INTRODUCCIÓN

Las enfermedades crónicas no transmisibles (ECNT), como las enfermedades cardiovasculares, el cáncer y la diabetes, son la principal causa de muerte en todo el mundo. El binomio común que incrementa el desarrollo de algunas de las ECNT son la sobreproducción de radicales libres (RL) y la respuesta inflamatoria crónica (¹). El aumento de los RL que no son neutralizados por los antioxidantes endógenos desencadena actividades biológicas importantes toda vez que dichos RL reaccionan con macromoléculas constituyentes de células y tejidos, como carbohidratos, lípidos, proteínas y ADN (²,³). Lo anterior provoca necrosis, diseminando residuos celulares en la sangre y produciendo más RL y, en consecuencia, la activación de la respuesta inflamatoria (⁴).

La inflamación es una respuesta inmunitaria natural durante las infecciones o las lesiones. Cuando la inflamación se mantiene durante un tiempo prolongado, se produce un aumento de las moléculas de adhesión, los RL y la producción de citoquinas proinflamatorias (IL-1β, IL-6, TNF-α) (⁵). Los monocitos forman parte del sistema inmune inespecífico, cuya función es la eliminación de desechos celulares, el reconocimiento de lo ajeno al organismo, la defensa inespecífica del mismo, la reparación e inflamación de los tejidos y el enlace con el sistema linfoide más específico. En condiciones de normalidad, los monocitos pasarán de la médula ósea a la circulación sanguínea y de esta a los tejidos, donde se diferenciarán en macrófagos intersticiales. Los macrófagos pueden activarse clásicamente liberando citoquinas proinflamatorias y RL o, alternativamente, liberando moléculas antiinflamatorias como la IL-10 y participando funcionalmente en la reparación del tejido, el reconocimiento antigénico y la curación de heridas (⁶). Por lo tanto, la línea celular monocítica THP-1 representa un sistema modelo apropiado para el estudio de la respuesta inmune.

Compuestos tales como los flavonoides, fenoles, flavanonas y dihidroflavanonas provenientes de fuentes vegetales pueden disminuir los efectos del estrés oxidativo y de la inflamación crónica (⁷,⁸). En este sentido, C. aconitifolius (chaya) es una planta endémica de la península de Yucatán, México, cuyas hojas se consumen en platillos tradicionales y se usan también como tratamiento de enfermedades de origen inflamatorio (⁹,¹⁰). Estudios de los extractos de la hoja han demostrado una actividad similar a la indometacina en modelos de edema plantar y auricular (¹⁰,¹¹). Sin embargo, no existen resultados sobre el efecto de dichos extractos sobre los biomarcadores de la inflamación como el TNF-α, la IL-6 y la IL-1β. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad antioxidante y antiinflamatoria in vitro de los compuestos biológicamente activos de extractos de C. aconitifolius.

MATERIAL Y MÉTODOS

Las hojas de C. aconitifolius ((Mill.) I.M. Johnst.) se recolectaron en la Quinta los Achiotes, Timucuy, Yucatán, México. La identificación de la planta se llevó a cabo por el Dr. José Luis Tapia Muñoz en el herbario del Centro de Investigaciones del Estado de Yucatán (CICY) con el número de folio 69489. Se utilizaron los reactivos de Folin-Ciocalteu, carbonato de sodio (NaCO₃), ácido gálico, nitrito de sodio (NaNO₂), hidróxido de sodio (NaOH), cloruro de aluminio hexahidratado (AlCl₃ ·6H₂O), catequina, 2,4-dinitrofenil hidracina, ácido sulfúrico (H₂SO₄), metanol, hidróxido de potasio (KOH), naringenina, ácido 2,2’-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS), acetato de sodio (CH₃COONa), ácido acético (CH₃COOH), peróxido de hidrogeno (H₂O₂), 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH), etanol, enzima convertidora de la angiotensina (ACE), Tris-Base, cloruro de sodio (NaCl), aminobenzoilglicil-p-nitro-L-fenilalanil-L-prolina (Abz-Gly-Phe(NO₂)-Pro), bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), forbol-12 miristato 13-acetato (PMA) y dimetil sulfóxido (DMSO). Se utilizaron células de monocitos THP-1 (ATCC^® Número TIB-202x2122;). El kit de síntesis de ADNc "iScrip cDNA" se obtuvo de BIO-RAD (Hercules, CA, EE. UU.). El Brilliant II SYBR^® Green QPCR Master Mix se obtuvo de Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EE. UU.). El Trisure se obtuvo de Bioline. Los cebadores se obtuvieron de Eurofins Biolab S.L.U (Barcelona, España). Los sets de TNF-α, IL-1β e IL-6 humanos se obtuvieron de Diaclone (Diaclone, Besançon, Francia).

