ORIGINALES

Aplicación de la citometría de flujo funcional a la monitorización del tratamiento antiplaquetario: Movilización de Ca²⁺ y expresión de P-Selectina en plaquetas de sujetos tratados con Ticlopidina

Maria-do-Céu Monteiro¹, Maria-José Gonçalves², Filipe Sansonetty^3,4 , Marcial Martínez⁵ y José-Enrique O'Connor⁶

¹IPSN-Instituto Politécnico de Saúde-Norte, Gandra-Paredes, Portugal; ² ICSN-Instituto de Ciências de Saúde-Norte, Gandra-Paredes, Portugal; ³ IPATIMUP-Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, Porto, Portugal; ⁴ Instituto de Investigação em Ciências da Vida e Saúde, Escola de Ciências da Saúde, Universidade do Minho, Braga, Portugal; ⁵ Unidad de Citometría de Flujo, Servicio de Biopatología Clínica, Hospital Universitario La Fe, Valencia; ⁶ Centro de Citometría y Citómica, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de Valencia, Valencia, Spain.

Palabras clave: activación plaquetaria, citometría de flujo, Fluo-3, movilización de Ca²⁺, P-selectina, terapia antiplaquetaria
Key Words: platelet activation, flow cytometry, Ca²⁺ mobilization, P-selectin, anti-platelet therapy

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Resumen Los pacientes con tendencia protrombótica pueden ser sometidos a terapia antiplaquetaria. La inhibición de las funciones plaquetarias puede influir diversamente en la progresión de la enfermedad en los pacientes individuales, por lo que los procedimientos para determinar objetivamente el estado funcional de las plaquetas son de interés clínico. Hemos aplicado un método citométrico en sangre entera, recientemente desarrollado en nuestro laboratorio (Monteiro et al. Cytometry 35, 302-310, 1999), para monitorizar las alteraciones en la respuesta de activación de las plaquetas en donantes voluntarios sanos tratados con ticlopidina (250 mg dos veces al día por vía oral durante cuatro días). La activación plaquetaria inducida por ADP y trombina se ha estudiado en sangre entera por citometría de flujo mediante el ensayo cinético de la movilización de Ca2+ libre intracelular y la determinación de la expresión de P-selectina (CD62P). Los cambios en la movilización de Ca2+ libre y la expresión de CD62P inducidas por ADP y trombina reflejan el efecto inhibidor de la ticlopidina. La intensidad de las respuestas de Ca2+ (% inhibición <30%) y la expresión de CD62P (% inhibición >50%) tras la activación de plaquetas con ADP y con baja concentración de trombina fueron reducidas de forma estadísticamente significativa tras el tratamiento con ticlopidina. Dado que se detectó una marcada variabilidad interindividual tras la administración de ticlopidina, nuestros resultados muestran la utilidad de estos sensibles ensayos en sangre entera para monitorizar la inhibición de la función plaquetaria y para optimizar en consecuencia la dosificación terapéutica de forma individualizada en cada paciente sometido a terapia antiplaquetaria.

Abstract Patients with pre-thrombotic tendency are submitted to anti-platelet therapy. The resulting inhibition of platelet functions may influence the disease progression in individual patients. Thus, analytical procedures to measure objectively the functional status of the platelet population are of clinical utility. We have applied a novel whole-blood flow cytometric method (Monteiro et al. Cytometry 35, 302-310, 1999) to monitor the alterations in early platelet reactivity induced by oral administration of ticlopidine in five healthy volunteers (250 mg twice a day during four days). Platelet activation induced by ADP and thrombin was assessed in whole blood by flow cytometric kinetic determination of intracellular Ca2+ mobilization and compared to the late activation marker P-selectin (CD62P). Changes in both free Ca2+ and CD62P expression induced by ADP and thrombin reflected the inhibitory effect of ticlopidine. The intensity of Ca2+ responses (% inhibition <30%) and CD62P expression (% inhibition >50%) upon platelet activation by ADP and low-concentration thrombin were significantly reduced after ticlopidine treatment. Conclusions: Since marked interindividual variability was detected after ticlopidine administration, our results show the utility of these sensitive whole blood assays to monitor the inhibition of platelet function and to optimize accordingly the therapeutic dosage in the individual thrombotic patient.

