ORIGINALES 

Evaluación del medio de Stonebrink para la recuperación de micobacterias 

A. Sepúlveda, P. García-Martos, M.J. Rodríguez, A. Márquez, J.L. Puerto, A. Saldarreaga. 

Servicio de Microbiología. Hospital Universitario Puerta del Mar. Cádiz.

Palabras clave: Löwenstein-Jensen, Löwenstein-Jensen piruvato, Mycobacterium, tuberculosis. 

Key Words: Löwenstein-Jensen, Löwenstein-Jensen piruvate, Mycobacterium, tuberculosis. 

Resumen 

Analizamos el índice de recuperación y el tiempo de detección de micobacterias a partir de muestras clínicas empleando dos medios de cultivo sólidos con base de huevo, durante un período de cuatro años (1997-2000). Un total de 7.806 muestras fueron inoculadas en medio de Löwenstein-Jensen y medio de Stonebrink (Löwenstein-Jensen con piruvato sódico), de las cuales 294 mostraron cultivo positivo para micobacterias. Un 70,4% de las micobacterias fueron aisladas en ambos medios; un 16,7% solamente en el medio de Löwenstein-Jensen, todas Mycobacterium tuberculosis; y otro 12,9% sólo en el medio de Stonebrink (23 M. tuberculosis, 8 M. bovis, 5 M. avium, 1 M. fortuitum, y 1 M. gordonae). El tiempo requerido por M. tuberculosis para crecer en el medio de Löwenstein-Jensen fue significativamente mayor que en el medio de Stonebrink. Este último medio fue más eficaz para la recuperación de M. tuberculosis a partir de muestras con escasa concentración bacilar. El empleo de la combinación de ambos medios incrementa sustancialmente el diagnóstico microbiológico de las infecciones por micobacterias. 

Summary 

The rate of recovery and time to detection of mycobacteria from clinical specimens were analysed using two solid egg-based culture media during a four years period (1997-2000). A total of 7,806 samples were inoculated on Löwenstein-Jensen and Stonebrink (Löwenstein-Jensen with sodium pyruvate) media, of which 294 showed positive culture for mycobacteria. A 70.4% of mycobacteria were isolated from both media; a 16.7% only from Löwenstein-Jensen medium, all them Mycobacterium tuberculosis; and another 12.9% only from Stonebrink medium (23 M. tuberculosis, 8 M. bovis, 5 M. avium, 1 M. fortuitum, and 1 M. gordonae). The time required for M. tuberculosis to grow on Löwenstein-Jensen medium was significantly greater than the time required to grow on Stonebrink medium. This last medium was more efficient for M. tuberculosis recovering from samples with low concentration of bacilli. The use of a combination of both media substantially increased the microbiological diagnosis of mycobacterium infections. 

Recibido: 24-III-01
Aceptado: 9-VIII-01

Correspondencia: Antonio Sepúlveda Toscano. 
Servicio de Microbiología. Hospital Puerta del Mar 
Avda. Ana de Viya, 21 
11009 Cádiz

Introducción 

Actualmente, para el diagnóstico de tuberculosis se emplean en la rutina del laboratorio dos métodos de detección de micobacterias en muestras clínicas: la tinción y el cultivo, pues las técnicas de biología molecular no están al alcance de cualquier laboratorio¹. 

La observación de preparaciones teñidas por el método de Ziehl-Neelsen y/o fluorescencia con auramina es un método rápido y de bajo coste pero adolece de falta de sensibilidad, siendo casi siempre obligado el cultivo^2,3. Éste se realiza en medios selectivos tanto líquidos (Proskauer-Beck, Sauton, Sula, Dubos, Middlebroock 7H9) como sólidos, con huevo (Löwenstein-Jensen, Petragnani, Coletsos), los más utilizados, y con agar (Dubos, Middlebroock 7H10, Middlebroock 7H11)^4,5. En los últimos años se ha impuesto el medio líquido de Middlebroock para el diagnóstico rápido automatizado, existiendo en el mercado diversos sistemas comerciales de buen rendimiento: BACTEC, MGIT, MB/Bact, ESP^6-9. Los sistemas radiométricos basados en el empleo de isótopos están en desuso en la actualidad¹⁰, así como el sistema bifásico MB-Septi-Chek¹¹ y la técnica de lisis centrifugación¹². 

