Efecto del ácido trans-retinoico sobre la recidiva tumoral y el desarrollo metastásico

I. García-Alonso, T. Palomares, A. Alonso-Varona¹, B. Castro¹, M. del Olmo¹, V. Portuga¹ y J. Méndez

Laboratorio de Cirugía Experimental. ¹Dpto. de Biología Celular e Histología. Facultad de Medicina y Odontología. Lejona. Vizcaya

RESUMEN

Objetivo: el ácido trans-retinoico (ATRA, "all-trans retinoic acid") es un agente inductor de la diferenciación celular. Se estudia su efecto sobre la recidiva local y la diseminación metastásica de los tumores sólidos.
Diseño experimental: mediante inoculación subcutánea de células de rabdomiosarcoma (S4MH) se ha inducido un tumor en ratas WAG/RijCrl. Tras 25 días, se practicó una tumorectomía y simultáneamente hepatectomía del 40%. Los animales se sacrificaron el día 35, y fueron sometidos a estudio necrópsico. La mitad de los animales fueron tratados con ATRA (5 mg/kg, i.p.) desde el día 22 al 35, mientras que los controles recibieron el excipiente (Clinoleico^®/etanol 90/10).
Resultados: el tratamiento redujo la tasa de recidiva local del 70 al 33% (p < 0,05), aunque no afectó a su tamaño (1,8 vs. 2,0 cc). El volumen medio de las metástasis inguinales se redujo a la sexta parte (0,2 vs. 1,2 cc; p < 0,05), si bien su frecuencia aumentó con el ATRA (86 vs. 29%; p < 0,05). La extensión retroperitoneal del rabdomisoarcoma también se redujo (0,7 vs. 5,1 cc; p < 0,05), aunque no hubo variación en la incidencia (71 vs. 67%). La incidencia de afectación pulmonar (100% en controles) se redujo hasta el 33% (p < 0,05), a la vez que el número medio de focos en el pulmón pasó de 26,7 a 5,7 (p < 0,05).
Conclusión: la estrategia terapéutica fundamentada en el tratamiento pre y postextirpación quirúrgica con retinoides podría favorecer el control local de rabdomiosarcomas sometidos a cirugía.

Palabras clave: Rata. Rabdomiosarcoma. Recidiva. Metástasis. Ácido trans-retinoico.

INTRODUCCIÓN

La terapéutica antineoplásica ha experimentado una gran evolución en la última década, y dentro de ella la cirugía sigue siendo el principal tratamiento con intención curativa. Sin embargo, la recidiva tumoral tras la cirugía de exéresis constituye todavía un problema clínico de gran relevancia; no sólo por el fallo del control local, sino también por su influencia en la diseminación a distancia de la enfermedad, y en la disminución de la calidad de vida y de la supervivencia de los pacientes (1).

La recidiva tumoral, si bien se ve condicionada en gran medida por la radicalidad de la cirugía, también puede verse inducida por las respuestas biológicas iniciadas tras la agresión tisular del acto quirúrgico. De hecho, en un modelo de carcinogénesis experimental, se pudo observar que la frecuencia de aparición de tumores de colon tras la aplicación de un carcinógeno fue muy superior en el seno de anastomosis cólicas en proceso de cicatrización (2).

Se debe tener presente que en la herida quirúrgica se produce la liberación local de múltiples factores de crecimiento responsables de la cicatrización, que también pueden actuar como factores paracrinos que estimulan la capacidad de desplazamiento y la proliferación de las células tumorales (3). Entre estos factores de crecimiento caben destacar el factor de crecimiento fibroblástico beta (FGFb), el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento hepatocitario (HGF) y otros (4-6). Por lo tanto, resulta importante diseñar tratamientos complementarios a la cirugía que, sin comprometer el proceso de cicatrización, inhiban la proliferación de las células tumorales residuales.

Es un hecho constatado que el comportamiento de un tumor está relacionado con el grado de diferenciación de las células neoplásicas, de manera que cuanto menor es su grado de diferenciación mayor agresividad suele presentar. Por este motivo, en el presente trabajo se ha planteado como estrategia terapéutica complementaria a la cirugía, la inducción de la diferenciación para intentar frenar el desarrollo tumoral, tanto en la localización del tumor primario como de sus metástasis. El ácido retinoico, así como sus moléculas relacionadas, han demostrado ser agentes con capacidad para disminuir la agresividad de diferentes líneas tumorales in vitro (7) e in vivo (8), a través de la inducción de la diferenciación celular (9) y de la apoptosis. En este sentido, en estudios recientes hemos demostrado que el ácido trans-retinoico (ATRA, "all-trans retinoic acid") reduce la tumorigenicidad de células de rabdomiosarcoma en ratas WAG/RijCrl mediante inoculación subcutánea en flanco (10).