EFECTO BIOLÓGICO IN VITRO DE LOS EXTRACTOS DE C. ACONIFIFOLIUS

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

ABTS

El método ABTS se basa en la capacidad de los antioxidantes de donar electrones y neutralizar los radicales ABTS^•;+ (¹⁵). Previamente se liberó el radical con una mezcla de tampón de acetato 30 mM a pH de 3,6 durante 24 h; para ello se disolvieron 0,246 g de CH₃COONa en 100 ml de agua destilada (reactivo A); luego se tomaron 0,17 mL de CH₃COOH y se disolvieron en 100 mL de agua destilada (reactivo B). Seguidamente se mezclaron 7,5 mL de reactivo A en 92,5 mL de reactivo B y se ajustó el pH a 3,6. Posteriormente se preparó una solución de peróxido de hidrógeno tomando una alícuota de 27,8 µL y disolviéndola en tampón de acetato a pH de 3,6. El radical ABTS^•;+ se liberó al disolver 274.5 mg de ABTS en 50 ml de tampón con peróxido en condiciones de oscuridad y refrigeración durante 24 h. Posteriormente se preparó una solución tampón de acetato de sodio 0,4 M a pH de 5,8 y ácido acético; para ello se disolvieron 3,1 g de CH₃COONa en 100 mL de agua destilada (reactivo C) y 2,28 mL de CH₃COOH en 100 mL de agua destilada (reactivo D), y posteriormente se mezclaron 94 mL de reactivo C con 6 mL de reactivo B, ajustando el pH a 5,8. Por último, se tomaron 200 µL de tampón de CH₃COONa a pH de 5,8 y se agregaron a cada pocillo de una placa de 96 pocillos 20 µL del extracto y 20 µL de ABTS^•;+. Los resultados se expresaron como porcentajes de inhibición de los radicales ABTS^•;+ en tres repeticiones independientes.

Donde:

At = absorbancia del ABTS en el tiempo cero

Am = absorbancia de la muestra con ABTS después de 10 min de reacción.

DPPH

El método del DPPH se basa en la medición de la capacidad de los antioxidantes para reducir el radical DPPH^•;. Se agregaron 25 χL de muestra a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se añadieron 175 χL de una solución de DPPH^•; 63,4 χM (¹⁶). El decremento de la absorbancia del DPPH^•; se detectó a una longitud de onda de 490 nm. Los resultados se expresaron como porcentaje de inhibición de radicales libres de tres repeticiones independientes.

ACTIVIDAD INHIBITORIA DE LA ENZIMA CONVERTIDORA DE LA ANGIOTENSINA

La actividad inhibitoria de la ECA se determinó en los extractos obtenidos de las hojas de C. aconitifolius. El análogo de la angiotensina I (Abz-Gly-Phe(NO₂)-Pro) es hidrolizado por la enzima ECA hasta un residuo fluorescente (o-aminobenzoilglicina (Abz-Gly)) que se detecta por medio de la fluorometría (¹⁷). Previamente, se prepararon las muestras de los 6 extractos a las concentraciones de 150, 300, 450, 600, 750 y 900 χg/ml. La solución de enzima ECA se preparó con una solución de glicerol al 50 % en tampón Tris-base 300 mM y a pH de 8,3. Luego se disolvió en solución tampón Tris-base 150 mM y a pH de 8,3. El sustrato se preparó a una concentración 0,45 mM en solución tampón Tris-base 150 mM y a pH de 8,3 con 1,125 M de cloruro de sodio. Se mezclaron 40 χL de muestra con 40 χL de enzima y, posteriormente, se añadieron 160 χL de sustrato. Como blanco se utilizó agua. Los resultados se expresaron como porcentaje de inhibición de la ECA en tres muestras independientes.

