TRABAJOS ORIGINALES

Polimorfismos del gen de la IL-10 y su relación con los diferentes fenotipos de la colitis ulcerosa

J. L. Mendoza, E. Urcelay¹, R. Lana², A. Martínez¹, C. Taxonera, E. G. de la Concha¹ y M. Díaz-Rubio

Servicios de Aparato Digestivo, ¹Inmunología Clínica y ²Urgencias. Hospital Clínico San Carlos. Universidad Complutense. Madrid

RESUMEN

Introducción y objetivo: el gen de la interleuquina 10 (IL-10) tiene un papel clave en la regulación de la inflamación intestinal en la enfermedad inflamatoria intestinal. Recientemente hemos descubierto que dos polimorfismos del gen de la IL-10, el microsatélite IL-10.G14 y ser homocigoto -1082G (guanina en la posición 1082 del gen promotor de la IL-10) son marcadores de susceptibilidad para padecer colitis ulcerosa (CU). No existen datos que demuestren si estos polimorfismos de la IL-10 se correlacionan con las características fenotípicas de la CU. En este trabajo se estudia la relación entre estos polimorfismos del gen de la IL-10 y las diferentes características fenotípicas de la CU.
Material y métodos: se estudió una cohorte de 215 pacientes españoles no emparentados que son atendidos habitualmente en la consulta de un único centro hospitalario. Todos los pacientes fueron rigurosamente fenotipados y seguidos clínicamente durante al menos 3 años (tiempo medio de seguimiento 11,8 años). El fenotipaje se realizó antes de conocer el genotipo de los pacientes. El genotipaje se realizó según las técnicas habituales de reacción en cadena de la polimerasa.
Resultados: se incluyeron 129 (60%) hombres y 89 (40%) mujeres. La edad media en el momento del diagnóstico fue de 38 años, rango (8-83). La extensión de la CU fue colitis izquierda en 127 (59,1%) pacientes y extensa en 88 (40,9%). Ninguna de la svariables fenotípicas estudiadas se asoció con la presencia o ausencia de los polimorfismos (microsatélite IL10G14 y homocigoto para el alelo -1082G) relacionados con la susceptibilidad a sufrir CU.
Conclusiones: en la población española del área de Madrid, los pacientes con CU que son portadores del microsatélite IL10G14 y/o homocigotos -1082G del gen promotor de la IL-10 no se correlacionan con ninguna característica fenotípica de la enfermedad.

Palabras clave: Colitis ulcerosa. Gen de la interleuquina-10. Fenotipo. Enfermedad inflamatoria intestinal.

Abreviaturas

CU: colitis ulcerosa; EC: enfermedad de Crohn; EII: enfermedad inflamatoria intestinal; IL-10: interleucina-10; IFN-γ: interferon-gamma; PCR: reacción en cadena de la polimerasa; SNP: single nucleotide polymorphism; TNF: factor de necrosis tumoral.

Introducción

La colitis ulcerosa (CU) es una enfermedad inflamatoria intestinal (EII) que afecta a la mucosa del intestino grueso. Los síntomas y la gravedad de este proceso dependerán de la extensión, del grado de actividad inflamatoria y de las manifestaciones extraintestinales asociadas a la enfermedad, aspectos que le confieren una importante heterogeneidad clínica.

La etiopatogenia de la CU es desconocida. La teoría más aceptada indica que la disregulación de la respuesta inmune del huésped frente a la flora bacteriana residente y a otros antígenos intraluminales en sujetos susceptibles genéticamente juegan un papel clave en la patogenia del daño tisular en la CU (1).

El papel de los factores genéticos en la CU se basa fundamentalmente en datos epidemiológicos, que incluyen estudios en gemelos, de agregación familiar y asociación con síndromes genéticos bien caracterizados (2). La CU no sigue un patrón genético Mendeliano simple, es una enfermedad poligénica donde las interacciones entre múltiples factores genéticos y ambientales influyen tanto en la susceptibilidad para padecerla como en las características fenotípicas de la enfermedad (3).

Entre las diferentes áreas del genoma humano, que se han relacionado con la susceptibilidad para padecer CU destaca el área o "locus" conocido como IBD3, localizado en el brazo corto del cromosoma 6 (6q). En esta región se localiza el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) que contiene más de 200 genes, la mayoría de ellos están relacionados con el reconocimiento de los antígenos de histocompatibilidad (HLA tipo I y II) y la regulación de la inflamación (4,5).

