ARTÍCULO ORIGINAL

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ESTUDIO DE DOS PAUTAS DE INMUNOSUPRESIÓN TRAS
ALOTRASPLANTE LÍMBICO

STUDY OF TWO IMMUNOSUPPRESIVE STRATEGIES AFTER
LIMBAL ALLOGRAFT TRANSPLANTATION

RODRÍGUEZ-AGIRRETXE I¹, MENDICUTE J², ALDAZÁBAL P³, GARCÍA-URQUÍA N⁴, 
DURÁN DE LA COLINA J⁵

RESUMEN Objetivo: Comparación de dos pautas de inmunosupresión tras alotrasplante límbico en un modelo de causticación experimental de la superficie ocular. Métodos: 20 conejos albinos, sometidos a causticación corneal con compromiso limbar con NaOH y alotrasplante límbico al cabo de una semana. Las determinaciones clínicas consistieron en la medición del área de defecto epitelial, opacidad estromal y neovascularización corneal, mediante planimetría computerizada en los días 0, 7, 15, 30, 60 y 90 tras la causticación. El estudio histológico se realizó a los 3 meses, tras sacrificio de los animales. Se evaluaron dos pautas de inmunosupresión: ciclosporina A tópica a dosis constante (grupo 1) y una combinación inicial de dexametasona y ciclosporina A tópicas, seguida por una pauta descendente de ciclosporina A (grupo 2). Resultados: No se encontraron diferencias estadísticas entre ambos grupos a los 3 meses en ninguna de las variables. Se detectaron diferencias en el área de opacidad estromal en los días 7 (43,33 D.E. 4,84 vs 36,67 D.E. 3,88; p<0,01), 15 (41,68 D.E. 3,95 vs 33,6 D.E. 1,99; p<0,01), y 30 (40,1 D.E. 5,45 vs 32,52 D.E. 7,33; p<0,05). En cuanto al área de neovascularización, se detectaron diferencias en los días 7 (1,92 D.E. 0,48 vs 3,73 D.E. 1,18; p<0,01), 15 (7,08 D.E. 1,54 vs 4,42 D.E. 1,68; p<0,01), y 60 (4,9 D.E. 2,58 vs 9,65 D.E. 5,55; p<0,05). Conclusiones: No existen diferencias a largo plazo entre ambas pautas de inmunosupresión en las variables estudiadas. Palabras clave: Limbus corneae, trasplante, inmunosupresión, córnea, ciclosporina A.

SUMMARY Purpose: Comparison of two immunosuppressive strategies after limbal allograft transplantation in an experimental model of ocular surface chemical burn. Methods: Twenty albino rabbits underwent corneal and limbal chemical burn with NaOH. One week later limbal transplantation was performed. Clinical assessments included measurements of epithelial defect, stromal opacity and neovascularization areas, using a computerized planimetry system 0, 7, 15, 30, 60 and 90 days after the chemical burn. Histologic examination was performed at 3 months, after sacrifice of the animals. Two immunosuppressive strategies were evaluated: topical cyclosporin A on constant dosage (group 1), and a combination of topical cyclosporin A and dexamethasone followed by a tapered dosage of topical cyclosporin A (group 2). Results: No statistical differences were observed between both groups regarding all of the variables 3 months after the chemical burn. Differences in the stromal opacity area were detected on day 7 (43.33 D.E. 4.84 vs 36.67 D.E. 3.88; p<0.01), day 15 (41.68 3 D.E..95 vs 33.6 D.E. 1.99; p<0.01), and day 30 (40.1 D.E. 5.45 vs 32.52 D.E. 7.33; p<0.05). As for the neovascularization area, differences were detected on day 7 (1.92 D.E. 0.48 vs 3.73 D.E. 1.18; p<0.01), day 15 (7.08 D.E. 1.54 vs 4.42 D.E. 1.68; p<0.01), and day 60 (4.9 D.E. 2.58 vs 9.65 D.E. 5.55; p<0.05). Conclusions: There are no long-term differences between both immunosuppressive strategies regarding all the studied variables (Arch Soc Esp Oftalmol 2003; 78: 29-34). Key words: Limbus corneae, transplantation, immunosuppressive, cornea, cyclosporine A.

