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INTRODUCCIÓN
Las infecciones agudas gastrointestinales son la principal causa de gastroenteritis entre los niños de todo el mundo. Entre los principales agentes causantes de estas gastroenteritis tenemos enterovirus como rotavirus, norovirus y astrovirus y también patógenos bacterianos como Salmonella, Escherichia o Campylobacter, entre otros. A nivel mundial cada año se producen más de 250 millones de episodios de diarrea y cerca de 200 000 muertes asociadas a rotavirus, que es la principal causa de gastroenteritis en niños menores de 5 años (1). La gran mayoría de los casos ocurren en países en desarrollo, pero también en los países desarrollados la gastroenteritis asociada a rotavirus sigue siendo una causa importante de hospitalización en niños (2).
La lactancia materna previene enfermedades infecciosas en los lactantes, ya que gran parte de las inmunoglobulinas excretadas en la leche materna son inmunoglobulinas A (IgA), que protegen principalmente contra infecciones, como el rotavirus. De hecho, la IgA pueden detectarse en las heces de los lactantes, pero no en los alimentados con biberón. La industria ha centrado esfuerzos en el uso potencial de los probióticos como agentes preventivos frente a este tipo de infecciones gastrointestinales.
OBJETIVOS
Validación preclínica y clínica de la eficacia de B. longum subsp. infantis IM-1® frente a diversos patógenos gastrointestinales causantes de gastroenteritis agudas en bebés.
MÉTODOS
AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA Y GENOTÍPICA DE B. LONGUM SUBSP. INFANTIS IM-1®
B. longum subsp. infantis IM-1® se aisló en las heces de un lactante alimentado exclusivamente con leche materna en presencia de jugos gastrointestinales y concentraciones fisiológicas de sales biliares. Se realizó un estudio del perfil de utilización de carbohidratos utilizando el API 50CH (bioMérieux España) y un estudio de actividades metabólicas no deseadas utilizando el API ZYM (bioMérieux España). La identificación de la cepa probiótica se realizó por secuenciación del gen ribosomal 16S (3). La secuencia genómica completa de B. infantis IM-1® se obtuvo utilizando la tecnología de secuenciación a tiempo real molécula única de ADN (SMRT) de PacBio, lo que permitió un análisis de la actividad funcional del genoma del probiótico y su caracterización genotípica definitiva (4).
ESTUDIOS PRECLÍNICOS EN LÍNEAS CELULARES
Se realizaron estudios de la capacidad de B. infantis IM-1® de inhibir la replicación del rotavirus Wa y de la capacidad de proteger las células de la infección por el virus en líneas celulares MA-104 y HT-29, así como de la capacidad para desplazar e impedir la adhesión de diferentes patógenos bacterianos a HT29 en presencia de galactooligosacáridos (GOS) (3,5).
PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LA SUSTANCIA ACTIVA FRENTE AL ROTAVIRUS
La estrategia utilizada para identificar el principio activo frente a rotavirus comenzó con su purificación a partir del sobrenadante de B. infantis IM-1®. Se seleccionaron fracciones de fase inversa para ensayos de inhibición de rotavirus. Todas las fracciones que inhibieron la infección en cultivo celular del rotavirus fueron analizadas por MALDI-TOF para obtener su huella peptídica y determinar los pesos moleculares de los péptidos presentes en cada fracción (6).
ESTUDIO DE LA CAPACIDAD ANTIROTAVIRAL DE B. INFANTIS IM-1® IN VIVO
Se utilizaron dos grupos de nueve ratones BALB/c de 8 semanas de edad. En el grupo control cada ratón se trató con una dosis de 100 µl de tampón bicarbonato de sodio (0,2 M). El grupo experimental recibió una dosis por vía oral de 109 UFC de B. infantis IM-1® resuspendidas en 100 µl del mismo tampón. Después de la primera semana, en el grupo experimental se le administró una dosis de refuerzo de probiótico a cada ratón de forma repetida durante los siguientes 4 días. Posteriormente se inoculó oralmente con 100 DD50 de virus murino McN en 50 µl de solución salina equilibrada de Earle a todos los ratones de ambos grupos y se recolectaron las heces de cada animal diariamente durante los siguientes 9 días para evaluar la presencia de Bifidobacterium y la excreción viral por ELISA (3).
ESTUDIOS CLÍNICOS
Se realizó un ensayo clínico controlado, aleatorizado, multicéntrico y doble ciego en el que los lactantes alimentados con fórmula (≥ 3 meses) recibieron una fórmula infantil suplementada (probiótico) o no (control) con 107 UFC/g de B. infantis IM-1® durante 12 semanas. Se evaluaron los episodios de diarrea, el crecimiento, los síntomas digestivos y la presencia de bifidobacterias en las heces (7).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se aisló una nueva cepa de Bifidobacterium longum subsp. infantis en las heces del lactante, que fue depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) como Bifidobacterium longum subsp. infantis CECT 7210 y designada comercialmente como B. infantis IM-1®. Esta novedosa cepa posee las principales propiedades requeridas en un probiótico, como resistencia a los jugos gastrointestinales, sales biliares, NaCl y bajo pH, así como buena adherencia a las células epiteliales del intestino y sensibilidad a los antibióticos. Su seguridad alimentaria se ha confirmado por la ausencia de producción de metabolitos indeseables y en estudios de ingestión aguda en ratones inmunodeprimidos (3). La obtención de la secuencia completa de su genoma ha permitido identificarla genotípicamente y descartar la presencia de marcadores de resistencia a antibióticos susceptibles de ser transferidos, así como de marcadores genéticos de virulencia o de actividades metabólicas indeseables (4).