Las asociaciones más consistentes entre la CU y el HLA de clase II se producen entre el HLA-DR2 (6) y el HLA-DRB1*0103, que además de ser genes de susceptibilidad se asocian con determinadas características fenotípicas de la CU. Dos subtipos del DR2, el DRB1*1501 y el DRB1*1502, se relacionan con una mayor extensión de la colitis en diferentes poblaciones (7). El haplotipo HLA-DRB1*0103 se asocia con formas más severas de la CU, la necesidad de cirugía y una mayor frecuencia de manifestaciones extraintestinales (8).

La interleuquina-10 (IL-10) es una citoquina reguladora del sistema inmune con funciones diversas (9) que podría ser responsable de la progresión de la CU y por lo tanto influir en el fenotipo de la enfermedad. Recientemente hemos encontrado en la población española una asociación entre diferentes polimorfismos del gen de la IL-10 y la susceptibilidad para padecer EII, tanto CU como enfermedad de Crohn (EC) (10). El hecho de que la IL-10 tenga un papel relevante en la regulación de la inmunidad en la CU, y que determinados polimorfismos del gen de la IL-10 confieran susceptibilidad para padecer CU, nos ha hecho investigar en el presente trabajo si estos genes de susceptibilidad para la CU se asocian con alguna característica fenotípica.

Material y métodos

Población y fenotipaje

Estudio de cohortes prospectivo en el que incluyeron 215 pacientes consecutivos no emparentados entre ellos, diagnosticados de CU, que han sido seguidos de forma habitual durante al menos 3 años en la Unidad de EII de un hospital terciario de Madrid. El diagnóstico de CU se realizó según los criterios clínicos, radiológicos, endoscópicos y anatomopatológicos descritos por Lennard-Jones (11). Las características fenotípicas se obtuvieron de las datos existentes en la historia clínica y mediante entrevista personal con los pacientes. El tratamiento quirúrgico se incluyó cuando la colectomía se realizó en pacientes refractarios al tratamiento convencional, y aquellos con hemorragia masiva, perforación de colon o megacolon tóxico sin respuesta al tratamiento médico. Los pacientes con CU se dividieron en dos grupos según la localización de la enfermedad: colitis extensa cuando la afectación sobrepasa el ángulo esplénico y colitis izquierda cuando la inflamación se limita al colon izquierdo, incluyendo las proctitis, las proctosigmoiditis y las colitis hasta el ángulo esplénico. Se incluyeron en un grupo o en otro en función de la máxima extensión ya fuese macroscópica o microscópica en el momento del diagnóstico o en cualquier otra colonoscopia. Todos los datos fueron recogidos por un gastroenterólogo de la Unidad de EII que era ciego a los datos obtenidos durante el genotipaje de los pacientes.

Genotipaje de los polimorfismos del gen de la IL-10

Los microsatélites IL-10G y IL-10R fueron amplificados usando los primers y condiciones descritas previamente (12). Las condiciones de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fueron las generales para todos los microsatélites y tras comprobar la reacción en geles de agarosa, analizamos los fragmentos de DNA amplificados y marcados con fluorocromos en el secuenciador automático (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Los resultados se obtuvieron mediante el GeneMapper v3.0 (Applied Biosystems).

Como hemos descrito previamente (13), se realizó de forma combinada la amplificación del microsatélite IL10G y los SNP en las posiciones -82 y -819.

Análisis estadístico

Las variables cualitativas se resumieron en valor absoluto y según su distribución de frecuencias. Las variables cuantitativas se resumieron en su media y rango. El estudio de asociación para variables cualitativas se efectuó mediante el test de Chi cuadrado (χ²) y cuando, al menos, más del 25% de los valores esperados eran menor de 5 el test de Fisher. En todos los contrastes de hipótesis se rechazo la hipótesis nula con una p < 0,05. El análisis estadístico se realizó mediante el Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) versión 10.07 para Windows (SPSS Inc., Chicago, Ill. EE.UU.).

Resultados

Eran hombres 129 (60%) con una edad media al diagnóstico de 35 años, rango (10-78). Y 86 (40%) mujeres con una edad media al diagnóstico de 38 años, rango (8-83). La duración media del seguimiento clínico de la enfermedad fue de 11,8 años, rango (3-42 años). La extensión de la CU fue colitis extensa en 88 (40,9%) pacientes y colitis izquierda en 127 (59,1%).