Donde:

B_a = blanco con la enzima

B_b = blanco sin la enzima

M_a = muestra con la enzima

M_b = muestra sin la enzima.

ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA DE LOS EXTRACTOS DE C. ACONITIFOLIUS EN MONOCITOS THP-1

Cultivo celular y tratamientos

La línea celular monocítica humana THP-1 se cultivó en suspensión utilizando como medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con un 1 % de penicilina/estreptomicina (P/S, v/v) y un 10 % de suero fetal bovino (SFB, v/v) inactivado por calor. Los monocitos se diferenciaron y polarizaron clásicamente en macrófagos M1 por incubación con PMA (100 nmol/L) durante 4 días. Las células THP-1 estimuladas con PMA (denominadas macrófagos derivados de THP-1) se expusieron al medio RPMI (suplementado con un 1 % de SFB, v/v) durante 24 h y después se trataron con los extractos acuosos y etanólicos elegidos a una concentración de 25, 50 y 100 χg/mL en medio RPMI (1 % de SFB, v/v) durante 24 h.

Ensayo de viabilidad celular

La viabilidad celular se determinó en macrófagos derivados de monocitos THP-1 tratados con los extractos etanólicos y acuosos de C. aconitifolius mediante el ensayo de MTT. Para ello se diferenciaron 5 x 10⁴ monocitos THP-1 en macrófagos con PMA (100 nM) durante 4 días. Luego, los macrófagos se incubaron a 37 º C con los extractos etanólicos y acuosos a una concentración final de 10, 25, 50, 100, 250 y 500 χg/mL durante 24 h. Seguidamente se añadieron 100 χL de MTT (5 mg/mL) en cada pocillo y se incubaron las células a 37 ºC durante 3 h. Las células viables redujeron el MTT a cristales de formazán por efecto de la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa. Para detectar y cuantificar el formazán a una longitud de onda de 540 nm se eliminó el medio de los pocillos y se disolvió en DMSO (100 χL).

Extracción de mRNA y análisis mediante qPCR-RT

Los niveles de mRNA de los genes específicos se determinaron usando un sistema de PCR en tiempo real. El mRNA total se extrajo de los macrófagos derivados de THP-1 usando el reactivo Trisure (Bioline, a Meridiam Life Science Company) según las instrucciones del fabricante. La calidad del mRNA se midió con la relación A₂₆₀/A₂₈₀ determinada en un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, Madrid, España).

Se sometió 1 χg de mRNA a transcripción inversa para obtener el cDNA de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de síntesis de cDNA (BIO-RAD). Por cada reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (QPCR) se mezclaron 10 ng de cDNA de molde con Master Mix Brilliant SYBR Green QPCR, los oligonucleótidos de los genes que codifican el TNF-α, la IL-6 y la IL-1β, y el gen de la hipoxantina-fosforribosil-transferasa (HPRT) usado como gen constitutivo (Tabla I). Las reacciones de amplificación se realizaron por triplicado. La cuantificación de los cambios de expresión del mRNA de los genes en estudio se calculó usando el método estándar. Los resultados de la expresión génica se normalizaron con el gen de referencia (HPRT).

Tabla I. Secuencias de cebadores de RT-PCR para el análisis de la expresión génica 

Cuantificación de biomarcadores de la inflamación

Las concentraciones de citoquinas (TNF-α, IL-6 e IL-1β) en los sobrenadantes del cultivo celular se cuantificaron con el kit comercial (Diaclone^→) del ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración de citoquinas se expresó en pg/mL y se calculó a partir de las curvas de calibración de la dilución en serie de estándares recombinantes humanos en cada ensayo.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los resultados del contenido total de fenoles se analizaron con un ANOVA de una sola vía y una prueba de Tukey a posteriori, con un nivel de significación de p < 0,05. Los resultados de la actividad antioxidante y antiinflamatoria se obtuvieron mediante un análisis de la varianza multifactorial. Para diferenciar las medias de los tratamientos entre la media del control se utilizó un análisis de Dunnett a posteriori, mientras que para la diferencia entre tratamientos se utilizó una prueba de Tukey a posteriori con un nivel de significación de p < 0,05. El análisis estadístico se llevó a cabo con el software Statgraphics Centurión XV.