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Recibido: 2-XII-02
Aceptado: 2-I-03
Correspondencia: José-Enrique O'Connor.
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina, 
Avenida Blasco Ibáñez, 17. 46010 Valencia, España.
Correo electrónico: jose.e.oconnor@ uv.es

Introducción

La plaqueta desempeña un papel esencial en un gran número de alteraciones de la hemostasia ^{1, 2}, por lo que la introducción de la terapéutica antiplaquetaria como forma de prevención de fenómenos trombóticos lleva aparejada la necesidad de establecer métodos que permitan evaluar la eficacia de la terapia ³. En este contexto, es de especial relevancia la determinación de los cambios en las respuestas plaquetarias inducidos por agonistas específicos. Los ensayos a utilizar con tal objetivo deberían reflejar el mecanismo de acción del agente terapéutico en estudio sobre la(s) diana(s) seleccionada(s) y, al mismo tiempo, su especificidad y sensibilidad deberían estar relacionadas con los agonistas elegidos.

La citometría de flujo, una técnica multiparamétrica muy útil para la evaluación funcional en células individuales ha proporcionado en los últimos años múltiples métodos, basados en la bioquímica celular y que han permitido revelar cambios más precoces en el estado de activación plaquetaria que los revelados por métodos clásicos, como el de agregación ^3-7. Recientemente, hemos descrito un método que permite cuantificar la movilización de Ca²⁺ libre intracelular en plaquetas, en sangre entera, en condiciones de manipulación mínima de las muestras ⁸. Este ensayo y otras determinaciones complementarias por citometría de flujo pueden resultar útiles para monitorizar los efectos generales de tratamientos y para detectar eventuales subpoblaciones de plaquetas que respondan de forma heterogénea a la terapéutica. Por otra parte, la capacidad multiparamétrica de la citometría de flujo constituye una aproximación adecuada a la investigación de la utilidad de los ensayos funcionales para optimizar la dosificación antitrombótica de cara a un tratamiento seguro y eficaz.

La ticlopidina es una tienopiridina inhibidora de la función plaquetaria in vivo, frecuentemente usada para prevenir complicaciones vasculares en pacientes con riesgo trombótico ⁹. Aunque su mecanismo de acción no está completamente elucidado, se sabe que un metabolito no identificado de la ticlopidina es un inhibidor no competitivo del receptor de ADP ¹⁰. Utilizando la ticlopidina como fármaco modelo, hemos llevado a cabo un estudio experimental dirigido a evaluar la utilidad del ensayo funcional por citometría de flujo en la monitorización de las alteraciones individuales de la reactividad plaquetaria inducidas por el tratamiento con ticlopidina. Con este propósito, hemos determinado la movilización de Ca²⁺ intracelular, como indicador temprano ⁸, y la expresión en superficie del antígeno CD62P (P-selectina), como marcador tardío ³, de la activación inducida por ADP y por trombina en plaquetas de sangre entera en un grupo de cinco donantes voluntarios sanos.

Material y métodos

Materiales:

El fluorocromo Fluo-3 aceto-metil éster (Fluo-3 AM) se obtuvo de Molecular Probes Europe BV (Amsterdam, Holanda). Los reactivos a-trombina, adenosina 5'-difosfato sal sódica (ADP), suero de conejo, fragmento F(ab)'₂ de inmunoglobulina de oveja anti-ratón-conjugada con fluoresceína (F(ab)'₂-FITC) y el tetrapéptido sintético L-glicil-L-prolil-L-arginil-L-prolina (GPRP), se obtuvieron de Sigma (St. Louis, Missouri). El anticuerpo monoclonal específico contra el marcador constitutivo de la superficie plaquetaria CD41 (complejo glicoproteico GPIIb/IIIa) conjugado con ficoeritrina (CD41-PE) y los anticuerpos monoclonales purificado (CD62P) y conjugado con fluoresceina (CD62P-FITC) usados para cuantificar la expresión de P-selectina (CD62P), una glicoproteína de la membrana de los gránulos α, se obtuvieron de Immunotech (Marsella, Francia). La inmunoglobulina de ratón de isotipo IgG utilizada para establecer el control de la unión inespecífica en la determinación de CD62P se obtuvo de Beckman-Coulter (California, USA). El resto de productos de laboratorio se obtuvieron de Sigma.

Administración de Ticlopidina:

La ticlopidina (Tyklid^®, Sanofi) se administró por via oral a cinco donantes sanos voluntarios (39.6 ± 6.9 años de edad) a los que se había informado y que habían expresado su consentimiento. La dosis administrada fue de 250 mg dos veces al día, durante cuatro días. El estudio fue aprobado por el Comité Etico del Instituto Politécnico de Saúde-Norte.