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Recibido: 19/3/02. Aceptado: 6/11/02.
Hospital Donostia. Osakidetza-Servicio Vasco de Salud. San Sebastián. Guipúzcoa. 
¹ Médico Oftalmólogo. Instituto Clínico Quirúrgico de Oftalmología (ICQO). Bilbao. 
² Doctor en Medicina. 
³ Licenciado en Medicina. 
⁴ Licenciada en Biología. Unidad Experimental del Hospital Donostia. San Sebastián. Guipúzcoa. 
⁵ Doctor en Medicina. Instituto Clínico Quirúrgico de Oftalmología (ICQO). Bilbao. 
Comunicación presentada en el LXXVII Congreso de la S.E.O. (Barcelona 2001).
Ninguno de los autores tiene intereses comerciales en el estudio. 
Proyecto subvencionado por el Ministerio de Sanidad y Consumo (FIS 99/0404) y por el Gobierno Vasco (presupuestos de sanidad 1999).

Correspondencia: 
Iñaki Rodríguez-Agirretxe 
C/. R. Cía. Guipuzcoana Caracas, 12, 1.º C
20011 San Sebastián 
España
E-mail: irodrig@euskalnet.net  

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INTRODUCCIÓN

Las causticaciones oculares severas, especialmente las producidas por álcalis, constituyen entidades clínicas de difícil tratamiento para el oftalmólogo en la actualidad. En ellas es típica una importante afectación de la superficie ocular, caracterizada por la aparición de defectos epiteliales persistentes, inflamación estromal y neovascularización corneal (1,2). Este conjunto de signos indica la existencia de un daño severo del limbo esclerocorneal (deficiencia de células madre). Dado que el limbo esclerocorneal es el reservorio de las células primordiales (stem cells), su afectación lleva consigo una regeneración epitelial corneal defectuosa (3). Ésta es la causa de los pobres resultados alcanzados mediante la queratoplastia en situaciones de insuficiencia límbica. Kenyon y Tseng, en 1989, describieron el trasplante límbico, que ha constituido un gran avance en el manejo de las causticaciones corneales severas (4). Mediante este procedimiento se trasplantan células primordiales viables obtenidas del mismo individuo (autotrasplante límbico) o, en situación de daño en ambos ojos, de un donante (alotrasplante límbico) (4-6). La diferencia fundamental entre ambos procesos radica en la posibilidad de rechazo tras el alotrasplante, la cual obliga al empleo de inmunosupresión.

Presentamos un estudio comparativo entre dos pautas de inmunosupresión, tras la práctica de alotrasplantes de limbo en un modelo experimental de causticación de la superficie ocular (7).

SUJETOS, MATERIAL Y MÉTODOS

Animales

Se emplearon 20 conejos albinos de la raza New Zealand, cuyos pesos oscilaron entre 1,9 y 2,6 kg, estabulados y manipulados según la normativa vigente en la Unión Europea para uso de animales de experimentación (86/609).

Causticación

Los animales fueron sometidos a una causticación severa con NaOH (grado III de Thoft) (7). El cáustico fue aplicado sobre el sector corneal comprendido entre 10,00 y 02,00 horas, con afectación del limbo circundante (fig 1). La aplicación del cáustico se realizó por espacio de 1 minuto, mediante un papel de filtro Whatman® (Whatman Paper Ltd., Maidstone, Reino Unido), humedecido con NaOH 1N. Tras la causticación, se realizó un lavado durante 30 segundos con solución salina balanceada (BSS®, IOLAB Pharmaceuticals, Claremont, Estados Unidos). Todo el proceso se realizó bajo anestesia general con una mezcla de ketamina (Ketolar®, Parke Davis, El Prat de Llobregat, España) y clorhidrato de dihidrotiacina (Rompún®, Bayer, Leverkusen, Alemania).

Fig. 1. Modelo de causticación experimental. 

Trasplante límbico

Fue practicado a la semana de la causticación, según la técnica descrita por Kenyon y Tseng (4). Se realizó una queratectomía superficial en el ojo receptor y, posteriormente, se extrajo el injerto limbar en el donante (2 mm de córnea, 3 mm de conjuntiva). El injerto fue suturado ortotópicamente mediante 3 puntos de nylon 10/0 en la zona corneal y 3 puntos de seda virgen 8/0 en la zona conjuntival (fig. 2). Todo el proceso se realizó bajo anestesia general.

Fig. 2. Alotrasplante límbico. 