El microsatélite IL10.G14 estaba presente en 38 pacientes (17,7%). No se observaron diferencias estadísticamente significativas en la distribución fenotípica en función de la existencia o no de este microsatélite (Tabla I).

Eran homocigotos (doble guanina -G-) en la posición -1082 del gen promotor de la IL-10, 52 pacientes (24,2%) con CU. Cuando se compararon los pacientes homocigotos frente a los que no lo eran, no se observaron diferencias estadísticamente significativas de las características fenotípicas entre los dos grupos (Tabla II).

Discusión

La IL-10 es una de las principales citoquinas inmunorreguladoras con múltiples funciones en el control de la inflamación intestinal. Entre sus efectos biológicos más importantes destaca la inhibición de citoquinas secretadas por macrófagos activados como son la IL-12, el factor de necrosis tumoral (TNF) y el interferon gamma (IFN-γ). La IL-10 inactiva los linfocitos T al inhibir la expresión de coestimuladores y moléculas de HLA de clase II y frena de esta forma las reacciones de la inmunidad celular. Por otro lado, se ha observado que tiene un efecto estimulador sobre la proliferación de los linfocitos B, que condiciona un incremento en la producción de inmunoglobulinas (14).

La IL-10 tiene importancia en la creación de modelos experimentales como son los ratones knock-out para la IL-10 que desarrollan una enterocolitis similar a la EC además estos ratones responden al tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-TNF, como sucede en los humanos. Varios estudios clínicos han demostrado que la administración sistémica vía intramuscular o subcutánea de IL-10 humana recombinante (rhuIL-10) fue segura y bien tolerada aunque con una modesta eficacia en los pacientes con EC. Las diferencias observadas entre los estudios hace pensar que la respuesta al tratamiento con IL-10 está limitado a un subgrupo de pacientes con EII. Actualmente se está intentando depositar la IL-10 de forma local sobre el área del intestino afectada para conseguir concentraciones más altas sin apenas efectos secundarios mediante la utilización de Lactococcus lactis modificados genéticamente, microesferas gelatinosas con IL-10 y vectores como los adenovirus que codifican IL-10, que en un futuro pueden tener un papel relevante en el tratamiento de la EII (14).

El gen de la IL-10 se encuentra en el brazo largo del cromosoma 1 y se compone de dos microsatélites IL10.G y IL10.R y tres áreas polimórficas localizadas en el gen promotor de la IL-10, en posiciones -1082, -812 y -592. Estos alelos polimórficos han sido estudiados en diferentes poblaciones caucásicas con resultados contradictorios (15-18). Recientemente hemos puesto de manifiesto que en la población española el alelo IL10.G14 del microsatélite y el alelo -1082G localizado en la región del gen promotor de la IL-10 confieren susceptibilidad para sufrir EC. Esta asociación es más fuerte cuando en un solo individuo se combinan los dos alelos. El mismo efecto, pero con una asociación más débil, se puede observar en la CU, con el alelo IL10.G14 y la homocigosis del alelo -1082*G/G (guanina en la posición -1082), cuando se compara con los controles (10). Precisamente los pacientes con EII y homocigotos en la posición -1082*G/G sintetizan de forma significativa más cantidad de IL-10 que los individuos que son heterocigotos -1082*G/A y los que son homocitogos al otro polimorfismo -1082*A/A (adenina es esta posición) (16,19). Coincidiendo con estas observaciones, en la CU existe un exceso de citoquinas producidas por linfocitos Th2 entre las que destaca la IL-10, fundamentalmente en los márgenes de las úlceras donde existe un desequilibrio entre los Th1/Th2 a favor de la linfocitos Th2, este desequilibrio sería responsable de la progresión de la enfermedad (18). Por estos motivos se considera que la IL-10 además de tener un papel importante en la susceptibilidad para padecer CU, podría tener relevancia en el fenotipo, fundamentalmente en relación a la extensión de la enfermedad, aspecto que no se ha confirmado en este trabajo, donde ninguna de las características fenotípicas estudiadas se ha relacionado con los genes de susceptibilidad.

En el presente trabajo ponemos de manifiesto que a pesar de que determinados polimorfismos del gen de la IL-10 son genes de susceptibilidad para padecer CU en la población española, no influyen en las características fenotípicas de la enfermedad, aunque el hecho de tratarse de una enfermedad poligénica obligará en futuros trabajos a determinar cuál es su verdadera influencia al interrelacionarse con otros genes, y su posible papel en la construcción de una clasificación molecular de la CU.