Utilizando el mismo modelo experimental, cuya evolución natural ha sido analizada en detalle en estudios previos (11), hemos estudiado el efecto del tratamiento con ATRA sobre la recidiva local tras la exéresis quirúrgica del tumor inducido en el flanco del animal. Con el fin de reforzar la presencia de los factores de crecimiento liberados localmente en el lecho quirúrgico, hemos asociado una hepatectomía parcial del 40%, hecho que con cierta frecuencia se produce en el tratamiento de metástasis hepática única en combinación con la resección quirúrgica del tumor primario. De este modo, los factores de crecimiento se encuentran también presentes en el suero del animal, pudiendo ser transportados a cualquier punto del organismo donde se encuentren las células tumorales.

MÉTODOS

El trabajo se ha realizado con ratas singénicas (WAG/RijCrl) machos, de 8 semanas de edad. Durante toda la experiencia los animales se mantuvieron en condiciones de libre acceso al agua y comida (Panlab A-04), y con un ciclo constante de luz-oscuridad de 12 horas. En todo momento se ha respetado lo establecido en la "Guía nacional española para el cuidado del animal en experimentación y otros fines científicos" (Real Decreto 223/88).

Modelo experimental

Como modelo tumoral se ha utilizado la línea celular de rabdomiosarcoma S4MH (singénica para la ratas WAG/RijCrl), con alta afinidad para el desarrollo de metástasis. Las células (2,5 x 10⁵ células, resuspendidas en 250 ml de PBS [solución salina tamponada con fosfato] libre Ca⁺⁺) se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho de los animales (1 cm por delante de la cadera).

Veinticinco días después de la inoculación celular tumoral, se extirpó el tumor primario aislándolo mediante disección roma del plano capsular del mismo e incluyendo en la pieza un margen de 0,5 cm de piel no adherida al tumor. En el mismo acto quirúrgico se practicó una hepatectomía del 40% (lóbulo lateral derecho) para simular una resección hepática por metástasis. Para facilitar la recuperación de los animales, al finalizar el acto quirúrgico, se administraron 5 ml de suero glucosado 5% i.p. Desde ese momento, los animales se controlaron durante los diez días siguientes para detectar la posible recidiva tumoral local.

Los animales se sacrificaron el día 35 post-inoculación, realizándose el estudio necrópsico sin que el investigador responsable de dicha tarea conociera el tratamiento recibido por los animales. En primer lugar, se registró el peso tanto del animal, como del hígado. A continuación se valoró la extensión loco-regional del tumor, midiendo en su caso el volumen de la recurrencia tumoral y cuantificando las metástasis macroscópicas en los ganglios inguinales y axilares, así como en el retroperitoneo. Por último, se cuantificaron las metástasis macroscópicas superficiales en el pulmón.

Tratamiento con ácido trans-retinoico

El ATRA (Sigma R-2625) se administró por vía i.p. en dosis de 5 mg/kg disuelto en 0,6 ml de [Clinoleico^® 90% + etanol 10%]. El tratamiento se inició tres días antes de la tumorectomía y se prolongó hasta diez días post-cirugía. Para ello, los 14 animales del estudio se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos, recibiendo uno de ellos el fármaco y el otro únicamente el solvente (0,6 ml de una mezcla de [Clinoleico^® 90% + etanol 10%]).

Para valorar la posible toxicidad del tratamiento con ATRA, se llevó a cabo un control de la evolución ponderal de los animales y del peso hepático final de los mismos.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el test exacto de Fisher para la comparación de la frecuencia de aparición de metástasis ganglionares, y aplicando el test de la t de Student para el resto de los parámetros cuantitativos.

RESULTADOS

Efecto del ATRA sobre la evolución tumoral local

El tratamiento con ATRA fue bien tolerado por los animales, ya que si bien indujo una pérdida del peso global de los animales tratados respecto al grupo control, dicha pérdida fue siempre inferior al 15% respecto a su peso al inicio del tratamiento (Fig. 1A). Por otro lado, la masa hepática, expresada como porcentaje del peso corporal total, no sufrió modificación alguna por dicho tratamiento respecto al grupo control (Fig. 1B).