RESULTADOS

COMPOSICIÓN BIOACTIVA DE LOS EXTRACTOS DE C. ACONITIFOLIUS CON POTENCIAL ANTIOXIDANTE Y ANTIINFLAMATORIO

El contenido de fenoles de los extractos obtenidos por maceración con diferentes solventes se registró en un rango de 10,44 ± 4,54 a 70,61 ± 0,07 g/100 g de extracto en base seca para los extractos con éter dietílico y agua, respectivamente. Los resultados presentaron diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) entre el extracto acuoso, el etanólico y el grupo homogéneo (acetónico, acetato de etilo, éter dietílico y hexano). El contenido de flavonoides fue de 4,45 ± 0,47 a 47,76 ± 4,84 g/100 g de extracto obtenido con agua y etanol, respectivamente. Los resultados mostraron diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) entre el extracto acuoso, el etanólico y el acetónico. En los extractos obtenidos con acetato de etilo, éter dietílico y hexano no se detectaron flavonoides. El contenido de flavanonas y dihidroflavonoles en los extractos se registró entre 52,79 ± 4.21 y 70,10 ± 7,29 g/100 g de extracto obtenido con hexano y etanol, respectivamente (Tabla II). Los resultados presentaron diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) entre el etanol, el grupo homogéneo conformado por acetona, acetato de etilo y éter dietílico y el grupo homogéneo conformado por agua y hexano.

Tabla II. Contenido de fenoles, flavonoides, flavanonas y dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C. aconitifolius (g/100 g de extracto liofilizado) 

Medias de tres datos independientes. Las letras diferentes en una misma columna indican diferencias estadísticas significativas (p < 0,05) obtenidas con un post-hock de Tukey. ND: no detectado.

Evaluación de la actividad antioxidante de los extractos de C. aconitifolius

Los extractos de C. aconitifolius registraron actividad antioxidante a las concentraciones de 150 a 900 χg/mL, según lo determinado por el ensayo DPPH. La máxima actividad antioxidante se obtuvo con el extracto de acetona, con un 49,85 ± 5,3 % de inhibición. En el análisis de la varianza multifactorial se encontraron evidencias de una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) en la interacción de los extractos con las concentraciones evaluadas (Fig. 1A).

Figura 1. Interacción de los extractos [(agua (H2O), etanol (ETOH), acetona (An), acetato de etilo (AcOET), éter dietílico (Et2O) y hexano (Hex)] con las concentraciones (150 a 900 χg/ml) mediante intervalos Tukey, p < 0,05. a) Efecto de los extractos en la inhibición de los radicales DPPH; b) Efecto de los extractos en la inhibición de los radicales ABTS. 

La capacidad antioxidante de los extractos de C. aconitifolius, determinada por el ensayo ABTS, mostró una relación dosis-dependencia con respecto a las concentraciones evaluadas; la máxima actividad antioxidante se obtuvo con el extracto etanólico, con un 41,02 ± 3,18 % de inhibición. En el análisis de la varianza multifactorial se encontró evidencia de una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) en la interacción de los extractos con las concentraciones evaluadas (Fig. 1B).

Los extractos de C. aconitifolius tuvieron efecto sobre la actividad de la ECA en un rango de concentración de 150 a 900 χg/mL (Fig. 2). Los resultados mostraron inhibiciones del 16,22 ± 0,29 % y 72,79 ± 4,36 % para los extractos acetónicos y acuosos, respectivamente. Así, los valores de concentración mínima inhibitoria del 50 % (IC₅₀) de dichos extractos se encontraron en un rango situado entre 375,18 y 850,67 χg/mL, correspondientes al extracto acuoso y hexánico, respectivamente. Los resultados mostraron una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) en la interacción de los extractos con las concentraciones probadas, siendo el extracto acuoso el que registró la mayor actividad biológica.