Toma de muestras:

Las muestras de sangre se obtuvieron antes y después del tratamiento con ticlopidina, siguiendo las recomendaciones de la Platelet Task Force del European Working Group on Clinical Cell Analysis ³. De acuerdo con estas indicaciones, para evitar la activación artefactual, se utilizó una aguja del 19 y se extrajo sangre de una vena antecubital sin usar garrote. Se despreciaron los primeros 2,5 mL y se recogieron 4,5 mL directamente sobre un tubo estéril de plástico que contenía 0,5 mL de citrato trisódico 129 mM.

Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP):

El plasma rico en plaquetas (PRP) se obtuvo por centrifugación de la sangre citratada a 190 g durante 15 minutos. Posteriormente, se diluyó hasta un recuento aproximado de 5x10⁶ plaquetas/mL en tampón de Tyrode modificado (ClNa 137mM, ClK 2.8 mM, Cl₂Mg 1mM, CO₃HNa 12mM, PO₄H Na₂ 0.4 mM, seroalbúmina bovina (BSA) 0.35%, 10 mM HEPES (N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulphonic acid]), glucosa 5.5 mM, pH 7.4). El recuento de plaquetas se realizó con un contador hematológico Sysmex K 1000.

Análisis cinético por citometría de flujo de Ca²⁺ libre intracelular en plaquetas activadas con ADP o trombina:

El análisis cinético de la movilización de Ca²⁺ libre intracelular se realizó siguiendo el método por citometría de flujo descrito por Monteiro et al. ⁸. La sangre entera citratada se diluyó 1:10 v/v en tampón de Tyrode modificado libre de Ca²⁺ y se incubó en oscuridad con el fluorocromo sensor de Ca²⁺ libre Fluo-3 AM (5 µM, durante 15 minutos a 37ºC). A continuación, se depositaron en tubos de polipropileno de 12x75 mm alícuotas de 25 µL y se marcaron con 5 µL de anticuerpo CD41-PE (durante 15 minutos a temperatura ambiente y oscuridad), para permitir la posterior identificación y selección de la población plaquetaria en el citómetro de flujo. En los tubos que contenían muestras a estimular posteriormente con trombina se adicionó el tetrapéptido sintético GPRP (concentración final: 2.5 mM), para inhibir la polimerización de fibrina ¹¹. Tras la incubación, las muestras se diluyeron con 1mL de tampón de Tyrode modificado y se usaron alícuotas de 500 µL para analizar en el citómetro de flujo las variaciones cinéticas de la fluorescencia verde del Fluo-3 en la población de plaquetas.

Para la realización del ensayo cinético, se introduce el tubo correspondiente en el citómetro previamente calibrado y se recoge la fluorescencia basal del Fluo-3 durante unos 20 segundos. En dicho momento, se detiene la aspiración de la muestra, se retira el tubo y se añade el agonista (ADP o trombina) en un volumen de 25 µL para alcanzar la concentración final requerida (ADP: 12.5 y 50 mM; trombina: 0.05 y 0.5 U/mL). Se reintroduce el tubo en el citómetro y se continua la adquisición de datos hasta 3 minutos, registrando las variaciones de fluorescencia.

Determinación por citometría de flujo de la expresión de CD62P en plaquetas de sangre entera:

Para determinar la expresión de CD62P en plaquetas activadas, las muestras de sangre entera citratada, diluída 1:10 en tampón de Tyrode modificado se estimularon con los agonistas ADP (12.5 y 50 mM) o trombina (0.05 y 0.5 U/mL), tras inhibir la polimerización de fibrina con GPRP. Tras incubar durante 5 minutos con el agonista correspondiente, se tomaron muestras de 25 µL para su tinción durante 15 minutos, a temperatura ambiente y en oscuridad, con concentraciones saturantes de los anticuerpos monoclonales CD41-PE (5 mL) and CD62P-FITC (5 mL). A continuación, las muestras se resuspendieron en 1 mL de tampón de Tyrode modificado y se analizaron en el citómetro de flujo. La expresión de CD62P se determinó en la población de plaquetas, identificadas por su positividad para CD41.

