

Tratamientos in vitro

Las CGR de cerdo se cultivaron en diferentes condiciones.

Control: medio químicamente definido (MQD): Sobre sustrato de laminina/polilisina durante 24 horas en DMEM/5% FCS, tras lo cual se lavaron y mantuvieron en MQD durante 5 días antes de la fijación.

BDNF: Sobre sustrato de laminina/polilisina durante 24 horas tras lo cual se transfirieron a MQD al que se añadió 10 ng/ml de BDNF (R&D Systems, Abingdon, U.K.). Las células se mantuvieron en estas condiciones durante 5 días tras los cuales se procedió a su fijación.

Células de Müller confluentes (CoCMR): Las CGR se cultivaron sobre monocapas de CMR. Estas monocapas se prepararon previamente a partir de retina de cerdo, siguiendo el método de Guidry (12). Las células de Müller aisladas se cultivaron a una densidad final de 6 x 10⁵ células/cm², sobre cubreobjetos pretratados con laminina y polilisina. Tras 6 días en cultivo, las CMR son confluentes y pudieron ser utilizadas como sustrato para el cultivo de CGR.

Medio Condicionado (MC): Las CMR se cultivaron hasta que se hicieron confluentes (6d) y se mantuvieron en presencia de MQD durante 24 horas. El medio fue recogido y tras ser diluido 1:1 (v/v) con MQD fresco, se añadió a los cultivos controles de CGR tras 24 horas en DMEM/5% FCS.

Inmunocitoquímica

Tras 6 días in vitro, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% y se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100. Se incubaron con anticuerpo primario monoclonal anti-neurofilamento (NF) 68 kDa (10 µg/ml; Sigma-Aldrich) y a continuación con el anticuerpo secundario cabra anti-ratón IgG/Bodipy FL (10 µg/ml, Molecular Probes, Portland, OR). Los núcleos de las células se marcaron con 4,6-diaminodiphenyl-2-phenylindole (DAPI; 10 µg/ml; Sigma-Aldrich). Las preparaciones se lavaron con PBS, se montaron y se observaron en un microscopio de fluorescencia Axioskop 2 (Zeiss, Jena, Germany).

Los controles inmunocitoquímicos consistieron en la omisión del primer anticuerpo, la omisión del segundo anticuerpo y el uso del correspondiente suero no inmunorreactivo.

Análisis de la supervivencia celular

Con el fin de determinar el efecto de las distintas condiciones de cultivo sobre la supervivencia de las CGR se realizó el recuento de las CGR inmunopositivas a NF-68 en cultivos preparados de 10 retinas, el anticuerpo anti-NF68 marca específicamente las células ganglionares de la retina. Se determinó el porcentaje de CGR que sobrevivieron en las distintas condiciones de cultivo con respecto al control (MQD, 100%) El análisis estadístico de los resultados se llevó a cabo mediante el método de la X² para comparar frecuencias, utilizando el software informático SPSS, SPSS Inc, USA (versión 10.0.6).

Análisis de la morfología celular

Para analizar la morfología de las CGR en cultivo se tomaron imágenes de todas las CGR localizadas en 182 campos, correspondientes a un área de 44,8 mm². Las fotografías se realizaron utilizando una cámara digital Coolsnap (RS Photometrics, Tucson, USA). Un número total de 10.850 células fueron fotografiadas y medidas. Los parámetros analizados para cada tratamiento fueron: tamaño del soma, número de neuritas y longitud total de todas las neuritas. Las medidas se realizaron sobre las imágenes digitales utilizando los programas de análisis de imagen: Scion Image, Frederick, Maryland, USA (versión para Windows 95/98) y Spot, Diagnostic Instruments inc, USA (versión 2.2.2).

Las CGR se clasificaron en tres grupos dependiendo del tamaño del soma: a) pequeñas (diámetro del soma menor de 14 µm); b) medianas (somas de entre 15-20 µm de diámetro), y c) grandes (somas de diámetro superior a 21 µm).