Figura 2. Efectos de los extractos [(agua (H₂O), etanol (ETOH), acetona (An), acetato de etilo (AcOET), éter dietílico (Et2O) y hexano (Hex)] en la actividad de la ECA. La interacción con las concentraciones (150 a 900 χg/ml) se determinó mediante intervalos Tukey, p < 0,05. 

Evaluación de la actividad antiinflamatoria de los extractos de C. aconitifolius sobre los macrófagos THP-1

La viabilidad celular de los macrófagos diferenciados de monocitos THP-1 tratados con los extractos acuosos y etanólicos mostró una diferencia estadística significativa (p < 0,05) entre los extractos y las concentraciones evaluadas (Fig. 3). El extracto acuoso mostró una viabilidad celular menor del 80 % a excepción de la obtenida a las concentraciones más bajas de 10 y 25 χg/mL, registrándose una diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos con una p < 0,05. Por otro lado, los porcentajes de viabilidad celular obtenidos en el extracto etanólico fueron superiores a los registrados con el extracto acuoso, llegando a ser superiores en la mayoría de los casos al 90 % excepto a 500 χg/mL, donde la viabilidad parece que desciende ligeramente a valores inferiores al 75 %. A este respecto, los valores más bajos de viabilidad celular del extracto acuoso podrían atribuirse a la presencia de compuestos citotóxicos tales como el copaeno y el ácido cianhídrico (HCN), este último de mayor solubilidad en agua (⁷).

Figura 3. Efecto del extracto acuoso (H₂O) y etanólico (ETOH) de C. aconitifolius en la viabilidad de los macrófagos derivados de monocitos THP-1. El "*" indica diferencias estadísticas significativas (p < 0,05) entre los tratamientos y el control, determinado con el estadístico de Dunnett. Las letras minúsculas indican diferencias estadísticas entre las concentraciones de un mismo extracto y las letras mayúsculas indican diferencias estadísticas entre los extractos (p < 0,05) con la prueba de múltiples rangos de Tukey. 

Las células tratadas con los extractos etanólicos y acuosos presentaron diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) en la expresión de los genes que codifican las interleucinas. Asimismo, se observaron diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) entre los extractos a las concentraciones evaluadas (25, 50 y 100 χg/mL) (Fig. 4). Las células tratadas con el extracto acuoso fueron las que registraron la mayor expresión del mRNA que codifica el TNF-α con respecto a las células estimuladas con LPS. El extracto etanólico presentó una disminución significativa de la expresión de mRNA, con relación dosis-respuesta, alcanzándose una disminución de más de un 40 % con respecto a la expresión de las células estimuladas (Fig. 4A). Las células tratadas con los extractos acuosos parecen inducir la represión génica de IL-1β, aunque no lo hicieron de forma significativa. El extracto etanólico obtuvo una disminución significativa de la expresión génica, existiendo una relación concentración-respuesta, que llegó al 73,71 % con la concentración de 100 χg/ml (Fig. 4B). La expresión del mRNA que codifica la IL-6 se redujo significativamente tanto para el extracto acuoso como para el etanólico, encontrándose también una diferencia estadísticamente significativa entre las distintas concentraciones del estudio (Fig. 4C). Las células tratadas con el extracto acuoso redujeron hasta un 83,92 % la expresión génica de la IL-6 con respecto a las células tratadas con LPS. Por otro lado, las células tratadas con 100 µg/mL de extracto etanólico redujeron en más de un 97 % la expresión de IL-6 con respecto a las células tratadas con LPS.

Figura 4. Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanólico (ETOH) de C. aconitifolius en la expresión de mRNA. A. TNF-α; B. IL-1β; C. IL-6.El "*" indica diferencias estadísticas significativas (p < 0,05) entre los tratamientos y el control, determinado con el estadístico de Dunnett. Las letras minúsculas indican diferencias estadísticas entre las concentraciones de un mismo extracto y las letras mayúsculas indican diferencias estadísticas entre los extractos (p < 0,05) con la prueba de múltiples rangos de Tukey. 