Determinación por citometría de flujo de la expresión de CD62P en PRP:

Las muestras de PRP diluído fueron estimuladas con diferentes concentraciones de ADP (0-10 mM). Tras diferentes períodos de incubación, a temperatura ambiente y sin agitación, las muestras se fijaron con 1 volumen de paraformaldehído al 1% en PBS durante 15 minutos. Las muestras fijadas fueron lavadas con citrato trisódico al 3,8% en PBS que contenía un 10% de suero de conejo. Alícuotas de 200 mL de las plaquetas lavadas, a concentración de 50,000 plaquetas/mL, fueron teñidas con 50 µL de anticuerpo CD62P purificado, utilizando una IgG de ratón como control isotípico de marcaje inespecífico. Para el revelado con fluorescencia se utilizó 100 µL de fragmento F(ab)'₂-FITC de oveja anti-ratón, que se dejó incubar durante 30 minutos en oscuridad. Las muestras fueron lavadas entonces con citrato trisódico al 3,8% en PBS y resuspendidas en dicho tampón para el análisis por citometría de flujo.

Análisis por citometría de flujo:

Todas las determinaciones se llevaron a cabo con un citómetro de flujo EPICS XL-MCL (Beckman-Coulter) dotado de un láser de ión argón de 15 mW de potencia y emisión a 488 nm. El instrumento se ajustó para medir las siguientes señales, con amplificación logarítmica: dispersión frontal de luz láser (Log FS), como medida del tamaño de partícula; dispersión lateral de luz láser (Log SS), como medida de la granularidad de la partícula; emisión de fluorescencia verde a 525 nm (Log FL1) para cuantificar, en unas experiencias, la intensidad de emisión de Fluo-3, proporcional al contenido intracelular de Ca²⁺ y, en otros casos, la unión de CD62P-FITC, proporcional a la expresión de P-selectina; emisión de fluorescencia naranja a 575 nm (Log FL2) para detectar la unión de CD41-PE y, por tanto, identificar específicamente la población de plaquetas.

Para realizar las medidas de fluorescencia indicadas, el sistema óptico del citómetro consistió en un filtro de bloqueo de 488 nm, un filtro dicróico de paso largo de 550 nm más un filtro de paso de banda de 525 nm (para detectar Fluo-3 y CD62P-FITC) y un filtro dicróico de paso largo de 600 nm más un filtro de paso de banda de 575 nm (para detectar CD41-PE). La Figura 1 ilustra un ejemplo representativo del análisis por citometría de flujo de la activación de plaquetas en las condiciones técnicas descritas aquí.

 

 

Análisis Estadístico:

Para poder comparar la intensidad de las respuestas de movilización de Ca²⁺ entre los diferentes donantes y para los diferentes agonistas se normalizó las medidas de intensidad de fluorescencia mediante el cálculo del cociente de fluorescencia, definido por el resultado de dividir la media de la intensidad de fluorescencia en cada punto experimental tras la estimulación con agonista por la media de la intensidad de fluorescencia basal en las plaquetas en reposo.

Los resultados obtenidos antes y después de la administración de ticlopidina se compararon estadísticamente mediante el test de la t de Student. La significación estadística se consideró positiva para una p <0.05.

Resultados

La población de plaquetas se pudo seleccionar en el análisis citométrico de la muestra de sangre entera, utilizando un anticuerpo monoclonal conjugado con PE, que reconoce el antígeno constitutivo específico de plaquetas CD41 (un epítopo del complejo GPIIb/IIIa). Según se ha descrito previamente ^{3, 8}, CD41 identifica especificamente la población de plaquetas, que corresponde en la Fig. 1A a la población de mayor fluorescencia de PE y menor complejidad (Log SS). La fluorescencia de CD41-PE se utilizó como criterio para acotar la población de plaquetas en los análisis posteriores, de forma que en esta población seleccionada la movilización de Ca²⁺ intracelular inducida por ADP y trombina se puede cuantificar en tiempo real por el ensayo cinético que eejemplifica la Fig. 1B.

La administración de ticlopidina a los donantes sanos disminuyó la intensidad de las respuestas de movilización de Ca²⁺ libre invocadas por la estimulación de las muestras de sangre entera con ADP (Fig. 2) o trombina (Fig. 3). Dado que estas determinaciones se llevaron a cabo en un medio libre de Ca²⁺, los resultados indican que la ticlopidina interfiere con los mecanismos de movilización de Ca²⁺ movilización desde los depósitos intracelulares. El efecto inhibidor sobre la respuesta de Ca²⁺ response se pudo observar en todos los sujetos estudiados, aunque el porcentaje de inhibición fue menor del 30%. Al comparar estadísticamente las respuestas máximas, las diferencias fueron significativas para todas las concentraciones de ADP y trombina estudiadas (Tabla 1).