Bibliografía

1. Morahan G, Morel L. Genetics of autoimmune diseases in humans and in animal models. Curr Opin Immunol 2002; 14: 803-11.        [ Links ]

2. Cho J. Update on inflammatory bowel disease genetics. Curr Gastroenterol Rep 2000; 2: 434-9.        [ Links ]

3. Fiocchi C. Inflammatory bowel disease: etiology and pathogenesis. Gastroenterology 1998; 115: 182-205.        [ Links ]

4. Ahmad T, Tamboli CP, Jewell D, Colombel JF. Clinical relevance of advances in genetics and pharmacogenetics of IBD. Gastroenterology 2004; 126: 1533-49.        [ Links ]

5. Fernández L, Mendoza JL, Martínez A, Urcelay E, Fernández-Arquero M, García-Paredes J, et al. IBD1 and IBD3 Determine Location of Crohn's Disease in the Spanish Population. Inflamm Bowel Dis 2004; 10: 715-22.        [ Links ]

6. Fernández Arquero M, López-Nava G, De la Concha EG, Figueredo MA, Santa Cruz S, Dumitru CG, et al. HLA-DR2 gene and Spanish patients with ulcerative colitis. Rev Esp Enferm Dig 1998; 90: 243-9.        [ Links ]

7. Fernández-Arquero M, López-Nava G, García Paredes J, Martínez A, De la Concha EG, Figueredo MA, et al. Pancolitis and genetic markers in the Spanish population. Rev Esp Enferm Dig 1999; 91: 269-76.        [ Links ]

8. Roussomoustakaki MSJ, Welsh K, Louis E, Fanning G, Targan S, Landers C, et al. Genetic markers may predict disease behavior in patients with ulcerative colitis. Gastroenterology 1997; 112: 1845-53.        [ Links ]

9. Mocellin S, Panelli MC, Wang E, Nagorsen D, Marincola FM. The dual role of IL-10. Trends Immunol 2003; 24: 36-43.        [ Links ]

10. Fernández L, Martínez A, Mendoza JL, Urcelay E, Fernández-Arquero M, García-Paredes J, et al. Interleukin-10 polymorphisms in IBD Spanish patients. Inflamm Bowel Dis 2005; 10: 715-22.        [ Links ]

11. Lennard-Jones JE. Classification of inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol Suppl 1989; 170: 2-6; discussion 16-9.        [ Links ]

12. Eskdale J, Wordsworth P, Bowman S, Field M, Gallagher G. Association between polymorphisms at the human IL-10 locus and systemic lupus erythematosus. Tissue Antigens 1997; 49: 635-9.        [ Links ]

13. Eskdale J, Gallagher G, Verweij CL, Keijsers V, Westendorp RG, Huizinga TW. Interleukin 10 secretion in relation to human IL-10 locus haplotypes. Proc Natl Acad Sci U S A 1998; 95: 9465-70.        [ Links ]

14. Li MC, He SH. IL-10 and its related cytokines for treatment of inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol 2004; 10: 620-5.        [ Links ]

15. Parkes M, Satsangi J, Jewell D. Contribution of the IL-2 and IL-10 genes to inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility. Clin Exp Immunol 1998; 113: 28-32.        [ Links ]

16. Tagore A, Gonsalkorale WM, Pravica V, Hajeer AH, McMahon R, Whorwell PJ, et al. Interleukin-10 (IL-10) genotypes in inflammatory bowel disease. Tissue Antigens 1999; 54: 386-90.        [ Links ]

17. Klein W, Tromm A, Griga T, Fricke H, Folwaczny C, Hocke M, et al. The IL-10 gene is not involved in the predisposition to inflammatory bowel disease. Electrophoresis 2000; 21: 3578-82.        [ Links ]

18. Aithal GP, Craggs A, Day CP, Welfare M, Daly AK, Mansfield JC, et al. Role of polymorphisms in the interleukin-10 gene in determining disease susceptibility and phenotype in inflamatory bowel disease. Dig Dis Sci. 2001; 46: 1520-5.        [ Links ]

19. van der Linde K, Boor PP, Sandkuijl LA, Meijssen MA, Savelkoul HF, Wilson JH, et al. A Gly15Arg mutation in the interleukin-10 gene reduces secretion of interleukin-10 in Crohn disease. Scand J Gastroenterol 2003; 38: 611-7.        [ Links ]