Aunque el empleo de los sistemas automatizados con medios líquidos se ha generalizado en la práctica del laboratorio de mi crobiología por su rapidez y mayor índice de recuperacón de micobacterias, debido a ciertos inconvenientes que presentan, principalmente la contaminación de los medios, no se aconseja prescindir aún de los medios sólidos si se quiere lograr un mejor diagnóstico de las micobacteriosis. El medio de Löwenstein-Jensen sigue siendo el de referencia para la valoración de los nuevos sistemas comerciales y se utiliza rutinariamente para el aislamiento de micobacterias de importancia clínica. No obstante, su rendimiento no siempre es óptimo, y así es frecuente la pérdida de Mycobacterium bovis, que crece mal o tardíamente en este medio, e incluso de cepas disgónicas de Mycobacterium tuberculosis. Para solucionar estos inconvenientes fueron diseñados medios complementarios que incrementan el rendimiento del medio de Löwenstein-Jensen al inocularlos en paralelo. Uno de éstos es el medio de Löwenstein-Jensen suplementado con piruvato sódico o medio de Stonebrink, empleado en algunos laboratorios^13-15. 

En el presente trabajo se evalúa la utilidad del medio de Stonebrink en relación con el de Löwenstein-Jensen, con el fin de aconsejar uno u otro medio para su empleo en paralelo con los medios líquidos de los sistemas automatizados. 

Material y Métodos 

Durante un período de cuatro años (1997-2000) se analizó un total de 7.806 muestras procedentes de pacientes atendidos en el Hospital Universitario Puerta del Mar de Cádiz, con sospecha de tuberculosis o micobacteriosis. Las muestras se procesaron para cultivo previa descontaminación por el método de Tacquet y Tison, inoculando en paralelo, del mismo modo y a igual concentración (2-3 ml del sedimento), un tubo con medio de Löwenstein-Jensen (LJ) (Difco) y otro de Löwenstein-Jensen suplementado con piruvato sódico o medio de Stonebrink (ST) (Difco) por muestra. Los cultivos se incubaron en estufa a 35ºC, en posición horizontal y atmósfera ambiente, durante 8 semanas antes de descartarlos como negativos, realizando lectura para detección de crecimiento dos veces por semana. 

De todos los cultivos positivos fueron registrados los datos referentes al tiempo de crecimiento en días y el número de colonias, en cada medio de cultivo. Simultáneamente se identificó en estas muestras la procedencia anatómica y la especie de micobacteria aislada. 

Resultados 

De las 7.806 muestras estudiadas, 294 (3,8 %) tuvieron cultivo positivo para micobacterias. Las localizaciones anatómicas de estas muestras fueron: 222 secreciones respiratorias, 31 orinas, 9 pus de abscesos, 9 líquidos pleurales, 8 aspirados gástricos, 7 líquidos cafalorraquídeos, 4 líquidos pericárdicos, 1 biopsia pleural, 1 médula osea y 1 líquido ascítico. 

Las especies de micobacterias aisladas en estas muestras fueron: 267 (90,8%) M. tuberculosis, 9 (3,1%) M. bovis, 8 (2,7%) M. avium, 6 (2,0%) M. fortuitum, 3 (1,0%) M.gordonae y 1 (0,3%) M. kansasii. 

De los 294 cultivos positivos, 207 (70,4%) lo fueron en los dos medios ensayados (LJ + ST), 49 (16,7 %) sólo en medio LJ y 38 (12,9%) en medio ST. El índice de sensibilidad asociado a cada uno de los medios fue del 87,1% para LJ y 83,3% para ST. Un 29,0 % de las muestras con cultivo positivo en LJ + ST presentaron negatividad en la tinción de Ziehl-Neelsen/auramina; la tinción fue negativa también para un 55,3% de las muestras con crecimiento sólo en LJ y para un 79,6% de las crecidas en ST. 

En a la tabla I se expresan las características de crecimiento de aquellas muestras que sólo crecieron en uno de los dos medios ensayados (LJ o ST). 

En el medio LJ sólo creció M. tuberculosis, mientras que en el medio ST crecieron además 8 cepas de M. bovis, 5 de M. avium, 1 de M. fortuitum y 1 de M. gordonae. Un 81,6% de las cepas de M. tuberculosis creció entre 25 y 40 días en el medio LJ, frente a un 28,9% en el medio ST, ya que de las 23 cepas que crecieron en este intervalo de tiempo en ST, 8 eran M. bovis y 4 M. avium. 

El 91,9% de las cepas de M. tuberculosis crecidas en LJ presentaron un número de colonias inferior a 10, frente a un 100% de las crecidas en ST. 