El análisis estadístico de los resultados se llevó a cabo mediante el modelo lineal general univariante seguido del test de Tamhane. El nivel de significación se consideró p<0,05.

RESULTADOS

Efecto de las distintas condiciones sobre la supervivencia y la distribución por tamaños de las CGR

En la figura 1 se muestran los resultados obtenidos tras el análisis de la supervivencia de las CGR, observamos que las CMR confluentes y el MC aumentan la supervivencia de las CGR in vitro, los porcentajes con respecto al MQD son 110,4 D.E. (desviación estándar de la media) 3,4 (p<0,05) para CoCMG y 116,7 D.E. 4,8% (p<0,01) para MC. Sin embargo no observamos un aumento significativo de la supervivencia cuando el medio de cultivo se suplementó con BDNF (104,6 D.E. 6,2% respecto a control).

En cuanto a la clasificación de las CGR por tamaños, observamos que los tres tratamientos en estudio produjeron una disminución en el porcentaje de células pequeñas y un aumento en el número de células grandes con respecto a control (p<0,01 para todos los tratamientos) (fig. 1).

Fig. 1. Efecto de las distintas condiciones de cultivo sobre la supervivencia de los diferentes tipos
de células ganglionares de la retina (CGR). Se muestra el número total de CGR grandes,
medianas y pequeñas en las diferentes condiciones analizadas (n= 10 retinas). MQD: medio
químicamente definido; BDNF: MQD + 10 ng/ml BDNF, CoCMR: sustrato de células de Müller
confluentes; MC: medio condicionado procedente de las células de Müller. 

Efecto de las distintas condiciones sobre el crecimiento de las neuritas

El porcentaje de CGR con neuritas aumentó significativamente en todas las condiciones experimentales (tabla I).

En cuanto a la longitud total media de las neuritas observamos que el BDNF incrementa la longitud de las neuritas de las CGR con respecto a control y que este crecimiento es mayor cuando las células crecen en presencia de CoCMR o con MC (tabla II).

Además de un aumento significativo en el número de neuritas y en la longitud de las neuritas en los tratamientos CoCMR y MC, nuestros resultados muestran que, cuando las CGR crecen sobre CMR confluentes las neuritas de las CGR se disponen paralelas al eje mayor de las células de Müller que constituyen la monocapa del sustrato (fig. 2 C).

Fig. 2. Imágenes representativas de células ganglionares de la retina (CGR) creciendo en las diferentes
condiciones de cultivo. A) CGR creciendo sobre sustrato de lamininina-polilisina con medio de cultivo
químicamente definido (MQD); B) CGR cultivada sobre sustrato de laminina polilisina en MQD al que se añadió
BDNF (BDNF); C) CGR cultivadas sobre células de Müller confluentes (CoCMR); D) CGR en cultivo con medio
condicionado de las células de Müller (MC). Las fotografías fueron tomadas utilizando un filtro triple,
NF200 (verde), NF68 (rojo) y núcleos (DAPI). Escala 50 mm. 

DISCUSIÓN

Efecto del BDNF

Se ha sugerido que el bloqueo en el transporte retrógrado de neurotrofinas desde el cerebro puede ser una de las causas de la muerte de las CGR durante el glaucoma (13). Sin embargo, algunos autores han sugerido que el BDNF que se encuentra en la retina no procede únicamente de los centros diana, sino que parte de esta neurotrofina se produce de forma local y actuaría de forma autocrina (14,15). Nuestro estudio demuestra que la administración de BDNF no modifica la supervivencia de las CGR de cerdo adulto en cultivo. Es posible que el BDNF producido por las CGR en cultivo sea suficiente para mantener la supervivencia de dichas células. Además el BDNF podría limitar su efecto neuroprotector a través de la inhibición del receptor TrkB tras la aplicación de dosis altas de la neurotrofina (16).