 

 

La expresión de CD62P, un fenómeno relativamente tardío en la secuencia de activación plaquetaria ³, fue cuantificado por citometría de flujo (Fig. 1C) en la población de plaquetas, identificadas por su expresión de CD41 y su menor tamaño (Fig. 1A). La expresión en superficie de CD62P inducida por la activación de plaquetas por el ADP (12.5 y 50mM) se vió fuertemente inhibida (% inhibición >50%) tras la administración de ticlopidina (Fig. 4). También se pudo observar una inhibición significativa en expresión de CD62P inducida por la trombina a la concentración de 0.05 U/mL, pero no a la de 0.5 U/mL (Table 2). En consistencia con las observaciones realizadas sobre la movilización de Ca²⁺, la expresión de CD62P presentó un grado notable de variabilidad interindividual tras la administración de ticlopidina.

 

 

En otra serie de experimentos, se determinó el efecto de la ticlopidina sobre la cinética de expresión de CD62P en PRP tras la estimulación con ADP. En dichos experimentos la expresión de CD62P se determinó mediante inmunofluorescencia indirecta. Como muestra la Fig. 5, la administración de ticlopidina resultó en una inhibición marcada de la expresión de CD62P para todas las concentraciones de ADP estudiadas y para todos los puntos experimentales. El porcentaje de inhibición, estimado por el recuento de plaquetas positivas para CD62P, fue superior al 40%. Así mismo, la intensidad media de expresión de CD62P por plaqueta en la población de plaquetas positivas para CD62P, estimada por la intensidad media de fluorescencia, se redujo en más del 60%. De esta forma, los resultados obtenidos en estas condiciones experimentales con PRP son consistentes con los que se habían obtenido usando sangre entera e inmunofluorescencia directa. Los resultados de las respuestas máximas a los 10 minutos de estimulación con ADP se encuentran resumidos en la Tabla 3.

 

 

 

 

Discusión

La administración de ticlopidina produce una inhibición dosis-dependiente de la agregación plaquetaria, con un efecto máximo a los 3-5 días de tratamiento ¹². De acuerdo con estos datos, para nuestro estudio se eligió un tratamiento de 4 días con la dosis terapéutica recomendada habitualmente (500 mg/day).

En las condiciones experimentales de este trabajo, la ticlopidina in vivo inhibió significativamente las respuestas tempranas de movilización de Ca2+ inducidas por la trombina y el ADP ex vivo, y la más tardía expresión de CD62P inducida por el ADP y la más baja concentración de trombina (0.05 U/mL). Estos resultados son consistentes con el efecto inhibidor de la ticlopidina sobre la transducción de la señal de activación, recientemente descrito utilizando un anticuerpo específico contra la forma fosforilada del marcador intracelular de activación plaquetaria VASP (Vaso-Dilator Specific Protein), en un estudio sobre plaquetas de sangre entera fijadas y permeabilizadas (Schwarz UR, Geiger J, Walter U, Eigenthaler M. Flow cytometric analysis of intracellular VASP phosphorylation for the assessment of activating and inhibitory signal transduction pathways in human platelets. Definition and detection of ticlopidine/clopidogrel effects. Thromb Haemost 1999; 82: 1145-1152.). Nuestros datos confirman la utilidad de la cinética de movilización de Ca2+ como parámetro citométrico apropiado para el estudio de la interferencia de fármacos con los mecanismos de transducción de señales en la plaqueta. Además, el diseño experimental de este ensayo en sangre entera, sencillo y rápido, permite evaluar la función plaquetaria en condiciones cuasi-fisiológicas, que reflejan mejor los efectos in vivo de un determinado tratamiento farmacológico.

Los datos de nuestro estudio discrepan aparentemente de los obtenidos en publicaciones previas que muestran que la elevación de los niveles de Ca²⁺ inducida por ADP u otros agonistas no parece afectarse por el tratamiento con ticlopidina ^{13, 14}. Hay que destacar que esos resultados se alcanzaron con preparaciones de plaquetas purificadas, es decir, tras un grado significativo de manipulación, mientras que en nuestro caso, la movilización de Ca²⁺ fue estudiada directamente en sangre entera en condiciones mucho más cercanas a las fisiológicas. Con nuestro procedimiento, además, es posible considerar los posibles efectos de los eritrocitos y otras células sanguíneas presentes en las muestras analizadas. Por ejemplo, los eritrocitos son la fuente principal de ADP plasmático y el ADP liberado desde ellos puede contribuir a las respuestas observadas, antes y después del tratamiento con ticlopidina.