Discusión 

El rendimiento del cultivo para el diagnóstico de infección por micobacterias suele ser excelente cuando existe una fundada sospecha clínica basada en la sintomatología del paciente y exploraciones complementarias, principalmente reacción de Mantoux, radiología de tórax y datos analíticos. Sin embargo, en nuestra casuística observamos que en nuestra área sanitaria se solicita la investigación de micobacterias con cierta falta de criterio, ya que el índice de positividad del cultivo (3,8%) es bastante bajo. Las secreciones respiratorias y la orina son las muestras en las que se recupera un mayor número de micobacterias, resultados previsibles por ser éstas las muestras que se procesan con más frecuencia. 

Mycobacterium tuberculosis es la especie mayormente implicada en las infecciones por micobacterias, hecho relacionado con la mayor incidencia de tuberculosis pulmonar frente a otras formas clínicas. Los aislamientos de M. bovis correspondían a pacientes inmunodeprimidos con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)¹⁶, a excepción de 2 casos registrados en pacientes con neoplasias. M. avium se aisló exclusivamente en pacientes VIH con infección diseminada¹⁷. 

A pesar de los avances metodológicos para la detección e identificación de micobacterias directamente en las muestras clínicas, las técnicas clásicas de tinción y cultivo siguen siendo de gran utilidad para el diagnóstico y hasta la fecha no está justificado su abandono. Diversas técnicas de biología molecular basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), transcriptasa inversa (TAM), Q-beta-replicasa y reacción en cadena de la ligasa (LCR) se han ensayado pero su utilidad real está aún por dilucidar^18-21. 

El uso de medios líquidos para el diagnóstico de la tuberculosis, en comparación con los medios sólidos, ha supuesto una indudable mejora en la rapidez de detección de micobacterias, así como una mayor recuperación de las mismas acortando notablemente el tiempo en establecer un diagnóstico microbiológico. Los sistemas comerciales automatizados, a su vez, facilitan el procesamiento de las muestras y la lectura de resultados, permitiendo incluso la realización de antibiograma^6-9,22,23. El mayor inconveniente de estos sistemas radica en el alto índice de contaminación que soportan estos medios, lo cual obliga a utilizar en paralelo medios sólidos que minimicen en alguna medida este problema²⁴. 

La adición de piruvato sódico al medio de LJ en cantidad suficiente para obtener una concentración final del 0,5% ha demostrado ser efectiva para la recuperación de cepas disgónicas o multirresistentes de M. tuberculosis, M. avium, M. malmoense y, sobre todo, de M. bovis^13,25-29. En presencia de piruvato las cepas de M. bovis adquieren la capacidad de utilizar el glicerol y la glucosa para presentar un crecimiento eugónico. Sin embargo el piruvato sódico puede perjudicar la recuperación de M. kansasii³⁰. Mycobactyerium avium puede aislarse en LJ, pero el crecimiento puede potenciarse añadiendo al medio piruvato o glicerol y ajustando el pH a 6; el glicerol, aunque estimula el crecimiento de casi todas las especies de micobacterias, puede perjudicar el crecimiento de M.bovis e incluso inhibirlo²⁹. 

Según nuestros resultados, el uso del medio ST con piruvato permitió recuperar hasta un 8,6 % de las cepas de M. tuberculosis, la mayoría de las cepas de M. bovis y más de la mitad de las de M. avium. Estos datos sugieren la utilidad de este medio para su empleo junto al LJ, ya que su exclusión hubiera impedido el diagnóstico de un significativo número de pacientes con tuberculosis o infección diseminada y la detección de tuberculosis por M. bovis en pacientes VIH, en los cuales el pronóstico es muy malo por ser este microorganismo multirresistente a los tuberculostáticos de uso habitual³¹. 

El tiempo medio de crecimiento en ambos medios es similar para el conjunto de las especies, con una notable diferencia en días a favor del medio suplementado con piruvato, circunstancia asociada con la mayor riqueza de este medio. En el caso de M. tuberculosis, el tiempo de crecimiento en el medio con piruvato es significativamente inferior. El medio de Stonebrink se muestra también más idóneo para recuperar M. tuberculosis cuando las muestras son paucibacilares. 

De acuerdo con nuestros resultados parecería aconsejable el empleo del medio de Stonebrink en sustitución del de Löwenstein-Jensen cuando solamente existiera la posibilidad de utilizar un medio sólido. Sin embargo, dado que la presencia de piruvato inhibe o dificulta el crecimiento de algunas cepas de micobacterias no tuberculosas, la utilización exclusiva del medio de Stonebrink no se aconseja. Siempre deberá emplearse en paralelo con el medio de Löwenstein-Jensen. 

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