La incidencia de recidiva local se valoró diez días después de la resección del tumor primario (día 35 de evolución del proceso neoplásico). En el grupo control se registró una elevada tasa de recurrencia local, viéndose afectados más del 70% de los animales. En cambio, en los animales tratados con ATRA la incidencia de recidiva local se redujo a menos de la mitad respecto al grupo control (33 vs. 71%, p < 0,05) (Fig. 2A). Y sin embargo, el volumen medio de las masas tumorales recidivantes no mostró diferencias significativas entre los animales del grupo tratado y los del control (1,8 vs. 2,0 cc, p = 0,89) (Fig. 2B).

Efecto del ATRA sobre la evolución tumoral a distancia

Para el estudio de la diseminación de la enfermedad tumoral que se produce tras la resección del tumor primario, así como la influencia del tratamiento con ATRA en dicho proceso, se procedió, por un lado, al análisis de la invasión neoplásica locorregional a nivel inguinal y retroperitoneal, y por otro lado, al estudio de la invasión a distancia mediante el análisis de la incidencia de infiltración tumoral pulmonar, así como a la cuantificación del número de focos pulmonares.

En cuanto a la evolución de la enfermedad a nivel locorregional, al analizar la incidencia de invasión tumoral de ganglios inguinales regionales (Fig. 3), se pudo observar que en la serie de los animales tratados con ATRA se produjo una incidencia significativamente superior que en el grupo control (86 vs. 29%; p < 0,05). Sin embargo, el volumen medio de las metástasis ganglionares de los animales tratados fue 6 veces menor que las de los animales del grupo control (0,2 vs. 1,2 cc; p < 0,05).

Por otro lado, tal como se puede observar en la figura 4, se produjo una elevada incidencia de extensión tumoral retroperitoneal tanto en el grupo control como el grupo tratado con ATRA, no existiendo diferencias significativas entre los mismos (71 vs. 67%, p > 0,05). Sin embargo, el tratamiento con ATRA redujo en más de 7 veces el volumen tumoral medio de las masas retroperitoneales respecto al del grupo control (0,7 vs. 5,1 cc; p < 0,05).

En relación a la evolución de la enfermedad a distancia, mientras en el grupo control todos los animales presentaban infiltración tumoral pulmonar, en el grupo de animales tratados con ATRA dicha incidencia se redujo en un 33% (p < 0,05) (Fig. 5). Además, la cuantificación del número de focos metastáticos demostró también una disminución de 5 veces en el número medio de focos pulmonares respecto al grupo control (5,7 vs. 26,7; p < 0,05).

DISCUSIÓN

La cirugía es la principal arma terapéutica de los tumores sólidos; de hecho, su control local depende de un tratamiento quirúrgico adecuado que asegure márgenes quirúrgicos amplios libres de tumor tras la exéresis de la lesión primaria, y de las características biológicas del propio tumor. Esto resulta especialmente cierto en los sarcomas de tejidos blandos, en los que la respuesta al tratamiento sigue siendo baja, habiéndose producido pocos avances en los últimos años (12). En este tipo de tumores es habitual la invasión local, lo que complica de forma importante la exéresis quirúrgica y da lugar a una alta tasa de recidivas locales (13). Por otra parte, el 40% de los pacientes con sarcomas de partes blandas presentan metástasis a distancia a pesar del aparente control local inicial de la enfermedad (14), siendo el grado histológico el factor más relevante. De hecho, el 81% de los sarcomas de alto grado, como los rabdomiosarcomas, metastatizan dentro del primer año tras el tratamiento inicial (15). Siendo esto así, parece lógico que el tipo tumoral debería ser tomado en consideración a la hora de establecer el procedimiento quirúrgico y la terapia adyuvante.

Por otro lado, es preciso recordar que el proceso de invasión y metástasis está influido por múltiples interacciones bidireccionales entre las células tumorales y las células estromales, como son los fibroblastos, macrófagos, linfocitos y las células endoteliales (16,17). A su vez, estas interacciones se regulan, en gran medida, a través de factores de crecimiento (18), cuya liberación al medio se ve favorecida por el propio acto quirúrgico.

Todo ello hace preciso plantear nuevas terapias complementarias a la cirugía que intenten reducir el porcentaje del fallo del control local, mediante estrategias que sean implementadas en concomitancia con el planteamiento quirúrgico y que tengan en consideración la propia biología de las células tumorales.