La ticlopidina es eficaz, sobre todo, como inhibidor de las respuestas al ADP, al bloquear la agregación plaqquetaria y la secreción , tanto de los gránulos α como de los gránulos densos. Por otra parte, la ticlopidina inhibe en cierto grado la respuesta de las plaquetas a otros agonistas, como los análogos de tromboxano A2, el factor activador de plaquetas, el colágeno y las concentraciones bajas de trombina, probablemente a través de una reducción de la contribución del ADP liberado de los gránulos densos ^{15, 16}.

Entre sus efectos demostrados en plaquetas, el ADP antagoniza el aumento de los niveles intracelulares de AMPc inducidos por los análogos de la prostaciclina ¹⁷. Datos recientes de la literatura sugieren que la ticlopidina inhibe el receptor de ADP de tipo P2T_AC, el cual media la inhibición de la adenilato ciclasa por este agonista ¹⁸. También hay pruebas que sugieren que la ticlopidina no interacciona ni con el receptor de tipo P2Y1, responsable de la entrada rápida de Ca²⁺, ni con el de tipo P2X1, responsable de la activación de la fosfolipasa C y, consiguientemente, de la movilización de Ca²⁺ desde sus depósitos intracelulares ¹⁰.

De acuerdo con la acción de la ticlopidina sobre los receptores de ADP, la inhibición de las respuestas de Ca²⁺ observadas en este trabajo podrían explicarse por un aumento de AMPc tras el tratamiento con este antagonista plaquetario. El AMPc inhibe la movilización de Ca²⁺ desde los reservorios intracelulares en parte debido a la inhibición de la generación de inositol-5-trifosfato (IP3) ¹⁷ y a la inhibición ade la acción del IP3 por fosforilación de su receptor ²⁰. Por otra parte, el AMPc activa las Ca²⁺-ATPasas de tipo SERCA (Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca²⁺-ATPases), que transportan Ca²⁺ al sistema tubular denso, y a las bombas que transportan Ca²⁺ al exterior de la célula ^{21, 22}. Ambos efectos contribuirían a reducir la amplitud de la acumulación transitoria de Ca²⁺ libre citosólico, observada tras la administración de ticlopidina.

El análisis de la expresión de CD62P en la superficie de las plaquetas permite estudiar el proceso de secreción, un evento tardío en la activación plaquetaria. Consistente con datos recientes de la literatura ²³, la expresión de CD62P se redujo fuertemente tras la administración de ticlopidina, especialmente cuando el ADP era el agonista estimulante. Aunque esta disminución podría explicarse por la pérdida de la amplificación de la señal mediada por el ADP liberado de los gránulos densos, nuestros resultados sugieren que la inhibición de la secreción de ADP podría deberse en parte a la menor amplitud del aumento transitorio de Ca²⁺ , ya que este proceso es dependiente de este segundo mensajero.

Otro resultado relevante del estudio es la variabilidad interindividual de las respuestas observadas tras la administración de ticlopidina. Aunque se detectó de forma consistente una disminución en las respuestas de activación plaquetaria en todos los individuos analizados, el grado de inhibición presentó considerables diferencias entre ellos. Esta observación sugiere la necesidad de monitorizar individualmente la eficacia de la terapia antiplaquetaria, para facilitar la identificación de sujetos sensibles o resistentes a un determinado tratamiento, para definir mejor la dosis terapéutica del agente antiplaquetario y, en caso necesario, proponer tratamientos alternativos de prevención para los malos respondedores. En este contexto, los métodos aplicados en el presente estudio proporcionan una estrategia adecuada y sensible para el estudio ex vivo de marcadores bioquímicos tempranos y tardíos de la activación de plaquetas, así como una herramienta analítica para el desarrollo de ensayos analíticos específicos, en consonancia con el mecanismo de acción del fármaco de interés.

Agradecimientos

El presente estudio ha sido financiado en parte por una ayuda del Ministério de Educação de Portugal (PRODEP 5.2 1/96) y por un Convenio de IZASA, S.A. con la Universitat de València.

 

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