Fotografía del segmento anterior

Fueron realizadas fotografías en los días 0, 7, 15, 30, 60 y 90 tras la causticación, bajo anestesia tópica (Colircusi anestésico doble®, Alcon-Cusí, El Masnou, España). Las fotografías obtenidas fueron analizadas mediante un sistema de planimetría computerizada previamente descrito por nosotros que consistió en la proyección sobre una pantalla digitalizadora (Drawing board II®, Calcomp Digitizer Products, Anaheim, Estados Unidos) y el establecimiento de mediciones (7). Estas mediciones fueron calculadas mediante un programa diseñado para tal efecto bajo MS-DOS®, Microsoft, Seattle, Estados Unidos). El factor de escala utilizado en las mediciones fue el indicador numérico de cada animal, de 5 mm de longitud.

Sacrificio y necropsia

Los animales fueron sacrificados a los 3 meses de la causticación. Previamente al sacrificio, se extrajo el botón corneal, que fue introducido en solución de formol tamponado al 10% para su fijación. Posteriormente se realizaron los cortes histológicos semifinos en parafina, obtenidos a 2 mm del limbo superior, el cual había sido marcado previamente con un punto de seda 3/0. Para el estudio histológico se utilizó tinción de hematoxilina-eosina.

Variables

Variables clínicas

1. Área de úlcera corneal.
2. Área de opacidad estromal.
3. Área de neovascularización corneal.

Variables histológicas

1. Número de capas del epitelio corneal (0=0-1, 1=2-3, 2=4-5 capas).
2. Presencia de células caliciformes (0=ausencia, 1=presencia).
3. Infiltración estromal de linfocitos (0=ausencia, 1=presencia).
4. Infiltración estromal de polimorfonucleares (0=ausencia, 1=presencia).
5. Infiltración estromal de células plasmáticas (0=ausencia, 1=presencia).

Grupos de estudio: según la pauta de inmunosupresión

Grupo 1 (n=10)
CsA 2% tópica, 1 gota cada 8 horas, durante 90 días (días 7-90).

Grupo 2 (n=10)
1. CsA 2% tópica y dexametasona 0,1% (Maxidex colirio®, Alcon-Cusí, El Masnou, España), 1 gota de cada, cada 8 horas, durante 15 días (días 7-22).
2. CsA 2% tópica: 1 gota cada 12 horas, durante 34 días (días 23-56).
3. CsA 2% tópica: 1 gota cada 24 horas, durante 34 días (días 57-90).

Preparación del colirio de CsA 2%

Se preparó, en campana de flujo laminar, a partir de la forma comercial de solución oral (Sandimmun neoral solución®, Novartis, Barcelona, España), empleando aceite de oliva estéril como vehículo.

Estadística

Los estudios estadísticos fueron realizados mediante el programa Systat Windows® (Microsoft, Seattle, Estados Unidos). Las variables cuantitativas fueron analizadas mediante el test t-Student y, las cualitativas, mediante el test de Fisher.

RESULTADOS

Variables clínicas

1. Área de úlcera corneal
No se encontraron diferencias estadísticas entre ambos grupos en el tamaño de la úlcera corneal en ninguno de los días estudiados (t-Student) (tabla I).

2. Área de opacidad estromal
No existieron diferencias estadísticas entre ambos grupos en los días 0, 60 y 90. Sin embargo el área de opacidad estromal fue significativamente superior en el grupo 1 en los días 7 (p<0,01), 15 (p<0,01) y 30 (p<0,05) (t-Student) (tabla II).

3. Área de neovascularización corneal

Al comparar ambos grupos mediante el test t-Student, no se detectaron diferencias en el área de neovascularización corneal en los días 0, 30 y 90. Sin embargo, el valor de esta variable fue significativamente superior en el grupo 1 en el día 15 (p<0,01), y en el grupo 2 en los días 7 (p<0,01) y 60 (p<0,05) (tabla III).

Variables histológicas

4. Número de capas del epitelio corneal
El número de estratos del epitelio corneal fue normal (4-5 capas) en todos los conejos de ambos grupos, no existiendo diferencias estadísticas (test F Fisher).

5. Presencia de células caliciformes
Sólo se detectaron en un caso en el grupo 1. No existieron diferencias estadísticas entre ambos grupos en cuanto a la presencia de caliciformes (test F Fisher).

6. Infiltración estromal de linfocitos
Se observó infiltración linfocitaria estromal en un caso en el grupo 1 frente a 4 casos en el grupo 2. No existieron diferencias significativas entre ambos grupos en la variable estudiada (test F Fisher).

7. Infiltración estromal de polimorfonucleares
Se detectaron polimorfonucleares en un caso en el grupo 1 y en 4 casos en el grupo 2, no existiendo diferencias estadísticas entre ambos (test F Fisher).

