INTRODUCCIÓN
La abiotrofia cerebelar es una enfermedad neurodegenerativa autosómica y recesiva. Cursa con signos neurológicos como temblores de cabeza y ataxia, siendo la enfermedad del cerebelo más frecuentemente descrita en caballos, fundamentalmente en el Pura Raza Árabe1. Los potros afectados muestran signos clínicos desde el momento del nacimiento y hasta los seis meses de edad. La enfermedad es incurable, y también se ha descrito en otras especies, como cánidos, óvidos, bóvidos e incluso humanos2,3.
La abiotrofia cerebelar está causada por una mutación puntual localizada en el gen TOE1 del cromosoma 2 (ECA2) del caballo, donde una guanina (G) es sustituida por una adenina (A). Ello induce un cambio de una arginina por una histidina durante la traducción proteica4. Esta modificación del gen TOE1 afecta a la expresión del gen MUTYH, que codifica para una enzima ADN glicosilasa, el cual, en condiciónes normales, actúa reparando las lesiones oxidativas del ADN nuclear y mitocondrial que se producen en el desarrollo de las células de Purkinje del cerebelo. La presencia de la mutación produce un degeneración postnatal de las células de Purkinje, tanto a nivel de su regulación, como de la expresión génica y localización5,6,7. Brault y Penedo1 propusieron una técnica para la tipificación de la mutación combinando una amplificación alelo-específica de la secuencia con un análisis de fragmentos realizado con un secuenciador automático de ADN.
El análisis de las curvas de fusión es un método simple para detectar variaciónes de la secuencia de ADN89 10-11. Conceptualmente, se basa en los cambios que se producen en la disociación del ADN de doble cadena al romperse los puentes de hidrógeno cuando la molécula es sometida a altas temperaturas. La temperatura de fusión de las moléculas de ADN de doble cadena está influenciada por varios factores, como la longitud, el contenido de GC y su composición, lo que permite distinguir entre moléculas con diferentes secuencias12. El procedimiento consiste en someter a las muestras a una amplificación de la secuencia diana mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) 13. Tras ella, se eleva la temperatura hasta alcanzar alrededor de los 95ºC. Durante esta fase, la fusión es controlada mediante fluorocromos intercalantes14, los cuales emiten luz cuando están unidos al ADN de doble cadena, pero que se apagan al separase las hebras. Cuando el termociclador está capacitado para medir a intervalos de temperatura de menos de 0,1ºC de forma homogénea, se puede realizar lo que se denomina un análisis de fusión de alta resolución (HRM, del inglés, High Resolution Melting), la cual permite detectar variaciónes entre secuencias de una sola base15-18.
El Servicio de Cría Caballar de las Fuerzas Armadas cuenta con seis Centros Militares de Cría Caballar, que a su vez disponen de una importante cabaña equina de Pura Raza Árabe. Algunas de las funciónes de estos Centros consiste en la cesión de caballos a los diferentes Cuerpos y Fuerzas de Seguridad del Estado y a la Guardia Real, aunque también se encuentra el fomento de las razas, remitiendo dosis seminales para la inseminación de yeguas pertenecientes a entes públicos o privados. Por razones sanitarias, económicas y comerciales, es de la mayor importancia evitar la transmisión de cualquier tipo de enfermedad, infecciosa o genética, a través de esta promoción de material genético. En este sentido, la difusión de ciertas enfermedades genéticas puede resultar difícil de controlar, dado que en muchos casos es compleja su caracterización diagnóstica por la influencia de factores ambientales que actúan sobre su expresión. Es por ello que es necesario poner a punto técnicas sencillas y económicas que permitan la detección de animales portadores de mutaciónes genéticas.
El objetivo de este trabajo es la puesta a punto de la técnica de HRM para identificar individuos portadores de la mutación causante de la abiotrofia cerebelosa.
MATERIAL Y MÉTODOS
Muestreo
La muestra control empleada corresponde a un individuo diagnosticado clínicamente y tras un examen anatomopatológico como enfermo de abiotrofia cerebelosa. Se selecciónan 93 caballos dentro de los ancestros y colaterales de dicho animal enfermo hasta la tercera generación. La selección se realiza dentro del banco de muestras históricas almacenadas de caballos Pura Raza Árabe pertenecientes al Servicio de Cría Caballar de las Fuerzas Armadas.
Extracción de ADN
La extracción se lleva a cabo siguiendo un protocolo estándar: se diluyen 5 μl de sangre congelada con 500 μl de TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM pH=8), se centrifuga eliminando el sobrenadante, se añaden de nuevo 500 μL de TE y se vuelve a centrifugar y a eliminar el sobrenadante. Se añaden 100 μL de tampón K (TrisHCl 10 mM, pH 8,5; MgCl2 2,5 mM; KCl 50mM; Tween 20 0,5%) y 0,5 μl de proteinasa K (20 mg/ml). Se incuba a 56ºC durante 45 min y posteriormente a 95ºC durante 10 min.