Los estudios in vitro en células MA-104 y HT-29 evidencian que B. infantis IM-1® es capaz de inhibir la replicación del rotavirus Wa (hasta un 36,05 % de reducción de focos infecciosos) y también de proteger las células epiteliales de la infección del virus (hasta un 48,50 % de reducción de focos infecciosos).
En un modelo de ratón BALB/c de infección por rotavirus se evidenció que el consumo de B. infantis IM-1® proporcionaba una protección preliminar in vivo contra la infección por rotavirus murino McN, lo que producía un retraso en la infección y una aceleración en la recuperación de la infección al acelerarse la eliminación de partículas víricas en las heces de los animales (3).
Mediante digestiones con proteasa del sobrenadante de B. infantis IM-1® pudo revelarse tanto la naturaleza proteica del principio activo como el hecho de que la molécula responsable de inhibir la replicación del rotavirus se liberaba al sobrenadante. Tras purificar por cromatografía de intercambio catiónico el sobrenadante, se obtuvieron fracciones activas y se consiguió identificar el compuesto funcional producido por B. infantis IM-1® responsable de dificultar la replicación del rotavirus tanto in vitro como in vivo. El compuesto funcional se identificó como un péptido de 11 aminoácidos (MHQPHQPLPPT, denominado péptido 11-mer), con una masa molecular de 1282 KDa. La funcionalidad de 11-mer se verificó usando el péptido sintetizado en infecciones por rotavirus Wa, Ito y VA70 de las líneas celulares HT-29 y MA-104. Finalmente, se detectó actividad proteasa en el sobrenadante de B. infantis IM-1®, responsable de la liberación del péptido 11-mer. En este mismo estudio pudo identificarse de forma preliminar la proteasa implicada (6).
La evaluación de la capacidad de B. infantis IM-1® de utilizar diferentes oligosacáridos o mezclas de oligosacáridos permitió determinar que de los oligosacáridos utilizados los galactooligosacáridos (GOS) y las mezclas que contienen GOS eran los que más aumentaban el crecimiento de B. infantis IM-1®. La combinación simbiótica, GOS junto con B. infantis IM-1®, se utilizó para examinar la actividad antimicrobiana en experimentos de cocultivo frente a Escherichia coli, Salmonella entérica, Cronobacter sakazakii, Shigella sonnei, Listeria monocytogenes y Clostridium difficile. La combinación simbiótica inhibió el crecimiento de C. difficile, pero no logró inhibir a E. coli mientras B. infantis IM-1® por sí solo sin concurso de los GOS consiguió disminuir el crecimiento de C. sakazakii en cocultivo. Los experimentos de adhesión utilizando la línea celular intestinal HT29 mostraron que la cepa B. infantis IM-1® fue capaz de desplazar algunos patógenos de la capa de enterocitos, especialmente C. sakazakii y S. enterica, e impidió la adhesión de C. sakazakii y S. sonnei (5). Estudios posteriores en modelos porcinos de infección han permitido corroborar la eficacia de B. infantis IM-1® en la disminución de la sintomatología de las infecciones causadas por E. coli y S. enterica, así como en la aceleración de la recuperación en los animales infectados que habían consumido este probiótico (8-11).
En el ensayo clínico controlado, aleatorizado, multicéntrico y doble ciego realizado para determinar si una fórmula infantil suplementada con el probiótico B. infantis IM-1® era eficaz para reducir la incidencia de diarrea en lactantes sanos nacidos a término, del total de 97 (control) y 93 (probiótico) bebés fueron aleatorizados, y 78 (control) y 73 (probiótico) completaron el seguimiento de 12 semanas. En el periodo de estudio general, se observó una mediana de 0,29 ± 1,07 y 0,05 ± 0,28 eventos de diarrea/niño en los grupos de control y probiótico, respectivamente (p = 0,059). Esta tendencia a menos episodios de diarrea en el grupo de probióticos alcanzó significación estadística a las 8 semanas (0,12 ± 0,47 frente a 0,0 ± 0,0 eventos/bebé, p = 0,047). La incidencia de estreñimiento fue mayor (OR 2,67, 1,09-6,50) y la frecuencia de las deposiciones fue menor (2,0 ± 1,0 frente a 2,6 ± 1,3 deposiciones al día, p = 0,038) en el grupo de control después de 4 semanas. No se encontraron diferencias en otros puntos de tiempo ni en otros síntomas digestivos, crecimiento o ingesta de fórmula (7).
CONCLUSIONES
En general, estos resultados demuestran que B. infantis IM-1® puede considerarse un probiótico capaz de inhibir la infección por rotavirus en estudios in vitro e in vivo y de inhibir el crecimiento de patógenos gastrointestinales como C. difficile y C. sakazakii. Asimismo, es capaz de desplazar algunos patógenos de la capa de enterocitos, especialmente C. sakazakii y S. enterica, e impidió la adhesión de C. sakazakii y S. sonnei. La suplementación de una fórmula infantil con B. infantis IM-1® puede reducir los episodios de diarrea. Es segura, se tolera bien y se asocia con una menor prevalencia de estreñimiento.