8. Infiltración estromal de células plasmáticas
Aparecieron células plasmáticas en estroma en 2 casos en el grupo 1 frente a los 4 casos encontrados en el grupo 2. No hubo diferencias estadísticas entre ambos grupos (test F Fisher).

DISCUSIÓN

A la hora de estudiar la utilidad del alotrasplante de limbo es necesario partir de una situación previa de deficiencia de células madre limbares. Este cuadro, típico en las causticaciones corneales severas por álcalis, ha sido inducido experimentalmente en este estudio mediante el empleo de NaOH (7). Nuestro modelo experimental, al igual que el de Ormerod, emplea papeles de filtro embebidos en cáustico pero, a diferencia de aquél, aplica dichos papeles no sólo sobre la córnea sino también sobre el limbo circundante (8).

El alotrasplante de limbo es el procedimiento quirúrgico de elección para el reestablecimiento de una superficie ocular normal en los casos de insuficiencia límbica bilateral (5). En este procedimiento, las células primordiales son obtenidas de donante vivo (9,10) o de cadáver (5,11). El momento óptimo para realizar el alotrasplante no debe de ser ni en la fase aguda tras la causticación (en la que la isquemia limbar impediría el normal funcionamiento del injerto), ni en la fase crónica (en la que se habrían desarrollado alteraciones irreversibles en la superficie ocular) (12,13). En nuestro estudio hemos decidido realizar el trasplante a la semana de la causticación pues, en nuestra experiencia y sobre el modelo experimental descrito, es el momento óptimo (14).

La principal desventaja del alotrasplante frente al autotrasplante estriba en la necesidad de inmunosupresión para la profilaxis del rechazo. Además, existen dos factores que hacen del alotrasplante de limbo un procedimiento con elevado riesgo de rechazo: la presencia de células de Langerhans (presentadoras de antígeno) y el elevado componente vascular limbar (5). Sin embargo, llama la atención que, en la práctica, la incidencia de rechazo tras este procedimiento es menor de la que cabría espera (15). A este hecho podría contribuir la falta de una definición clara de los signos de rechazo (tortuosidad, ingurgitación vascular y aspecto hemorrágico del injerto) (5,16). En nuestro estudio, algunos injertos han adquirido una apariencia edematosa y hemorrágica, con importante componente neovascular, que ha disminuido paulatinamente a lo largo del estudio (fig. 3). Estos cambios podrían corresponder a rechazos inmunológicos o bien a los fenómenos normales de reparación tras el alotrasplante. Asimismo, hemos constatado que en el grupo 1 estos signos aparecían hacia el día 15 y habían desaparecido en el día 60 y que, en el grupo 2, aparecían a partir del día 30, para desaparecer en el día 90. Esta diferencia en el tiempo pudiera ser debida al empleo del corticoide en el grupo 2.

Fig. 3. Injerto edematoso, con gran ingurgitación vascular 
y aspecto hemorrágico (posible rechazo). 

 Las pautas de inmunosupresión empleadas en la profilaxis del rechazo tras alotrasplante límbico son muy variadas y se basan en los conocimientos existentes en el trasplante de córnea. Los fármacos más empleados son la CsA sistémica (5,11,17,18), CsA tópica (11,18), prednisolona tópica (16) y dexametasona tópica (5,11). El único estudio que compara distintas pautas de inmunosupresión es el de Xu y cols., que encuentra resultados similares con CsA tópica al 1% y sistémica (10 mg/kg), al mes de realizar el trasplante (18). En nuestro estudio hemos evaluado durante 3 meses dos pautas de inmunosupresión tópica, obteniendo resultados favorables desde un punto de vista general en ambos casos. Atendiendo al área de úlcera corneal, los resultados han sido similares mediante ambas pautas, objetivándose una reducción progresiva en ambos grupos. En lo que respecta al área de opacidad estromal, si bien a largo plazo los resultados fueron similares en ambos grupos, el grupo 2 presentó menor opacidad estromal mientras se administró el corticoide. Atendiendo al área de neovascularización, se observa que los neovasos se detectan a la semana de la causticación en ambos grupos, son más importantes en el grupo 1 en torno al día 15, y en el grupo 2 en torno al día 60. Asimismo, se objetiva la ausencia de diferencias entre ambos grupos en el día 90. Una posible explicación de este hecho consistiría en que el corticoide mantendría un menor componente neovascular, pero su supresión daría como resultado un incremento de los neovasos por efecto rebote. Al comparar ambas pautas en relación a las variables histológicas, se observa que, si bien la infiltración celular fue superior en el grupo que había recibido el corticoide, no existieron diferencias estadísticas entre ambos grupos.