Amplificación y análisis de fragmentos
Se tipifica la muestra control junto con otras 46 muestras de caballos Árabes con la técnica de Brault y Penedo1 usando el secuenciador ABI Prism 377 (Applied Biosystems, USA). El análisis de fragmentos y la tipificación de los genotipos se realizan con los programas Genescan v3.2 y Genotyper v2.1 (Applied Biosystems, USA).
Selección de cebadores
Se diseñan cebadores con el programa Primer 3 Plus19, tomando como referencia una secuencia de ADN de contiene la mutación (ECA2:13074277G>A) 4 registrada en la base de datos EquCab3.020. Los cebadores fueron diseñados para producir amplicones menores de 90 pares de bases (pb) con una temperatura de hibridación de alrededor de 60ºC y un porcentaje en el contenido de CG de entre el 30% y el 80%. Se obtuvieron cuatro configuraciónes de 66, 71, 88 y 89 pares de bases. La especificidad de la secuencia de los cebadores se confirmó por análisis BLAST21. Todos los cebadores se sintetizaron en un proveedor habitual y fueron purificados con HPLC (Tabla 1).
Análisis de curvas de fusión de alta resolución (HRM)
El análisis de curvas de fusión requiere una primera etapa de amplificación de una secuencia determinada mediante una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR). La concentración final de los reactivos es 0,6 μM de cebadores y 2% de EvaGreen® (Biotium, Hayward, CA); 1 unidad de polimerasa (MyTaq™ DNA Polymerase). El resto de reactivos van incluidos en los 4 μl de tampón proporciónado por el fabricante. Se utilizan 4 μl de muestra de ADN y se añade agua hasta completar el volumen total de reacción de 20 μl. Para la amplificación se emplea el termociclador LighCycler 480 II (Roche, USA). Las diferentes etapas de la amplificación consisten en una fase de desnaturalización y activación de la polimerasa de 5 min a 95°C, seguido por 35 ciclos de 15 s a 95°C, 20 s a 60ºC y 20 s a 72°C. La adquisición de la fluorescencia se hace en la etapa de síntesis (72ºC). A continuación, se lleva a cabo un incremento de la temperatura en etapas de 0,1ºC desde 60ºC a 95ºC durante el cual se registra la fluorescencia para detectar la temperatura en que las secuencias amplificadas se disocian en cadenas simples.
El análisis HRM se lleva a cabo mediante el módulo Gene Scanning v1.2 que ofrece el software de análisis del termociclador; inicialmente se ajustan todas las muestras a una fluorescencia relativa y posteriormente se normalizan las curvas respecto a la muestra control. Se identifican los diferentes genotipos de cada secuencia según la forma de las curvas.
En todos los experimentos se tipifican las muestras del caballo afectado de abiotrofia cerebelosa (control, genotipo A/A), un portador de la mutación (G/A) y un sano no portador (G/G), determinados previamente según la técnica de análisis de fragmentos en electroforesis de Brault y Penedo1.
Se valida la técnica mediante tres pruebas: a) sometiendo los fragmentos amplificados a una electroforesis sumergida en gel de agarosa al 3% con un marcador molecular de ADN (CentiMark PCR Marker, Vivantis) con el fin de comprobar que tengan el tamaño deseado y descartar la presencia de dímeros y otros fragmentos que podrían interferir con las curvas de fusión; b) comparando los resultados con los obtenidos con la técnica de análisis de fragmentos4; y c) haciendo un seguimiento genealógico de las muestras de los individuos enfermos y portadores con el programa Pedigraph®22.
RESULTADOS
En todos los casos las muestras se amplifican mediante la qPCR y se generan curvas de fusión identificables por el programa del termociclador.
Con los cebadores de la secuencia ABIO66 se obtienen diferencias de 0,7ºC entre los homocigotos A/A y G/G en las temperaturas de disociación. Sin embargo, la reacción de control de amplificación sin muestra genera un fragmento de tamaño similar, derivado posiblemente a la formación de dímeros entre los cebadores.
La secuencia amplificada ABIO77 presenta un problema similar, donde las estructuras formadas por dímeros en la reacción sin muestra también son similares a los fragmentos amplificados.
La amplificación de la secuencia ABIO88 se descarta porque genera demasiados fragmentos con temperaturas de fusión diferentes, lo que dificulta la interpretación.