Con la intención de reproducir a nivel experimental el problema clínico anteriormente señalado, caracterizado por el fallo del control local tras la cirugía de tumores sólidos y su influencia en la aparición de metástasis, decidimos utilizar la línea de rabdomiosarcoma de rata S4MH, ya que es altamente tumorigénica y metastatizante. Como modelo de tratamiento quirúrgico realizamos una extirpación quirúrgica local del tumor primario, a la que se añadió una hepatectomía parcial, lo que en conjunto da lugar a la liberación de un importante flujo de factores de crecimiento al torrente circulatorio, permitiendo así obtener el estímulo paracrino promotor de la invasión y metástasis. De hecho, es bien conocido el papel inductor del crecimiento, motilidad e invasión de diferentes tipos de células tumorales que ejerce uno de los principales factores de crecimiento secretados tras la hepatectomía, el factor de crecimiento hepatocitario, HGF (19), a lo que hay que añadir la actividad protumoral de otros factores secretados por las células estromales de la herida quirúrgica, como el FGFß, el factor de crecimiento endotelio-vascular (VEGF), el TGF-b, interleucinas como la IL-6 e IL-8, etc (20,21).

Por otro lado, a la hora de diseñar un tratamiento complementario a la cirugía que tuviera en cuenta la influencia del grado de diferenciación en los sarcomas de partes blandas, hemos recurrido al ácido retinoico, ya que este fármaco actúa inhibiendo el crecimiento de las células tumorales a la vez que potencia su diferenciación y capacidad apoptótica (22,23). En particular, el ATRA ha demostrado su actividad antitumoral en diferentes tumores sólidos humanos, tales como carcinomas de mama (24), tumores de cabeza y cuello (25), ovario (26) y otros, sin que a las dosis utilizadas se describan efectos adversos de consideración.

En relación a la pauta de administración de este agente, consideramos la necesidad de comenzar su administración de forma previa al acto quirúrgico, y mantener dicho tratamiento de forma continuada, con el objetivo de producir la señalización inductora de la diferenciación de forma previa a la presencia de los factores de crecimiento liberados tras la cirugía, y de que dicha señalización permaneciese activa durante un periodo de tiempo prolongado, de tal forma que pudiéramos contrarrestar eficazmente la señal contraria a la de diferenciación celular, es decir, el estímulo proliferativo de dichos factores.

Nuestros resultados han puesto de manifiesto que este modelo presenta una alta frecuencia de recidiva local e invasión locorregional (característica de los tumores de partes blandas en clínica humana), así como la aparición de metástasis en el total de animales que constituyeron el grupo control. Así pues, se confirma la utilidad de nuestro modelo experimental a la hora de evaluar la eficacia de un nuevo tratamiento antitumoral.

El tratamiento continuo pre y postcirugía con ATRA fue bien tolerado por los animales, de forma que, si bien redujo el peso de los mismos, dicha reducción fue inferior al 15% con respecto al peso de las ratas pretratamiento.

En relación a la eficacia de la estrategia terapéutica ensayada, la adición de ATRA al tratamiento quirúrgico redujo en un 38% la aparición de recidiva local y en un 33% la presencia de metástasis pulmonares, localización preferente de asentamiento de las metástasis en la mayoría de los sarcomas (27). Dicha disminución de la capacidad metastática de las células S4MH producida por el ATRA se ve reflejada no sólo en la reducción del número de animales con metástasis, sino también en la disminución a la quinta parte del número medio de focos pulmonares con respecto a los animales del grupo control. Esta reducción significativa de la masa tumoral producida por el ATRA se pudo observar también en las masas retroperitoneales, a pesar de que su frecuencia de aparición no se vio reducida.

Con respecto a la afectación ganglionar, si bien es poco frecuente (3,9-5,9%) en la mayoría de los sarcomas, en el caso del rabdomiosarcoma dicha afectación ganglionar puede alcanzar al 36% de los pacientes (28). En nuestro modelo experimental, el 29% de los animales presentaron invasión ganglionar, porcentaje que paradójicamente se incrementó de forma significativa (86%) en los animales tratados con ATRA. Sin embargo, también en este caso se redujo (6 veces) el volumen tumoral medio en los animales tratados con ATRA respecto al de los animales control.

En conclusión, el presente estudio in vivo demuestra que el tratamiento con ATRA, administrado de forma conjunta con la resección del tumor primario, da lugar a una reducción de la capacidad tumorigénica del rabdomiosarcoma de rata S4MH, lo que sugiere que la estrategia terapéutica fundamentada en el tratamiento pre y postextirpación quirúrgica con retinoides podría favorecer el control local de los tumores sólidos sometidos a cirugía.

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