Como conclusión cabría destacar que la administración coadyuvante de corticoide tópico no mejora los resultados a largo plazo alcanzados con CsA tópica. De cualquier forma, el corticoide sí parece ser responsable de una mejor evolución clínica en las primeras fases. Por tanto, su empleo en humanos tendría como principal finalidad el alivio de la sintomatología en las fases precoces.

ABREVIATURAS

CsA: ciclosporina A, Fig: figura, kg: kilogramos, n: tamaño muestral, N: normal, NaOH: hidróxido sódico, mg: miligramos, mm: milímetros y p: probabilidad.

 

BIBLIOGRAFÍA

1. Chen JJ, Tseng SC. Corneal epithelial wound healing in partial limbal deficiency. Invest Ophthalmol Vis Sci 1990; 31: 1301-1314.        [ Links ]

2. Huang AJ, Tseng SC. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci 1991; 32: 96-105.         [ Links ]

3. Schermer A, Galvin S, Sun TT. Differentiation-related expression of a major 64K corneal keratin in vivo and in culture suggests limbal location of corneal epithelial stem cells. J Cell Biol 1986; 103: 49-62.         [ Links ]

4. Kenyon KR, Tseng SC. Limbal autograft transplantation for ocular surface disorders. Ophthalmology 1989; 96: 709-723.         [ Links ]

5. Tsai RJF, Tseng SCG. Human allograft limbal transplantation for corneal surface reconstruction. Cornea 1994; 13: 389-400.         [ Links ]

6. Pfister RR. Corneal stem cell disease: concepts, categorization and treatment by auto- and homotransplantation of limbal stem cells. CLAO J 1994; 20: 64-72.         [ Links ]

7. Mendicute J, Aldazábal P, Saornil MA, Emparanza J, Ostolaza JI, Durán JA. Diseño de un modelo experimental de causticación corneal con compromiso límbico (grado III, Thoft). Arch Soc Esp Oftalmol 1997; 72: 49-58.         [ Links ]

8. Ormerod LD, Abelson MB, Kenyon KR. Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs. Invest Ophthalmol Vis Sci 1989; 30: 2148-2153.         [ Links ]

9. Kenyon KR, Rapoza PA. Limbal allograft transplantation for ocular surface disorders. Ophthalmology 1995; 102 (Supl): 101-102.         [ Links ]

10. Rao SK, Rajagopal R, Sitalakshmi G, Padmanabhan P. Limbal allografting from related live donors for corneal surface reconstruction. Ophthalmology 1999; 106: 822-828.         [ Links ]

11. Tsubota K, Toda I, Saito H, Shinozaki N, Shimazaki J. Reconstruction of the corneal epithelium by limbal allograft transplantation for severe ocular surface disorders. Ophthalmology 1995; 102: 1486-1496.         [ Links ]

12. Tsai RJF, Tseng SCG. Effect of stromal inflammation on the outcome of limbal transplantation for corneal surface reconstruction. Cornea 1995; 14: 439-449.         [ Links ]

13. Rao SK, Rajagopal R, Sitalakshmi G, Padmanabhan P. Limbal autografting: comparision of results in the acute and chronic phases of ocular surface burns. Cornea 1999; 18: 164-171.         [ Links ]

14. Mendicute J. El alotrasplante límbico en la regeneración de la superficie ocular tras causticación experimental en el ojo del conejo. Bilbao: Universidad del País Vasco. 1995. 317 pp. Thesis doctoralis.         [ Links ]

15. Tseng SCG, Prabhasawat P, Barton K, Gray T, Meller D. Amniotic membrane transplantation with or without limbal allografts for corneal surface reconstruction in patients with limbal stem cell deficiency. Arch Ophthalmol 1998; 116: 431-441.         [ Links ]

16. Swift GJ, Aggarwal RK, Davis GJ, Coster DJ, Williams KA. Survival of rabbit limbal stem cell allografts. Transplantation 1996; 62: 568-574.         [ Links ]

17. Tan DTH, Ficker LA, Buckley RJ. Limbal transplantation. Ophthalmology 1996; 103: 29-36.         [ Links ]

18. Xu KP, Wu Y, Zhou J, Zhang X. Survival of rabbit limbal stem cell allografts after administration of cyclosporin A. Cornea 1999; 18: 459-465.         [ Links ]