Finalmente, con los cebadores usados para amplificar la secuencia ABIO89, se produce una banda de electroforesis muy específica, sin dímeros, no observándose bandas apreciables en la reacción sin muestra (figura 1). Además, en las curvas de fusión se aprecia una separación de 0,5ºC entre los grupos de genotipos A/A y G/G (figura 2A). El análisis HRM permite poner de manifiesto estas pequeñas diferencias entre genotipos de forma objetiva con una curva sinusoidal de los heterocigotos muy característica (figura 2B).
En el análisis de las muestras, se han detectado seis casos de enfermos (genotipo A/A) que no han tenido descendencia y 21 casos de portadores (genotipos A/G).
El análisis genealógico contempla tres generaciónes de ancestros de la muestra positiva que dio lugar al estudio, encontrándose un 22,00% y un 23,50% de sementales y yeguas de genotipo A/G, respectivamente. Se observa el modelo de herencia autosómica recesiva esperado donde todos los portadores heterocigotos son a su vez hijos de portadores. En cuanto a los individuos A/A, se ha comprobado que no han tenido descendencia, pero no se dispone del historial clínico de los mismos.
Las muestras analizadas con la técnica de Brault y Penedo1 se tipifican con la técnica de HRM, existiendo concordancia en todos los resultados.
DISCUSIÓN
En este estudio se desarrolla un ensayo de HRM para evaluar su capacidad para detectar la mutación genética responsable de la abiotrofia cerebelar en caballos, anteriormente descrita por Brault y col. 4. Este tipo de análisis permite la identificación de mutaciónes utilizando un solo instrumento, un termociclador de tiempo real8,10,23,24. Un aspecto importante del ensayo de qPCR seguido de HRM es que se pueden comparar los patrones de los genotipos homocigotos y heterocigotos en el mismo tubo de reacción cerrado, de forma rápida y sin electroforesis o secuenciación posterior, lo que resulta también mucho más económico y fácil de configurar. En este estudio se ha empleado el fluorocromo intercalante EvaGreen®; en comparación con el SYBR® Green I, mas ampliamente utilizado, el intercalante EvaGreen® tiene menos potencial inhibidor de la PCR, además de provocar menos reacciónes inespecíficas al poder usarse a una concentración mucho más alta, lo que da como resultado una señal de mayor calidad25.
En la puesta a punto de una técnica de HRM para una mutación, es conveniente realizar varios diseños de cebadores, y de forma empírica escoger aquel que mejor distinga la mutación. Normalmente se diseña un conjunto de cebadores que produzca un fragmento de 80-120 pb. La Tm debe situarse entre los 58°C ± 2ºC, y el contenido de GC no debería exceder el 65%17. Un tamaño de fragmento de más de 150 pb podría disminuir la sensibilidad del análisis de HRM13, aunque hay autores que establecen el límite en secuencias de hasta 400 pb16. La secuencia ABIO89 tiene una longitud de 89 pares de bases (pb), lo que facilita la detección de los heterocigotos portadores.
Para el estudio genealógico realizado, se considera que la mutación sigue un modelo de herencia autosómica recesiva. La mutación se encuentra en el gen TOE1 que ejerce un efecto regulador del gen MUTYH4. La abiotrofia cerebelosa en las diferentes especies, incluido el hombre, se relacióna con diferentes isoformas del gen MUTYH. Se han encontrado múltiples isoformas de MUTYH en ratones26, ratas27 y humanos28, con localización diferencial de las mismas en el núcleo o en las mitocondrias. Esta variedad de isoformas descritas provoca que la abiotrofia se manifieste con diferentes cuadros clínicos, más o menos graves, y compatibles o no con la vida. En este estudio apenas se han reseñado algunos animales enfermos (homocigotos recesivos con genotipo A/A), los cuales no han llegado en ningún caso a la reproducción. Se podría pensar que es la alteración del gen TOE1 la que produce las diferentes sintomatologías y efectos pero, en consonancia con lo descrito por Scott y col.7, es el efecto que provoca este gen sobre la expresión del gen MUTYH lo que realmente explica los daños tisulares y la gravedad de los síntomas en los caballos.
CONCLUSIÓN
La técnica de HRM para la detección de portadores de la mutación para la abiotrofia cerebelosa en caballos Pura Raza Árabe demuestra ser una herramienta útil, sencilla y económica, de fácil aplicación en los esquemas de selección de caballos. Dentro de nuestro ámbito, podría incorporarse a la batería de pruebas a las que deben someterse los efectivos equinos del Servicio de Cría Caballar de las Fuerzas Armadas. Además, este estudio abre el camino para aplicar la técnica de HRM con otro tipo de enfermedades y caracteres genéticos equinos.