La muerte de las CGR durante el glaucoma es selectiva y no afecta de la misma forma a las células grandes, medianas y pequeñas (5). Además, in vitro se ha demostrado diferente susceptibilidad a la muerte en condiciones de hipoxia (17) o tras la administración de glutamato (18).

Nuestro trabajo demuestra que el BDNF aumenta el porcentaje de CGR grandes en cultivo. Se ha descrito que el BDNF tiene distintos efectos sobre la supervivencia de las CGR pequeñas y grandes en cultivos de retina de rata (19), y que las células grandes tienen una mayor afinidad por el BDNF que las medianas (3). La diferente respuesta de los distintos tipos celulares al BDNF podría deberse a diferencias en el número o tipo de receptores TrkB presentes en las células de distinto tamaño.

En el sistema visual las neurotrofinas estimulan el crecimiento de las neuritas (20). En nuestro estudio se demuestra que el BDNF incrementa la longitud y el número de neuritas en CGR de cerdo adulto. Este efecto del BDNF ha sido observado in vitro por otros autores (21) y parece estar mediado por receptores TrkB.

Efecto de las células de Müller de la retina

Las células gliales mantienen el funcionamiento normal del sistema nervioso principalmente a través de la liberación de metabolitos y factores de crecimiento. Nuestros resultados demuestran que la supervivencia de las CGR de cerdo es mayor cuando estas células crecen sobre CoCMR. Este efecto no parece estar mediado únicamente por el sustrato ya que observamos un efecto similar en presencia de MC. El efecto beneficioso de las CMR sobre las CGR ha sido demostrado in vitro en condiciones de hipoxia o tras la exposición a glutamato (8,17).

Además de un aumento en la supervivencia observamos que las CMR producen un incremento en el área media de las CGR, esto se corresponde con una disminución significativa en el número de células pequeñas y un incremento en el número de células grandes. Es posible que algún factor liberado por las CMR confluentes tenga un efecto selectivo sobre las distintas subpoblaciones de CGR. En este sentido se ha demostrado que las células gliales confluentes reducen la supervivencia sólo de las CGR pequeñas in vitro (22). Por otro lado, observamos que el efecto sobre la distribución de las CGR es menor en MC que en CoCMR lo que indicaría que el sustrato y el factor soluble presente en las CoCMR podrían tener un efecto sinérgico en cultivo. Otra hipótesis que explicaría el aumento del área media del soma cuando las CGR se cultivan en presencia de CoCMR o de MC se basa en un efecto trófico generalizado de estas dos condiciones sobre el tamaño de las células. Tanto el tratamiento CoCMR como el MC producen una disminución en los porcentajes de CGR pequeñas, lo que podría explicarse si la adhesión de las CGR produjera un aumento de tamaño de las células, haciendo que las células pequeñas y medianas pasaran a considerarse medianas y grandes respectivamente. Es posible que este aumento de tamaño de las CGR se produzca, ya que se ha descrito en rata que las CGR tienen la capacidad de aumentar de tamaño durante el glaucoma (23).

Por último, nuestros resultados muestran que cuando las CGR crecen sobre CoCMR presentan mayor número de neuritas y que estas neuritas son más largas. Parece que algún factor liberado desde las CMR es responsable del incremento del crecimiento de las neuritas en las CGR en cultivo. Este factor podría actuar asociándose con el sustrato y favoreciendo el crecimiento de las neuritas o directamente sobre las CGR a través de la estimulación de la transcripción de proteínas del citoesqueleto (24).

En conclusión nuestro estudio demuestra que las CMR confluentes tienen un efecto neuroprotector sobre las CGR de cerdo adulto en cultivo. Este efecto de las CMR no estaría mediado principalmente por la adhesión de las células al sustrato ya que el MC produce una respuesta similar. Esto sugiere que un/os factor/es producido/s y liberado/s al medio por las CMR es/son responsable/s de estos efectos. La caracterización e identificación de estas moléculas puede ser de gran interés desde el punto de vista terapéutico para proteger a las CGR de la degeneración producida por enfermedades como el glaucoma.

 

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