Las células tratadas con extractos acuosos y etanólicos de C. aconitifolius registraron diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) en la concentración de citoquinas proinflamatorias liberadas en comparación con las células tratadas con LPS. Además se encontró una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) entre los tratamientos a las diferentes concentraciones evaluadas. Ambos extractos redujeron significativamente el TNF-α (Fig. 5A). El extracto acuoso mostró una disminución del 48 % a una concentración de 100 g/mL, mientas que el extracto etanólico registró una disminución del 46 % a la misma concentración. Respecto a la IL-1β, las células tratadas con extractos acuosos de C. aconitolius registraron una concentración de dicha interleucina mayor que la de las células tratadas con LPS (Fig. 5B). Sin embargo, las células tratadas con el extracto etanólico no mostraron diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) con respecto a las tratadas con LPS a todas las concentraciones del estudio. En lo referente a la IL-6, el extracto etanólico registró porcentajes de disminución de hasta un 48,38 % con respecto al LPS, mientras que el extracto acuoso no mostró diferencias estadísticas significativas (p < 0,05) con respecto a las células tratadas con LPS (Fig. 5C).

Figura 5. Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanólico (ETOH) de C. aconitifolius en la producción de citoquinas. A. TNF-α; B. IL-1β; C. IL-6.El "*" indica diferencias estadísticas significativas (p < 0,05) entre los tratamientos y el control, determinado con el estadístico de Dunnett. Las letras minúsculas diferentes indican diferencias estadísticas entre las concentraciones de un mismo extracto y las letras mayúsculas diferentes indican diferencias estadísticas entre los extractos (p < 0,05) con la prueba de múltiples rangos de Tukey. 

DISCUSIÓN

El contenido de fenoles, flavonoides, flavanonas y dihidroflavonoles en los vegetales contribuye a las propiedades medicinales de estos, debido a su capacidad antioxidante y reductora del estrés oxidativo implicado en diversas patologías de origen inflamatorio (¹⁸). Dichos compuestos polifenólicos están constituidos por uno o más anillos aromáticos con uno o más grupos OH; de estos grupos OH se pueden neutralizar los radicales libres por transferencia de electrones o por hidrógenos (¹⁹). Por otro lado, los terpenoides como el caroteno, la amirina y la moretenona pueden tener grupos OH y dobles enlaces capaces de neutralizar los radicales libres (²⁰).

La inhibición del radical DPPH registrada en este estudio fue mayor que la reportada con extractos de tallos de C. aconitifolius (15,39 %) a una concentración de 1000 χg/mL (²¹). En otro estudio realizado sobre extractos metanólicos de las hojas, a una concentración de 5000 χg/mL, se reportó una actividad antioxidante del 45,5 % y 94 % de inhibición del radical DPPH y ABTS, respectivamente (¹⁶). La evaluación de la actividad antioxidante del extracto acuoso de hojas frescas de C. aconitifolius registró un 50 % de inhibición del DPPH (²²). Por otra parte, en el estudio de la actividad antioxidante de los extractos de C. aconitifolius obtenidos con etanol, acetato de etilo y hexano en las partes aéreas, estos inhibieron el 55 % de los radicales DPPH a una concentración de 1000 χg/mL (²³). Lo anterior pone de manifiesto que las diferencias de actividad pueden atribuirse a factores tales como el origen de la materia prima, la estación del año en que se recolecta, el contenido de metabolitos secundarios, etc.

La ECA es una metalopeptidasa que contiene zinc en su sitio activo y convierte el decapéptido antiotensina I en un octapéptido denominado angiotensina II en el sistema renina-angiotensina-aldosterona (²⁴). Dicho octapéptido aumenta la presión arterial y promueve la retención de sodio y agua en el cuerpo (⁴,²⁵,²⁶). Los extractos de C. aconitifolius inhibieron la actividad de dicha enzima de una manera similar a la reportada con extractos obtenidos de la planta Ipomoea reniformis (IC₅₀ de 422 χg/mL); esto puede atribuirse a la capacidad quelante de los grupos hidroxilos de los fenoles presentes en los extractos (²⁵,²⁷). Por otra parte, diversos estudios ponen de manifiesto que los compuestos terpenoides presentes en los extractos no polares de hojas de chaya pueden inhibir la actividad de la ECA (²⁸). A este respecto, los compuestos fenólicos y terpenoides obtenidos de fuentes vegetales inhiben de forma competitiva la actividad de la ECA (²⁷).

Estudios realizados por Velásquez y cols. (²⁹) determinaron el efecto citotóxico de los extractos acuosos y etanólicos de hojas de C. aconitifolius en larvas de Artemia salina, y observaron que no hubo efecto citotóxico al no superarse la dosis letal media (DL₅₀) a una concentración de 1000 χg/mL. Así, el efecto citotóxico del extracto acuoso de C. aconitifolius del presente estudio podría deberse a remanentes de ácido cianogénico durante el proceso de secado de las hojas, ya que las mismas pueden contener, incluso después de dicho procesamiento, hasta 4,25 mg de HCN/100 g de hoja seca. En este sentido, la FDA establece que es a partir de la ingestión de cantidades iguales o mayores de 20 mg/100 g de hoja seca cuando se pueden registrar efectos tóxicos en los seres humanos (³⁰).

La disminución de la expresión de los genes que codifican el TNF-α, la IL-1β y la IL-6 es un factor clave en la reducción de la síntesis y liberación de citoquinas. Diversos autores han reportado que moléculas tales como eupafolina, hispidulina, β-amirenona, acetato de β-amirina, moretenona, acetato de lupeol, cariofileno y campesterol tienen actividad antiinflamatoria al disminuir la expresión de los genes que codifican el TNF-α, la IL-1β y la IL-6 (³¹-³³). De la misma manera se ha reportado un efecto sobre la síntesis y liberación de dichas citoquinas. Los polifenoles y esteroles inhiben la actividad del heterodímero NF-kB (³⁴). El NF-kB está constituido por las proteínas p53 y p65, y se ubica en el citosol formando un complejo con la proteína IkB en su forma inactiva; en su forma activa, los homodímeros se traslocan al núcleo y se unen al los promotores de los genes proinflamatorios (³⁵). Los polifenoles y los esteroles evitan la fosforilación del IkB, así como la traslocación del NF-kB al núcleo, evitando la transcripción del mRNA que codifica el TNF-α, la IL-1β, IL-6 y la IL-10 (¹⁸,³²). Estos resultados concuerdan con lo reportado previamente, dejando de manifiesto que las células reducen la síntesis de TNF-α e IL-6 a medida que disminuye la expresión génica. Sin embargo, diversos autores ponen de manifiesto que, durante la generación de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio, la IL-1β responde a la liberación de TNF-α (³⁶). Lo anterior podría explicar la razón por la que la represión génica de la IL-1β no ha podido visualizarse en el extracto acuoso. Sin embargo, el extracto etanólico muestra una disminución de la expresión génica de IL-1β a partir de 50 χg/mL. En extractos de C. aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina, hispidulina, β-amirenona, acetato de β-amirina, moretenona, acetato de lupeol, cariofileno y campesterol, compuestos a los que podría atribuirse la actividad antiinflamatoria registrada en el presente estudio (¹⁰,³⁷).

CONCLUSIONES

Los extractos de C. aconitifolius presentaron actividad antioxidante al disminuir los radicales DPPH y ABTS. Los extractos etanólicos y acuosos registraron efectos antiinflamatorios al disminuir la expresión génica de las citoquinas, siendo el extracto etanólico el que presentó la mayor represión de los genes que codifican el TNF-α (40 %), la IL-6 (97 %) y la IL-1β (73,71 %). Por lo tanto, la disminución de la transcripción de los genes que codifican estas citoquinas redujo la producción y liberación de citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos bioactivos de los extractos. Así, los resultados sugieren que los extractos de C. aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio.